一株產生抗腫瘤抗生素卡利霉素的小單孢菌c-3509的制作方法

專利名稱：：一株產生抗腫瘤抗生素卡利霉素的小單孢菌c-3509的制作方法
技術領域：
：本發明涉及從我國土壤中篩選得到的一株產生烯二炔類抗腫瘤抗生素卡利霉素的棘孢小單孢菌蛇山變種C3509。
背景技術：
：自本世紀中期以來，某些惡性腫瘤的發病率，幾乎每隔十年增長一倍，已成為嚴重威脅人們生命的常見病、多發病。腫瘤的防治一直是醫學研究的熱點。自五十年代氮芥類烷化劑用于腫瘤治療以來，化學治療占據著不可替代的重要地位。但是，為了滿足臨床急需，研究人員不得不加大力度，擴展研究的深度和廣度，不斷開辟尋找新化療藥的途徑。微生物廣泛存在于自然界，種類繁多，其代謝產物數量亦很龐大。多年來，微生物提供了各種各樣生物活性物質，亦可謂是抗腫瘤抗生素的豐富資源寶庫，其潛力是巨大的。自1923年4)rskov建立小單孢菌屬并于20世紀60年代從棘孢小單孢菌和繹紅小單孢菌發酵液中分離到慶大霉素后，小單孢菌作為尋找新抗生素和其它新生物活性物質的資源愈來愈受到重視。1987年，美國科學家報導從小單孢菌中篩選到一株產生高效抗腫瘤抗生素卡利霉素(calicheamicin)的產生菌Mz'cra附cwo5poraec/u.W(Mporaswfesp.ca/!.c/2ew57's。2000年，美國FDAft匕準用于治療復發的急性髓性白血病的Mylotarg即為單抗與卡利霉素的偶聯物。卡利霉素作為彈頭藥物療效已經確認，只要與不同的抗體連接，即可組成新的相關抗體藥物。本實驗室在前期研究工作基礎上，采用精原細胞法("Useofmurinespermatogonialassayasproscreenforantitumordrugsinproc，，,13thIntCongrchemother,Viena，PP38-44;1983)，篩選出了能產生高效抗腫瘤活性物質卡利霉素的新菌種棘孢小單孢菌蛇山變種C3509fi^'crawowo^oraec/nwcw/oravar.57zes/wwew^;s入該變種迄今為止，尚未見有國內外的相關報道。本發明的目的是，從土壤中篩選小單孢菌菌株，對其發酵產物進行鑒定，發掘產生具有抗腫瘤作用的抗生素，以期獲得具有良好開發與應用前景的抗腫瘤藥物。
發明內容本發明提供一種能產生高效抗腫瘤抗生素卡利霉素的新的小單孢菌。其技術方案主要包括以下步驟1、篩選分類。取其發酵液，測紫外吸收光譜，從相似于Calicheamicin的菌株中，選取生長與發酵穩定、精原細胞活性稀釋度高的C-3509菌株進行深入研究；根據菌種的形態特征、菌種的生長條件與培養特征、菌種的生理與生化特性、菌種的細胞壁化學組分及核酸堿基分析以及16SrDNA分析，進行菌種分類。2、發酵制備，采用多級培養，其中斜面培養基主要采用Tryptone、酵母浸膏和麥芽糖；一級種子培養基主要采用糊精、MaltExtractProteose、P印toneYeastextract;二級種子培養基主要采用糊精、葡萄糖、Yeastextract、帶魚蛋白胨；發酵培養基主要采用葡萄糖、蔗糖、酵母浸膏粉和帶魚蛋白胨等。3、分離純化，發酵液離心，取樣測活，收集活性部分，制成粗品，用微生物檢定法、DNA斷裂法測其活性，TLC測其Rf值，挑取兩種檢測均為高活性部分，參照Rf值進行合并，取強活性部分，反相制備柱制備，得到高效抗腫瘤活性樣品。4、結構確認，取二次薄層層析得到的高效抗腫瘤活性樣品進行LC-MS檢測，再取二次薄層層析得到的高效抗腫瘤活性樣品進行紫外吸收檢測，以確認本發明所說新種產生的活性物質與卡利霉素相似。5、活性測定，采用DNA斷裂活性測定法和細胞毒性檢測法進行。DNA斷裂活性測定法，是取活性物質，在紫外燈下檢測pBR322DNA拓撲結構的變化，并用Chemiimager5500型凝膠成像系統掃描凝膠，記錄結果；細胞毒性檢測法，是采用MTT法測定細胞存活率。由于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，加入助溶劑二甲基亞楓(DMSO)能溶解細胞中的藍紫色結晶物，所以測定溶解的藍紫色DMSO溶液在特定波長處的光吸收值，即可間接反應活細胞的數量與活性。根據多相分類定種的原則，綜合考慮菌株C-3509的培養特征、生理生化指*示、16SrDNA，確認C—3509與Aferowowos/oraecA/"cw/ora系同屬，《旦又有另U于同屬中的Mcro附o"cw/orasubspcalichensis，故命名為棘孢小單胞菌蛇山變禾中fAf/c7-o附o"cw/wraec/z'wos/>oravw.幼es/朋sz's上該菌禾中已于2009年3月25日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，編號為CGMCCNo.2978。