抗hAPE1蛋白的抗體及其制備方法與應用該抗體的試劑盒的制作方法

專利名稱：：抗hAPE1蛋白的抗體及其制備方法與應用該抗體的試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學
技術領域：
，具體涉及一種人脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶(hAPEl蛋白)的抗體及其制備方法以及應用該抗體的ELISA試劑盒。
背景技術：
：近年來，隨著醫學技術的飛速發展，腫瘤標志物的檢測已成為腫瘤臨床診斷的常規手段之一，其原理是4企測肺瘤患者肺瘤細胞特異表達的異常蛋白質或表達增高的蛋白質，從而為腫瘤的診斷和療效評估提供參照，達到早期發現、早期診斷和早期治療的目的。人脫口票呤脫嘧咬核酸內切酶(humanApurinic/apyrimidinicendonuclease/redoxeffectorfactor,hAPEl)是DNA堿基切除修復(baseexcisionrepair,BER)途徑的關鍵限速酶，是一種多功能蛋白質。hAPEl蛋白是迄今發現的生物大分子中最具結構和功能特點的一個典范其一級結構含有318個氨基酸，分子量35423Da,空間結構呈四層的a/P三明治型，主要由N端和C端兩個有所重疊的功能域構成，N端是一個不規則的柔性結構區域，為氧化還原調控區；C端是一個致密的球形核酸酶結構域，為DNA修復內切酶活性區。正是這種雙重結構使hAPEl具有多種生物功能它能夠與OGGl、XRCC1、PCNA、FEN1以及多聚酶P等蛋白質相互作用，同時激活BER通路中的長、短通路，修復烷化和氧化引起的DNA損傷；能夠發揮3'-磷酸二酯酶和3'-5'核酸外切酶活性，分別在修復輻射引起的DNA損傷和切除DNA脫氧4核糖核苦類似物中發揮重要作用；同時，hAPEl還具有氧化還原功能，可通過氧化還原機制調節多種轉錄因子的DNA結合活性及下游靶基因表達，參與氧化應激、細胞周期調控及凋亡等多種關鍵的細胞反應。受控的轉錄因子包括與細胞增殖、分化、轉化和凋亡相關的重要因子如NF-kB,AP-l,Egr-l,p53,PEBP2，Myb,HIF-1cc及Pax5、8等，這些轉錄因子與肺瘤的生成、發展以及放化療抵抗密切相關。機體各器官組織中均有hAPEl蛋白的表達，而國內外的研究均表明，肺瘤組織中的hAPEl定位和表達與相應的正常組織有顯著差異。此外，通過檢測肺瘤組織中hAPEl及相關因子的表達，發現其表達水平與肺瘤放化療抵抗密切相關。因此，hAPEl的表達水平和/或類型可能作為篩選某些腫瘤的輔助手段，hAPEl有望成為肺瘤早期診斷中一項敏感而特異的指標。1999年，Dianova等人制備純化了hAPEl多克隆抗體并應用于細胞實驗，但其來源于免疫動物的血清，可識別多個抗原表位，因此特異性較低，且存在種屬交叉反應的問題。單克隆抗體是針對某一抗原表位的特異性抗體，純度高，特異性強。然而目前大多數hAPEl的單克隆抗體的抗原表位未知，個別單克隆抗體雖表位已知，但抗體來源于合成的多肽，其表位為線性表位，而非構象型表位。#元原表4立(epitope)也考爾為l元原決定蔟(antigenicdeterminant,AD)，是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，是抗原分子表面的一小部分，其大小相當于相應抗體的結合部位，由57個氨基酸、單糖或核苦酸所組成。抗原表位可分為連續性抗原表位(又稱線性表位，見于T細胞表位和部分B細胞表位)和不連續抗原表位(又稱構象型抗原表位，只見于B細胞抗原表位)。每一個抗原表位的性質和空間構型決定著一種特異性，是使免疫應答和免疫反應具有特異性的物質基礎，與生物機體免疫調節網絡密切相關。近來的研究發現，抗原的線性表位在體液免疫中有重要的作用，而構象型表位則與某些免疫應答發生改變或疾病狀態有關。因此，尋找針對天然hAPEl蛋白的構象型表位的抗體對檢測疾病狀態下如腫瘤的hAPEl蛋白具有極其重要的意義。目前國內外對hAPEl檢測的研究方法大都為免疫印跡和免疫組化法，這兩種均需取組織樣品進行hAPEl一全測，操作步驟繁瑣，處理時間長，成本高，效率低。發明人于前期研究中發現，腫瘤患者和已行放、化療的腫瘤患者其血清中hAPEl蛋白表達顯著增高，因此，對hAPEl進行血清學檢測有助于肺瘤的早期臨床診斷，并有效判斷肺瘤細胞放療和化療的每丈感性。
發明內容本發明的一個目的是提供一種抗體，其與脫噤呤脫嘧啶核酸內切酶hAPEl蛋白76-90位(其氨基酸序列如SEQIDNo.l所示)和109-123位(其氨基S吏序列如SEQIDNo.2所示)構成的構象型表位特異性結合。本發明所述"抗體"應該解釋為涵蓋具有所需特異性的結合結構域的任意特異性結合因子。因而，這個術語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結合結構域的任何多肽，無論是天然的還是合成產生的。抗體的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以是包含抗原結合結構域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd;和雙鏈抗體(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原結合結構域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在EP.A-0120694和EP.A.0125023中描述。抗體末端可以引入藥物、毒素、細胞因子、方文射性核素、熒光素、生物素和酶、半胱氨酸尾、酪蛋白激酶底物尾、E尾等結構，有助于標記和偶聯其它分子，也可以引入鈣調蛋白尾、c-myc尾、葡萄球菌A蛋白尾、脂類標簽、組氨酸尾等，使表達產物易于檢測和純化。抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術來產生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區或互補性決定區(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區或恒定區加框架區。參見，EP.A.184187,GB2188638A或ERA.239400。還可以對雜交瘤細胞或產生抗體的其它細胞進4亍遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產生抗體的結合特異性。本發明所述抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、合成抗體、抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體及其化學修飾衍生物，在具體實施方式中，優選單克隆抗體。本發明所述還可以為人源化抗體。本發明所述抗體的亞型包括IgG、IgE、IgM、IgD和IgA,在具體實施方式中，本發明才是供的單克隆抗體亞型為IgG，其亞類為IgG2b。在具體實施方式中，本發明提供的一種人的脫噤呤脫嘧咬核酸內切酶hAPEl的單克隆抗體，由保藏在中閨典型培養物保藏中心、保藏編號為CCTCC:C200852、分類命名為雜交瘤細胞株DPCC2-G1的雜交瘤細胞林產生，保藏單位地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學，保藏日期為2008年11月3日。本發明所述抗體可用于^r測hAPEl蛋白在正常及腫瘤細胞內分布，例如通過ELISA、WesternBlot、免疫組織化學對細胞及組織中hAPEl蛋白表達的定量檢測；用細胞組織化學、細胞熒光化學檢測hAPEl蛋白在細胞中的定位情況；用免疫組織化學法檢測單克隆抗體相應抗原在腫瘤和正常組織中的表達和分布情況。本發明的另外一個目的是提供上述單克隆抗體的制備方法用氨基酸序列如SEQIDNo.5所示的hAPEl融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出能夠分泌與hAPEl特異性結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞注射動物腹腔，對產生的腹水分離純化獲得所述抗體。在本發明的具體實施方式中，用hAPEl融合蛋白免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0以PEG4000介導融合，HAT選捧性培養，間接ELISA法篩選，有限稀釋法克隆化。將100%對hAPE1融合蛋白陽性、pET28a菌體蛋白和Eppin-His融合蛋白陰性的雜交瘤細胞定抹凍存；將定林的雜交瘤細胞注射到經石蠟油預處理的BALB/C小鼠腹腔，產生腹水。腹水用ProteinG柱親和純化，獲得純化的單克隆抗體。該單克隆抗體的結合常數Ka為1.8xl(T7,效價大于1:107。本發明所述抗體可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發明所述的DNA序列可用本領域技術人員熟知的常規手段，如根據本發明公開的抗體，進行氨基酸序列分析，進行人工合成或用PCR法擴增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體中。最后，在適合本發明抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞，然后本領域技術人員應用熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的單克隆抗體。本發明還提供制備上述抗體的雜交瘤，所述雜交瘤保藏在中國典型培養物保藏中心、保藏編號為CCTCC:C200852。本發明的再一個目的是提供產生上述抗體的hAPEl融合蛋白，所述hAPEl融合蛋白C端含有10xHisTag,具有人APE1蛋白的生物活性，其氨基酸序列由SEQIDNo.5所示，適于用親和層析純化技術純8化APE1抗體。本發明中所述hAPEl融合蛋白以可溶性為主，產量高，純化條件十分筒單，因此具有快速、經濟、方便的特點。引入的10xHisTag是為親和純化所設計，能增加His柱對hAPEl融合蛋白的親和力，更有利于非特異性蛋白的洗脫。此外，引入的10xHisTag能夠明顯增加hAPEl純化蛋白在體外的穩定性。本發明所述hAPE1融合蛋白克服了基因重組獲得的融合蛋白多不具有生物學功能的缺陷，不僅具有抗原性，還具有氧化還原、修復和抗原性多重功能，因此應用前景廣泛。在本發明的具體實施方式中，上述hAPEl融合蛋白的具體制備方法為1)以pcDNA3.1-APEl質粒為才莫氺反，分別引入NcoI、BamHI酶切位點粘端，并在下游引入10xHisTag，行PCR反應，得到重組hAPEl基因；2)將重組hAPEl基因與載體pET28a質粒行NcoI和BamHI雙酶后連接，用卡鈉霉素平板篩選陽性克隆，得到pET28a-hAPEl質粒。3)將pET28a-hAPEl質粒轉化入BL21中，挑菌至LB培養基培養，IPTG誘導4h,離心收集菌體，凍溶后超聲破菌，過濾，按Pharmacia公司提供的His親和柱純化得到hAPEl融合蛋白。本發明還提供一種診斷組合物，包括權利要求1-6任一項所述抗體，和可任選的免疫診斷方法中常規使用的合適試劑。本發明所述診斷組合物可用于肺瘤的臨床診斷及判斷肺瘤細胞放療和化療的敏感性。本發明的又一個目的是提供一種能快速、準確檢測人血清中hAPEl含量的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括本發明所述抗體。本發9明所述ELISA試劑盒可以是是雙抗體夾心ELISA試劑盒。在本發明的具體實施方式中，本發明提供的雙抗體夾心ELISA試劑盒包括本發明所述單克隆抗體、本發明所述hAPEl融合蛋白以及另一種hAPEl抗體。本發明所述ELISA試劑盒可用于肺瘤的臨床診斷及判斷腫瘤細胞放療和化療的敏感性，具有更高的靈敏性，同時兼顧了特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等優勢，不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以一全查幾百甚至上千份標本，也適合于血清流行病學調查。因此，本發明所述hAPEl融合蛋白、hAPEl蛋白的抗體、診斷組合物、ELISA試劑盒具有廣泛的應用前景及實用價^直。圖1表示瓊脂糖電泳檢測hAPEl重組基因PCR電泳結果，泳道1為DNA分子量標準；泳道2為hAPEl重組基因PCR擴增產物；泳道3為陰性對照。圖2表示瓊脂糖電泳檢測pET28a-hAPEl重組載體雙酶切結果，泳道1為DNA分子量標準；泳道2為pET28a-hAPEl經NcoI、BamHI雙酶切；泳道3為pET28a-hAPEl。圖3表示SDS-PAGE電泳才企測hAPEl融合蛋白在大腸桿菌BL21中的誘導表達及可溶性鑒定結果，泳道l為低分子量蛋白標準；泳道2為pET28a-hAPEl未謙導；泳道3為IPTG誘導pET28a-hAPEl4h后；泳道4為IPTG誘導pET28a-hAPEl4h破菌后上清；泳道5為IPTG誘導pET28a-hAPEl4h石皮菌后沉淀。圖4表示hAPEl融合蛋白的純化結果，泳道1為低分子量蛋白標準'，泳道2為上樣穿透液；泳道3為30mM。米峻洗脫液；泳道4為200mM咪唑洗脫液。圖5表示Westernblot檢測hAPEl融合蛋白純化結果，A圖中一抗為抗人APE1單克隆抗體(Novuse):1為純化后的hAPEl蛋白；2為HaLa細胞核蛋白；B圖中抗體為HRP-His抗體(Pierce):1為低分子量蛋白標準；2為純化后的hAPEl蛋白；3為HaLa細胞核蛋白；4為Eppin-His融合蛋白(含6xHisTag)。圖6表示hAPEl融合蛋白氧化還原活性檢測結果1為正常HaLa細胞核蛋白；2為感染Ad5/F35-siAPEl的HaLa細胞核蛋白；3為正常HaLa細胞核蛋白加入hAPEl融合蛋白后；4為感染Ad5/F35-siAPEl的HaLa細胞核蛋白中加入hAPEl融合蛋白后。圖7表示hAPEl融合蛋白AP修復活性檢測結果1為BSA陰性只十照；2為0.2|agAPE1融合蛋白；3為2ngAPE1融合蛋白；4為HaLa細胞核蛋白陽性對照。圖8表示SDS-PAGE電泳檢測DPCC2-G1單克隆抗體腹水IgG純化結果，泳道1為蛋白標準；泳道2為2-G1純化前；泳道3為2-G1純化穿透液；泳道4為2-G1純化后。圖9表示Westernblot檢測DPCC2-G1單克隆抗體特異性的結果，1為hAPEl融合蛋白；2為HOS細月包蛋白；3為pET28a空載體i秀導蛋白；4為Eppin-His融合蛋白。圖10表示DPCC2-Gl雜交瘤細胞染色體鑒定結果。圖11表示抗體表位分析結果左上圖為hAPEl蛋白的空間結構示意圖紅色曲線表示cx螺旋結構，綠色箭頭曲線表示(3片層結構；其余三圖為抗原構象型表位在hAPEl蛋白上的定位紅色球體代表氧紅色曲線表示cc螺旋結構，綠色箭頭曲線表示P片層結構，紅色球體代表氧原子，白色球體代表碳原子，藍色球體代表氮原子。圖12表示激光共聚焦檢測細胞中APE1定位和表達A為熒光標記的線粒體；B為TOPRO-3探針標記的核；C為細胞中APE1蛋白的定位；D為ABC圖《象重組后。圖13表示免疫細胞化學檢測細胞中APE1定位和表達A圖為DPCC2-G1單克隆抗體(1:100)檢測結果；B圖為小鼠抗人APE1(1:100,購自美國Novus)。圖14表示免疫組織化學檢測組織中APE1定位和表達A為乳腺癌組織；B:肺&泉癌組織；C:腎癌組織；D:前列&泉癌組織。圖15表示雙抗體夾心ELISA檢測APE1蛋白的標準曲線，橫坐標為標準品濃度的常用對數，縱坐標為相應OD450值。具體實施例方式為了有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，下文特舉較佳實施例并配合附圖詳細說明。材料與方法HOS細胞、HaLa細胞、大腸桿菌E.coliDH5cc和BL21(DE3)感受態細胞和pET28a載體均為本領域常規生物材料，真核表達載體pcDNA3.1-APEl(構建方法參見2006年第三軍醫大學呼吸內科學譚永紅博士的博士論文《放射性肺損傷關鍵靶細胞電離輻射效應及其調控研究》)和重組腺病毒Ad5/F35-siAPEl(構建方法參見XiangDBetal.CancerGeneTherapy.2008;15(10):625-35)由本室保存；DMEM培養基、小牛血清、聚乙二醇(PEG4000)購自Gibco公司；限制性內切酶NcoI和BamHI、PrimerstarDNA聚合酶、T4DNA連沖妻酶購自Promega^^司；ECL檢測試劑盒、HRP標記羊抗小鼠IgG抗體、HRP標記-羊抗兔IgG抗體、HRP標記His抗體、電泳遷移率變動分析實驗LightShift試劑盒、DAB顯色劑購自Pierce公司；尿嘧咬糖基化酶(UDG)購自美國NEB公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Geneaid/^司產品；完全與非完全弗氏佐劑、鼠抗體亞類鑒定試劑盒購自Sigma/>司；小鼠抗人APE1單克隆抗體購自NovusBiologicals公司；引物及測序由上海英駿生物工程公司合成；APE1-15肽陣列(CelluSpotsTMPeptideArrays)為德國INTAVISAG公司產品；His一主HiTrapchelatingHP、ProteinG、ProteinA親和色i普牙主購自Pharmacia公司，純化設備由重慶富進生物醫藥有限公司提供。實施例1pET28a-hAPEl原核表達載體構建和鑒定應用PrimerPremer5.0i更計軟件確定引物，兩端分別引入Ncol、BamHI酶切位點粘端，并在下游引入10xHisTag，上游引物核苷酸序列如SEQID.No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQID.No.4所示，以pcDNA3.1-APEl質粒為模板進行PCR反應。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化。分別將PCR膠回收產物及載體pET28a質粒用限制性內切酶NcoI和BamHI雙酶切，在T4DNA連接酶作用下16°C連接過夜，轉化入大腸桿菌E.coliDH5oc中，卡鈉霉素平板篩選，挑取陽性克隆擴增，提取質粒DNA,酶切和測序鑒定正確。PCR產物經1%瓊脂糖凝月交電泳，結果如圖l所示，可見1007bp左右的片段，與預期大小相符。pET28a-hAPEl載體經Nco1、BamHI雙酶切后，得到兩條約為1000bp和6000bp的片段，與預期的結果相符(如圖2所示)，測序結果表明插入的hAPEl在GeneBank中登錄的石咸基序列完全一致，無突變，表明原核表達載體構建成功。hAPEl融合蛋白的氨基酸序列如SEQID.No.5所示。另外，經比對編碼該融合蛋白的核苷酸序列與現已報道的其它編碼重組的hAPEl核苦酸序列均不完全一致。實施例2hAPEl融合蛋白的表達、純化與鑒定1.hAPEl融合蛋白的誘導表達將pET28a-hAPEl質粒和空載體pET28a轉化入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，分別挑取克隆接種在含卡那霉素(50mg/L)的LB培養液中，37。C培養過夜，按1:100轉接后，37°C培養至OD600為0.6-0.8時，f又誘導前的菌液lml作為對照，余下菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,繼續培養4h后離心收集沉淀，行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色。2.hAPEl融合蛋白的可溶性鑒定取誘導4h的菌液離心后棄上清，加入裂菌液(含0.1mg/L溶菌酶，5mmol/LEDTA)重懸，冰浴下超聲石皮菌，分離上清和沉淀，將沉淀用8mol/L尿素重懸后與上清分別制樣。行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，鑒定融合蛋白的表達形式。經IPTG誘導表達后，取細菌懸液進行12%SDS-PAGE鑒定，結果如圖3所示，在相對分子質量約37x103處有目的蛋白條帶，且主要以可;容性表達為主。3.hAPEl融合蛋白的純化按上述條件大量搖菌誘導融合蛋白表達，收集菌液離心，收集沉淀，-20。C凍存過夜。次日融化沉淀，用上樣緩沖液(20mmol/LPBS,pH9.0)14重懸，冰浴下超聲破菌，離心收集上清，過濾后用上樣緩沖液平衡His柱后，取待純化的樣品上樣，用上樣緩沖液流洗至基線，再分別用30mmol/L和200mmol/L咪唑洗脫，收集蛋白峰。將純化后的蛋白行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色后分析結果如圖4所示。4.hAPEl融合蛋白的鑒定細胞培養HaLa或HOS細胞用含10%小牛血清的DMEM培養基37°C、5%C02條件下培養傳代。Ad5/F35-siAPEl以4MOI感染HaLa細胞2h后換液，繼續正常培養48h后收集細胞提取核蛋白。提取細胞核蛋白0.25%胰酶消化HaLa細胞或HOS細胞，收集lxl07細胞，離心收集沉淀，以PBS洗滌，以500^1預冷4氐滲緩沖液A(10mMHEPES，10mMKC1,0.1mMMgCl2,0.1mMEDTA,O.lmMDTT,5mMPMSF,pH7.9)重懸，冰浴10min;離心收集沉淀，以500(^1預冷緩沖液B(10mMHEPES,100mMNaCl,1.5mMMgCl2,O.lmMEDTA,O.lmMDTT,5mMPMSF,pH7.9)重懸，冰浴20min,離心取上清測定蛋白濃度后于-70°C保存。將純化的蛋白溶液4°C透析過夜，取樣行12%SDS-PAGE電泳，分A、B兩組電轉移到PVDF膜上，A組以HaLa細胞提取核蛋白為陽性對照，B組用帶6xHisTag的Eppin-His融合蛋白為陽性對照，HaLa細胞核蛋白為陰性對照。用1%的BSA37。C封閉2h,A組一抗用小鼠抗人APEl單抗1:20000稀釋4°C孵育過夜，二抗用HRP標記的羊抗小鼠IgG單抗1:4000稀釋37°C孵育40min;B組用HRP標記的His抗體1:4000稀釋37°C孵育lh，采用發光蛋白免疫印跡法對兩組進行顯影分析。結果如圖5所示，經hAPEl抗體和His抗體孵育的融合蛋白在相對分子質量37x103處出現特異性反應條帶，表明該重組蛋白具有良好的免疫反應性。研究發現，連接其他Tag的hAPEl融合蛋白在體外的活性極其不穩定，易降解，而引入10xHisTag后使得人APEl蛋白在體外的穩定性增加，4。C保存一周后，用ELISA法檢測，其00450值無差別。5.hAPEl融合蛋白活性分析提取細胞核蛋白HaLa細胞用含10%小牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100jug/ml)的DMEM培養基，37。C、5%C02條件下培養，每3d傳代1次。Ad5/F35-siAPEl以4MOI感染HaLa細胞2h后換液，繼續正常培養48h后收集細胞提取核蛋白。hAPEl融合蛋白氧化還原活性檢測采用電泳遷移率變動分析實驗EMSA參照文獻(ZhangL,etal.ProcNatlAcadSciUSA,1998，95(16):9184-9489),人工合成NF-kB探針序列如下P1:5'-AGCTTAGAGGGGACTTTCCGAGAGGA-3，(核苷酸序列如SEQIDNo:6所示)，P2:5'-TCCTCTCGGAAAGTCCCCTCTAAGCT-3'(核苦酸序列如SEQIDNo:7所示)，其中包含NF-kB轉錄因子的識別序列，其3，端以生物素標記，退火形成雙鏈，按照LightShift試劑盒說明書進行。結合反應體系(20jul)為lx結合緩沖液，2.5%甘油，5mMMgCl2,0.050/。NP-40,50ng/ialpoly(dl.dC)，2jug純化hAPEl蛋白，以正常HaLa細胞的核蛋白(4ng)及感染Ad5/F35-siAPEl的HaLa細月包核蛋白(4|ag)為對照，室溫保溫20min后，加探針lpmol,室溫反應30min。反應完畢后，將混合物進行7.5%PAGE恒壓100V電泳，以380mA恒流電轉移至尼龍膜上，紫外線照射交耳關lOmin,封閉液37°C封閉20min,HRP偶聯的親和素(1:500)37°C孵育20min，洗滌液洗滌416次，室溫平衡15min后用ECL檢測試劑盒檢測。結果顯示如圖6所示，正常HaLa細胞核蛋白可與NF-KB探針結合，當加入hAPEl融合蛋白后，與NF-kb探針的結合明顯增加；當感染重組腺病毒Ad5/F35-siAPE1后，與NF-kB探針的結合明顯減少；而當感染Ad5/F35-siAPEl后再加入hAPEl融合蛋白，與NF-kB探針的結合又顯著增多。說明hAPEl可以增加HaLa細胞核蛋白與NF-kB轉錄因子序列的結合，具有氧化還原活性。hAPE1融合蛋白AP修復活性檢測參照文獻(WongHK,etal.NucleicAcidsResearch,2007,35(12):4103~4113)設計才莫擬AP位點的42mer寡核苷酸正義《連和反義鏈，序列為正義鏈22-U:-3',(核苷酸序列如SEQIDNo:8所示)反義《連22-C:-5'，(核苷酸序列如SEQIDNo:9所示)其中U代表尿嘧口定，22-U的5，端標記生物素，退火形成雙4連。22-U中含有的尿嘧啶在尿嘧咬糖基化酶(UDG)作用下可形成一個AP位點，使雙鏈探針能夠被APE1識別并將其切開為22mer的反應產物。APE1蛋白結合反應(20ial)體系為10mMHEPES(pH7.4),lOOmMKCl,不同量的純4匕hAPEl蛋白(0.2|ag-2jng),以4jagHaLa細胞核蛋白做陽性對照，2jugBSA蛋白做陰性對照，探針2pmo1,37°C反應30min。加甲酰胺終止反應，并將混合物進行10%PAGE(含7M尿素)電泳，電壓150V50min，電轉至尼龍膜30min,紫外交耳關后檢測步驟同EMSA。結果如圖7所示，hAPE1融合蛋白可以參與反應切下22mer的產物，并且隨著加入的蛋白量的增加，切下的產物量明顯增加。提示，hAPE1融合蛋白具有AP修復活性。實施例3hAPEl融合蛋白在抗體親和層析純化中的應用稱取0.5g填料裝入純化柱，用10-15倍柱體積的A緩沖液(1mMHC1)在0-4。C預冷條件下活化填料；用B緩沖液(0.1MNaHC03,0.5MNaCl，pH8.3)按0.5:1(緩沖液蛋白)稀釋hAPEl融合蛋白后，加入到活化好的填料中，在4。C條件下，每30min流盡液體，再循環加入到純化柱中6-8次，使充分橋耳關；用5倍柱體積的B液沖洗填料，洗去未結合的樣品；用C緩沖液(0.1MTris-HCl，pH8.0)平4軒2h;再用3倍柱體積的DH沖液(0.1M醋酸，0.5MNaCl，pH3~4)和E緩沖液(0.1MTris-HCl,0.5MNaClpH8.0)交替洗滌柱子，各約2~3次，滅活填料；將待純化的APE1單克隆抗體或多克隆抗體上樣，37。C緩慢搖動4h,使抗體充分橋聯；用B液沖洗柱子3次，洗去未結合的抗體和雜蛋白；用5mlO.IM甘氨酸(pH2.7)洗脫柱子；將洗脫液立即滴入pH9.0的1MTris-HCl中，使緩沖體系迅速被中和，避免強酸條件下抗體解聚，即得到特異性親和純化的APE1單克隆抗體或多克隆抗體。該純化的APE1抗體專交普通的ProteinA或ProteinG親和柱純化的抗體具有更高的特異性和純度。實施例4hAPEl單克隆抗體的制備1.動物免疫以實施例2所得純化的hAPEl融合蛋白，免疫5只6~8周齡17g22g的雌性健康BALB/C小鼠。免疫方法首次免疫^f吏用抗原與完全弗氏佐劑充分乳化后四肢皮下及腹腔注射，60ug/只；4周后第260ug/只；14d后第3次免疫腹腔注射不加佐劑抗原60ug/只,7d后剪尾采血，以hAPEl融合蛋白作檢測原，間接ELISA法檢測小鼠血清抗體效價；以后每間隔14d腹腔注射一次抗原60ug/只，選擇ELISA血清抗體效價達1:106以上的BALB/c小鼠用于融合；融合前3d腹腔注射抗原1次加強免疫，劑量60ug/只。2.小鼠脾細胞的制備摘除小鼠眼球放血，血清留作陽性對照。按無菌操作取出脾臟，并將脾臟放在預溫不完全培養基中，剝去周圍結締組織，置100目不銹鋼網中，用注射器的內芯研磨。收集過濾后的細胞懸液于離心管中，計數，取lxl()8個細胞，1000rpm離心5min，棄上清，置室溫待用。3.骨髓瘤細胞的準備融合前2周，復蘇凍存的骨髓瘤細胞(SP2/0),用含8-AG的1640完全培養基于37°C,5%032培養。融合前2d3d，改用不含8-AG的1640完全培養基繼續培養。取對數生長期細胞約lxl(^2xl(^個細胞，1000轉/min離心5min,棄上清，置室溫待用。4.祠養細胞的準備融前一天，耳又610周齡健康BALB/C小鼠，斷頸法處死，浸泡在75%酒精內，消毒35min。用無菌剪刀剪開皮膚，充分暴露腹膜，用無菌注射器注入預冷的10ml無血清培養液。反復沖洗，更換剪刀剪開腹膜，吸出沖洗液。放入10ml離心管，1200rpm離心10min，用完全培養液重懸，計數調整細胞數2xl05/ml。分鋪在96空細胞培養i中，100nl/孔，37°C,5。/。C02培養備用。5.細力包融合19融前一天將PEG4000置37。C,5。/。C02細胞培養箱中調整pH值和溫度。將骨髓瘤細胞懸液和脾臟B淋巴細胞懸液按1:10混合，1000rpm,離心10min,棄去上清。輕輕彈擊管底，使細胞團松散成糊狀。在60s內緩慢加入0.8ml預溫的PEG4000,邊加邊轉動離心管，靜置90s后，立即在5min內加入10ml不完全培養基，具體加法是第lmin力口lml、第2min力口lml、第3min力口1.5ml、第4min力口1.5ml、第5min加完，最后補至30ml。將離心管在37。C培養箱中靜止5min后取出，800rpm離心6min,棄上清，加入40ml完全培養液和1xHAT，輕柔重懸，鋪入8個96孔板細胞培養皿中，100jul/孑L，置37°C,5%C02的細胞培養箱中培養10d~14d。注意小心開關細胞養箱門，盡量避免振動。6.雜交瘤細胞克隆化融合后第5d補液，50lal/孑L;融合后第10d~14d時，用間接ELISA法檢測各培養孔的上清，以hAPEl融合蛋白、pET28a空載體誘導的菌體蛋白、含HisTag的Eppin蛋白為檢測抗原，選擇hAPEl融合蛋白強陽性、pET28a菌體蛋白和Eppin蛋白陰性的單克隆細胞，用有限稀釋法轉種于96孔細胞培養板，在培養箱中培養10d~14d后，再取上清按上述方法檢測，將強陽性孔再進行克隆化培養，直至達到100%克隆均為hAPEl融合蛋白陽性、pET28a菌體蛋白和Eppin蛋白陰性，即雜交瘤細胞只分泌hAPEl特異性抗體，而對HisTag和雜蛋白無抗性。將強陽性孔的單克隆細胞定株，大量培養，凍存。結果經4次細胞融合、間接ELISA篩選并克隆化后，獲得l抹穩定分泌抗人APE1蛋白的雜交瘤克隆系，命名為DPCC2-G1，其已保藏在武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC:C200852。實施例5單克隆抗體的腹水制備和純化1.單克隆抗體的腹水制備選擇2022g健康雌性BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油0.5ml/只預處理，飼養7d后，每只小鼠腹腔注射0.5xl06~lxl06個定抹的雜交瘤細胞；飼養7d10d后，小鼠腹部明顯膨隆，收集腹水，4。C離心15min,分離收集中段的澄清腹水液。2.單克隆抗體的純化用45|um濾紙過濾腹水液。根據Ig亞類結果，選擇ProteinG親和層析純化抗體。用上樣緩沖液平衡ProteinG柱，上樣待純化的腹水液后，用上樣緩沖液再平tf,用洗脫i爰沖液洗脫ProteinG柱，收集洗脫液。將純化的抗體用10%SDS-PAGE檢驗純度，Lowry法測定抗體濃度。結果如圖8所示，顯示DPCC2-Gl單克隆抗體經ProteinG親和層沖斤純化，SDS-PAGE電泳鑒定純度均達95%以上。實施例6單克隆抗體的生物學鑒定1.Westernblot鑒定抗體的特異性WesternBlot檢測抗體特異性以hAPEl融合蛋白、HOS細胞提取APE1蛋白、pET28a空載體在大腸桿菌E.coliBL21中誘導后的菌液、帶6xHisTag的Eppin-His融合蛋白(Eppin-His融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNo.10所示)上樣進4亍12%SDS-PAGE電泳，電轉移到PVDF膜上，1%的BSA37。C封閉lh,用制備的單克隆抗體(l:2000)37°C孵育1.5h,HRP標記的羊抗小鼠IgG單抗(l:2000)37。C孵育lh,采用發光蛋白免疫印跡法對兩組進行顯影分析。結果顯示DPCC2-G1雜交瘤分泌的抗體能特異性與hAPEl融合蛋21白、HOS細胞中的APE1蛋白反應，而不與pET28a空載體誘導蛋白和帶HisTag的Eppin-His融合蛋白反應(見圖9),說明DPCC2-Gl雜交瘤分泌的單克隆抗體的特異性好。2.抗體亞類鑒定Ig亞類鑒定按照Sigma公司鼠抗體亞類鑒定試劑盒"l喿作說明進行，每個亞類做復孔驗證。結果DPCC2-Gl雜交瘤分泌的單克隆抗體亞類為IgG2b。3.抗體效價間接ELISA法檢測抗體效價將hAPEl融合蛋白按5嗎/ml4。C包被過夜，1%BSA37°C封閉lh，加入倍比稀釋的單克隆抗體，以骨髓瘤細胞SP2/0細胞的培養上清為陰性對照，37°C孵育lh,再加入HRP標記羊抗鼠IgG抗體(1:3000)37°C孵育40min,OPD顯色測定OD495腿值，以下列公式計算結果所對應的抗體稀釋倍數為單克隆抗體的效價M=(檢測孔OD值-空白孔OD值)/(陰性空OD值-空白孔OD值)>2結果如表l所示，根據公式計算，當DPCC2-G1單抗的稀釋倍數為l:107時，M>2,說明該單抗的效價>1:107。表l間接ELISA法檢測2-G1單克隆抗效價及其純化前后的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注陰性對照為骨髓瘤細胞SP2/0細胞的培養上清提前48~36小時將DPCC2-G1雜交瘤細胞傳代，加入秋水仙素(100ug/ml，除菌)，使終濃度為0.4ug/ml;繼續培養46h，收集細胞，1000r/min離心10min,棄上清；力口入37。C預溫的0.075mol/LKC1溶液5ml，重懸細胞并混勻，37。C水浴15~20min;入新配制的固定液(甲醇與冰醋酸3:l混合)lml，混勻，1000r/min離心10min,棄上清；加入固定液5ml，重懸細胞混勻，室溫靜置20~30min;1000r/min離心10min,棄上清；重復上述操作一次；加入5ml固定液，重懸細胞混勻，4。C過夜；次日1000r/min離心5min,輕輕吸去上清液，根據細胞壓積多少而留下0.5-lml固定液，重懸，吸取細胞懸液1~2滴，滴在剛從冰水中取出的載玻片上，用口吹散，在火焰上通過數次，使細胞平鋪于載玻片上，自然干燥；10%Giemsa染液染色10~20min,自來水洗去染液，自然干燥；鏡檢，選擇染色體分散好、無重疊、無失散的細胞進行觀察分析，每份標本應計數IOO個完整的中期核細胞，并注意觀察是否有標志染色體。結果如圖10所示，DPCC2-Gl雜交瘤細胞染色體為4倍體，大多數為端著絲點染色體，個別為中部著絲點染色體和亞中部著絲點染色體，符合小鼠脾細胞和骨髓瘤SP2/0細胞融合后的染色體特征。DPCC2-G1單克隆抗體雜交瘤細胞染色體數目約為96-92,平均94。5.單克隆抗體親和常數測定以hAPEl融合蛋白按5嗎/ml、2.5、1.25|ig/ml作為包被抗原，100pl/孔，4。C過夜，PBS洗滌3遍，拍干；封閉力口7%小牛血清封閉液100(al/孔，37。C2h,PBST洗斧反拍干；將抗體濃度4安2800ng/ml、1400ng/ml、700ng/ml、350ng/ml、180ng/ml、90ng/ml、45ng/ml、24ng/ml、12ng/ml、6ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0.5ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml稀釋，100pl/孔，37。Clh,PBST洗板拍干；加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG抗體工作液(l:3000稀釋)IOO)al/孔，37°C水浴40分鐘，PBST洗板拍干；加底物顯色液100|^1/孔，37。C避光反應10分鐘；加終止液立即在酶標4義上以492nm波長測定OD值；按照下列公式計算單克隆抗體親和常數<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>該公式中，n為平衡常數，為兩種抗原包被濃度比值倍數(本發明中比值為4);在曲線中，以每條曲線上段平臺段的OD值為100%,以下段平臺段OD值為0，[Ab]和[Ab']為兩條曲線中OD值為50%時所對應的抗體濃度，且[Ab]和[Ab']分別與[Ag]和[Ag，]相對應。々士更.nor1「，A六E^j44厶V、AA*U夂4孑/1目古玄AtS,w^口,1、.iv丄nl-vj丄75、^^/田>tw/ji_i'|z|、yvuj"T"乂Lil王kurf、^r,卜jr。ju力.i工和高親和力，親和常數Ka二1.8xl(T7。6.種屬交叉反應Westernblot;險測種屬交叉反應分別4是耳又兔、大鼠、小鼠的心、肝臟、肺組織蛋白，用Westernblot檢測DPCC2-G1單抗對兔、大鼠、小鼠的種屬交叉反應。結果顯示DPCC2-Gl雜交瘤分泌的抗體不能與兔、小鼠和大鼠的心、肝臟、肺組織蛋白反應，說明該抗體特異性好，且與兔、小鼠、大鼠無種屬交叉反應。7.表位分析制備APE1-15肽陣列根據hAPEl在GeneBank中登錄的氨基酸序列，將hAPEl第115、418、721...304318位氨基酸分別合成15短肽，與支持物(如纖維素)共價結合后以點陣的形式有序地固化于載玻片的表面。(德國INTAVISAG公司提供)。用1%脫脂奶4分37。C封閉APE1-15肽陣列4h，0.5%。TBST洗滌后，將DPCC2-G1單抗1:500稀釋，4。C孵育過夜，0.5%。TBST洗滌后，37。C孵育HRP標記羊抗鼠IgG抗體(1:3000)lh,0.5%。TBST洗滌，DAB顯色IOmin,蒸餾水沖洗終止反應。以棕黃色點為陽性點，根據陽性點所對應的氨基酸序列，并應用Molsoft.ICM-Pro.軟件分析表位。結果APE1-15肽陣列與DPCC2-Gl雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體反應后，可見兩個不相鄰的陽性點，對應為hAPEl天然蛋白氨基酸序列的76-90位(其氨基酸序列如SEQIDNo:l所示)和109-123位(其氨基酸序列如SEQIDNo:2所示)。s"pnTnxu1《asi^rTnxio筋爪^feT、主4擊frfiig壬乾:l^店志位是構象型表位。用三維立體結構觀察軟件Molsoft.ICM-Pro可以看到立體結構圖如圖11所示，該兩段序列的氨基酸殘基均位于蛋白表面。經比對未發現國外已有抗體中有相同表位的報道。實施例7單克隆抗體在^f企測細胞和組織中APE1定位和表達的應用1.免疫熒光染色取對數期生長的HOS細胞接種于六孔板內20mmx20mm蓋玻片上，每孔約lxl()S個細胞，繼續培養12h后取出有細胞貼壁的蓋玻片，用2%甲醛溶液室溫固定20min,0.5%TritonX-10037。C打孔20min,山羊血清工作液37。C封閉30min,滴加DPCC2-Gl單抗(1:100)4。C孵育過夜，以PBS替代一抗作為陰性對照；以異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗小鼠IgG為二抗(1:50)37。C孵育30min;以TOPRO-3探針25(1:100)作為細胞核探針37。C孵育5min。以緩沖甘油封片后在激光共聚焦顯^l鏡下觀察和掃描，結果如圖12所示，可見細胞核呈綠色熒光的陽性表達，說明DPCC2-G1單克隆抗體可特異性識別細胞核內的APE1蛋白。2.免疫細胞化學取對數期生長的HOS細胞接種于六孔板內20mmx20mm蓋玻片上，每孔約lxl()S個細胞，繼續培養12h后取出有細胞貼壁的蓋玻片，用95%乙醇固定室溫20min,0.5%TritonX-10037。C打孔20min,山羊血清工作液37。C封閉30min,滴加DPCC2-G1單抗(1:100)4。C孵育過夜，以PBS替代一抗作為陰性對照，以美國Novus產品d、鼠抗人APE1(1:100)為陽性對照；以HRP標記的羊抗小鼠lgG為二抗(l:50)37。C孵育30min;PBS清洗后用二曱苯聯苯鞍(DAB)顯色，蘇木素復染，樹脂封片，結果如圖13所示，可見細胞核呈棕黃色陽性表達，說明DPCC2-G1單克隆抗體可特異性識別細胞核內的APE1蛋白。3.免疫組織化學收集人前列腺癌、乳腺癌、肺腺癌和腎癌組織蠟塊標本，常規切片，5。/oH2O2浸泡10min，PBS漂洗后用胰酶4"C修復10min,再用枸櫞酸鈉緩沖液微波修復中火5min,低火3min,PBS漂洗后滴加DPCC2-G1單抗(1:500)4。C孵育過夜，以PBS替代一抗作為陰性對照；以HRP標記的羊抗小鼠IgG為二抗37。C孵育30min;PBS漂洗后用二曱苯聯苯鞍(DAB)顯色，蘇木素復染，樹脂封片。結果如圖14所示，可見肺瘤細胞核呈棕黃色強陽性表達，說明DPCC2-Gl單克隆抗體可特異性識別細胞核內的hAPEl蛋白，可作為良好的檢測試劑。實施例8APE1多克隆抗體制備1.免疫動物以實施例2所得純化的hAPEl融合蛋白為抗原，釆用背部皮下及四肢多點注射免疫新西蘭大白兔。免疫程序基礎免疫前耳緣靜脈取血5ml分離血清作為陰性對照。每只用抗原500lug與等體積完全弗氏佐劑充分乳化后進行注射，首次免疫后3天用等量抗原配以完全弗氏佐劑加強免疫，第28天用等量抗原配以不完全弗氏佐劑第3次免疫。第3次免疫后7天，耳緣靜脈取血5ml分離血清，用間接ELISA檢測抗血清的效價。效價達1:64000時頸動脈插管收集全血，4。C放置過夜，4000rpm離心收集血清，-70。C保存。效價達不到要求可再加強免疫1次。2.特異性親和純化抗體將待純化的血清用上樣緩沖液(0.1M磷酸鈉，0.1M檸檬酸三鈉，PH7.0)適當稀釋后加入到ProteinA柱中，用洗脫緩沖液(0.1M磷酸鈉，0.1M梓檬酸鈉，PH3.0)洗脫柱子，收集單峰。收集的純化產物再經抗原抗體特異性親和純化(詳見實施例3)，得到純化的hAPEl多克隆抗體。實施例9雙抗體夾心ELISA的建立1.雙抗體夾心ELISA的建立用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(PH9.6)稀釋單抗DPCC2-G1單克隆抗體包被酶標板，100|^1/孔，4°C過夜，用洗液(0.5%。PBST,pH7.4)洗3次；5。/。BSA封閉，200ju1/孔，37°C孵育2h后洗3次；加入APE1標準品(即實施例2所得純化的hAPEl融合蛋白)和待測血清樣本，100jal/孔，標準品做倍比稀釋。37°C孵育1h后洗3次；加入APE1多抗(即實施例8所得hAPEl多抗)，100jul/孔，37°C孵育lh后洗3次；再加入HRP標記的羊抗兔IgG,37°C孵育45min后用洗滌液(l%oPBST,pH7.4)洗6次；力口TMB底物，100nl/孑L,37°C顯色10min，以2mol/L硫酸終止反應，在酶標儀450nm處測吸光度值(OD柳)。2.ELISA最佳反應條件的確定用棋盤滴定法確定各抗體的最佳工作濃度，將DPCC2-Gl單抗按1:2000、1:10000、1:50000稀釋3個濃度包被酶標板，陽性對照(0.5ug/mlhAPEl融合蛋白為標準品)和陰性對照(PBS)為樣品，多抗按1:2000、1:5000、1:IOOOO稀釋3個濃度，HRP標記羊抗兔IgG按試劑說明書推薦稀釋度，按上述實驗步驟操作，確定抗體的最佳工作濃度。然后將HRP標記羊抗兔IgG倍比稀釋，再次做棋盤滴定。取陽性對照OD45Q值在1.5左右，陰性對照OD45。值小于0.1的條件為最佳，初次結果不理想，可進一步縮小或擴大稀釋度以取得抗原抗體的最佳反應濃度。結果在捕獲抗體稀釋度為1:40000、夾心抗體的稀釋度為1:5000和酶標記抗體稀釋度為1:5000條件下該ELISA一企測方法的信價比最高。實施例IOELISA方法的質量評^f介1.標準曲線的繪制及靈敏度檢測將hAPEl融合蛋白做一系列的倍比稀釋，如1:500、1:1000、1:2000直到1:256000進行測定，以標準品濃度的常用對數為橫座標，OD450值為縱座標，繪制標準曲線，確定其線性檢測范圍及最小檢出濃28度。2.重復性檢測(1)批內試驗對高、中、低三個濃度的標準品在同一批板子上分別進行10次平行檢測，測其OD4so值,計算變異系數CV值。CV(%)=s/xx酵/0。(2)批間試驗在3個不同批次的板子上檢測同一標準品，每次設8個重復孔，測其OD45。值，計算CV值。3.準確性;險測取3份健康體檢者血清，分另'J力。入0.2ug/ml、0.5ug/ml和1.0ug/ml的標準品進行;險測，計算4企測值與理i侖值的一致性，即回收率。回收率=檢測值/理論值x100%。4.穩定性檢測將包被好的板子分別放于4°C和37°C保存一周，檢測同一樣品，比較其OD45。值有無差別。結果標準曲線如圖15所示，在8.0200ng/ml范圍內曲線線性良好，一大于0.99。本法的最低檢測濃度約為2.0ng/ml。重復性、準確性及穩定性檢測結果中，批內變異系數分別為8.37%，8.97%,8.60%,均小于10%;批間變異系數分別為10.47%,11.25%，14.57%,均小于15%;回收率分別為78.56%,85.23%和107.35%;同一樣品，在4。C和37。C保存一周后，檢測其OD45o值差別不大，說明其重復性、準確性及穩定性均較好，符合檢測試劑盒要求。實施例11ELISA^r測試劑盒的初步應用采用所建立的ELISA對200例健康體纟全者、200例肺癌患者、127例鼻咽癌患者和70例結直腸癌患者血清樣本進行了^^測。對計量資料進行統計分析。結果如表2所示，顯示健康體4企者和肺癌患者、鼻咽癌患者及結直腸癌患者血清APE1含量分別為9.00(2.98，15.39)ng/ml，16.90(9.89,26.39)ng/ml，19.57(4.66，70.58)ng/ml和14.27(0.00,34.02)ng/ml,肺癌、鼻咽癌和結直腸癌患者血清hAPEl含量均明顯高于健康體檢者，差異有統計學意義，P<0.05。表2健康體檢者及不同腫瘤患者血清APE1蛋白含量的比較分組中位數P25P75Mann-WhitneyU檢驗P值健康體檢者9.002.9815.39肺癌16.909.8926.3912056.50.000a鼻咽癌19.574.6670.588244.00.000b結直腸癌14.270.0034.025589.00.012ea:肺癌患者與健康體^^者比較；b:鼻咽癌患者與健康體檢者比較；c:結直腸癌患者與健康體檢者比較。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110〉中國人民解;^丈軍第三軍醫大學第三附屬醫院<120>抗hAPEl蛋白的抗體及其制備方法與應用該抗體的試劑盒<130>MP090257<160>10<170>Patentlnversion3,3<210>1<211〉15<212>PRT<213>hAPEl蛋白76-90位<400>1lieLysLysLysGlyLeuAspTrpValLysGluGluAlaProAsp151015<210>2<211>15<212〉PRT<213〉hAPEl蛋白109-123位<400>2GinGluLeuProGlyLeuSerHisGinTyrTrpSerAlaProSer151015<210>3<211〉26<212>DNA<213>hAPEl基因的上游引物<400>3catgccatggctccgaagcgtgggaa26<210>4<211>57<212>DNA<213>hAPEl基因的下游引物<400>4gcggatcctcaatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgcagtgctaggtatagg57<210>5<211>328<212>PRT<213>hAPEl融合蛋白<400>5MetProLysArgGlyLysLysGlyAlaValAlaGluAspGlyAspGlu151015LeuArgThrGluProGluAlaLysLysSerLysThrAlaAlaLysLys202530AsnAspLysGluAlaAlaGlyGluGlyProAlaLeuTyrGluAspPro354045ProAspGinLysThrSerProSerGlyLysProAlaThrLeuLyslie505560CysSerTrpAsnValAspGlyLeuArgAlaTrplieLysLysLysGly65707580LeuAspTrpValLysGluGluAlaProAsplieLeuCysLeuGinGlu85909532ThrLysCysSerGluAsnLysLeuProAlaGluLeuGinGluLeuPro100105110GlyLeuSerHisGinTyrTrpSerAlaProSerAspLysGluGlyTyr115120125SerGlyValGlyLeuLeuSerArgGinCysProLeuLysValSerTyr130135140GlylieGlyAspGluGluHisAspGinGluGlyArgVallieValAla145150155160GluPheAspSerPheValLeuValThrAlaTyrValProAsnAlaGly165170175ArgGlyLeuValArgLeuGluTyrArgGinArgTrpAspGluAlaPhe180185190ArgLysPheLeuLysGlyLeuAlaSerArgLysProLeuValLeuCys195200205GlyAspLeuAsnValAlaHisGluGlulieAspLeuArgAsnProLys210215220GlyAsnLysLysAsnAlaGlyPheThrProGinGluArgGinGlyPhe225230235240GlyGluLeuLeuGinAlaValProLeuAlaAspSerPheArgHisLeu245250255TyrProAsnThrProTyrAlaTyrThrPheTrpThrTyrMetMetAsn260265270AlaArgSerLysAsnValGlyTrpArgLeuAspTyrPheLeuLeuSer275280285HisSerLeuLeuProAlaLeuCysAspSerLyslieArgSerLysAla290295300LeuGlySerAspHisCysProlieThrLeuTyrLeuAlaLeuHisHis30531031532033HisHisHisHisHisHisHisHis325<210>6<211>26<212>DNA<213>NF-kB探針Pl<400>6agcttagaggggactttccgagagga26<210>7<211>26<212>DNA<213>NF-kB探針P2<400>7tcctctcggaaagtcccctctaagct26<210>8<211>42<212>DNA<213>AP4立點正義《連22-U<400>8ccgctgaattgcaccctcgauctaggtcgatgatcctaagca42<211>42<212>DNA<213〉AP位點反義鏈22-C<400>9Tgcttaggatcatcgacctaggtcgagggtgcaattcagcgg42<210>10<211〉186<212>PRT<213>Eppin-His蛋白<400>10GlySerGlySerGlyHisMetHisHisHisHisHisHisSerSerGly151015LeuValProArgGlySerGlyMetLysGluThrAlaAlaAlaLysPhe202530GluArgGinHisMetAspSerProAspLeuGlyThrAspAspAspAsp354045LysAlaMetAlaAsplieMetGlySerSerGlyLeuLeuSerLeuLeu50556065707580TrpLeuPheProArgArgCysProLyslieArgGluGluCysGluPhe859095GinGluArgAspValCysThrLysAspArgGinCysGinAspAsnLys100105110LysCysCysValPheSerCysGlyLysLysCysLeuAspLeuLysGin115120125AspValCysGluMetProLysGluThrGlyProCysLeuAlaTyrPhe130135140LeuHisTrpTrpTyrAspLysLysAspAsnThrCysSerMetPheVal145150155160TyrGlyGlyCysGinGlyAsnAsnAsnAsnPheGinSerLysAlaAsn165170175CysLeuAsnThrCysLysAsnLysArgPhe1801853權利要求1、一種抗體，其特征在于，與hAPE1蛋白76-90位和109-123位構成的構象型表位特異性結合，所述hAPE1蛋白的76-90位氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，109-123位氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2、根據權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、合成抗體、抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體及它們的化學修飾衍生物。3、根據權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體的亞型為IgG、IgE、IgM、IgD或IgA。4、根據權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體為人源化抗體。5、根據權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體的親和常數為6、根據權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體由保藏在中國典型培養物保藏中心、保藏編號為CCTCC:C200852的雜交瘤細胞林產生。7、一種雜交瘤，其特征在于，所述雜交瘤保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC:C200852。8、一種hAPEl融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列由SEQIDNo.5所示。9、根據權利要求l-6任一項所述抗體的制備方法，包含以下步驟將權利要求8所述hAPEl融合蛋白免疫動物，篩選出分泌與hAPEl特異性結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞注射動物腹腔，對產生的腹水分離純化獲得所述抗體。10、一種診斷組合物，其特征在于，包括權利要求l-6任一項所述抗體，和可任選的免疫診斷方法中常規使用的合適試劑。11、一種包含權利要求l-6任一項所述抗體的ELISA試劑盒。12、根據權利要求10所述的ELISA試劑盒，其特征在于，還包括權利要求8所述hAPEl融合蛋白。全文摘要本發明涉及生物醫學
技術領域：
，公開了一種人脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶即hAPE1蛋白的抗體，該抗體特異性結合hAPE1蛋白76-90位和109-123位構成的構象型表位。本發明還提供一種所述抗體的制備方法及應用該抗體的ELISA試劑盒。本發明所述抗體與hAPE1蛋白的構象型表位特異性結合，可檢測正常和疾病狀態下hAPE1蛋白的表達，特異性好，親和常數Ka為1.8×10^-7，效價大于1∶10⁷，具有廣泛的應用前景。文檔編號C12N5/20GK101671394SQ200910135680公開日2010年3月17日申請日期2009年4月24日優先權日2009年4月24日發明者楠戴,曹曉靜,李夢俠,東王,胡川閩申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院