發明效果本發明所得到的小單孢菌菌株C-3509,培養條件簡單、保藏方便，在發酵培養基中產生高效的抗腫瘤抗生素，具有潛在的臨床應用前景。圖l一小單孢菌C3509菌株的孢子結構放大倍數為9000倍，孢子成球形，表面有鈍剌，孢子大小為l.卜1.4Wn.圖2—小單孢菌C3509高效液相圖其中保留時間為11.05的峰對應f;保留時間為11.20的峰對應^;保留時間為11.5的峰對應f;保留時間為11.61的峰對應3;。圖3—小單孢菌C3509f的質譜圖其中1322為f的[M+H]峰；1320為f的同位素[M+H]峰。圖4一小單孢菌C35097;的質譜圖其中-1367.9為7;的[M+H]峰。圖5—小單孢菌C3509pfr的質譜圖其中1334為f的[M+H]峰。圖6—小單孢菌C3509^的質譜圖其中1381.8為e;的[M+H]峰。圖7—C3509的紫外吸收光譜其中230-260nm,260-290nm處為C3509的特征吸收。圖8—小單孢菌C-3509發酵產物對超螺旋質粒DNApBR322的切割其中I一超螺旋DNA;II—切口DNA;III—線性DNA;①一pBR322質粒對照；②一0.0002pg/ml的C-3509;③一0.002pg/ml的C3509;④一0.02pg/ml的C3509;⑤一0.2pg/ml的C3509;⑥一1.0)ig/ml的C3509;⑦一10iig/ml的C3509。圖9一不同的細胞株對C3509的化學敏感性其中A中一"一表示HepG2，人肝癌細胞株；一，一表示Bel-7402，人肝癌細胞株；B中—"一表示Hela，宮頸癌細胞株；—一表示MG-63，人成骨肉瘤細胞株；表示KB，人口腔上皮癌細胞株。C中一"一表示A549，人肺癌細胞株；表示MCF-7，人乳腺癌細胞株；表示HT-1080，人纖維肉瘤細胞株。實施方案以下實施例僅為便于本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。<實施例1〉小單孢菌C-3509菌株的篩選將從土壤中分離得到的多種小單孢菌菌株分別接到TYM瓊脂斜面(Tryptcme5g,酵母浸膏3g,麥芽糖10g，K2HPO4lg,KH2PO4lg,瓊脂18g，調PH7.0-7.2,去離子水配置成1000ml)上，在28'C培養12天，然后接種于發酵培養基(葡萄糖10g，蔗糖15g,酵母浸膏粉3g，帶魚蛋白胨4g,KI0.1g,微量元素液lml,冷開水1000ml)220rpm，28。C培養3天，低溫離心取上清，用精原細胞法檢測，從中篩選檢測結果為陽性的菌株；取該菌株的發酵液，測其紫外吸收光譜，篩選出與卡利霉素相似的菌株C-3509。<實施例2>小單孢菌C-3509的分類分類培養采用通常有代表性的培養基及國際鏈霉菌規劃會議擬定的培養基(簡稱ISP培養基)，28。C靜止培養21天，觀察C-3509菌株的培養特征。顏色鑒定參考Ridgwa圖譜，生理生化實驗參照文獻方法，細胞壁化學組份研究參照Backer、Lechevalier和Hasegawa的方法，磷酸類脂、醌類及G+Cmol%的分析按照中國科學院微生物所Ross、阮繼生的方法進行。1、菌種形態特征C-3509菌株在各種瓊脂培養基上菌落光禿，或光滑，或粗糙，不形成氣生菌絲。營養菌絲一般為淺粉橙色、杏黃色或無色，以后漸漸變為橄欖灰黑色。一般無可溶性色素產生，孢子堆呈黑色，孢子單生或成簇，孢子形態為球形，表面形成鈍刺。(圖1)2、菌種生長條件與培養特征C-3509菌株適宜的生長溫度為15'C至37°C，在l(TC與45。C條件下均不能生長，在含有0.01%疊氮、0.01%酚或0.001%結晶紫的培養基上不能生長，但在含有0.01%孔雀綠的培養基上能夠生長。在各種合成或有機瓊脂培養基上的菌落為無色、淺粉橙色或杏黃色，以后漸漸轉變為橄欖灰、黑色，在ISP-5、高氏1號(Gauze'sNo.l)及甘油察氏(Czapek's)瓊脂培養基上生長差，在ISP-2培養基上可產生淺黃褐色的可溶性色素，在葡萄糖天門冬素培養基上沒有或有淺紫色的可溶性色素產生。其培養特征見表l。表l.C-3509菌株的培養特征培養基孢子營養菌絲可溶性色素(SP)~^豐，黑色好，杏黃、橙至橄欖黑茶色或黃褐色ISP3適量，黑色好，粉橙色至灰黑色無ISP4適量，黑色適量，粉橙色至灰黑色無ISP5少，黑色生長差，無色無ISP6無或少量，黑色適量好，杏黃至茶色黃色ISP7適量，黑色適量，無色至橄欖灰黑無或淡紫色葡萄糖察氏瓊脂適量，黑色適量，灰黑綠無蔗糖察氏瓊脂適量，綠黑至黑色適量，橄欖灰黑無甘油察氏瓊脂無生長差，無色無高氏合成l號瓊脂少，黑色較差，灰黑綠色無葡萄糖天門冬素瓊脂豐，黑色_好，橄欖綠黑色_無3、菌種的生理與生化特性C-3509菌株能夠水解淀粉，具有強的還原硝酸鹽活性，可以使明膠液化，并有弱的降解酪素與胨化牛奶的作用，但對于酪氨酸、尿素與幾丁質均不能降解，不形成黑色素，但能夠產生硫化氫(強陽性)。能夠較好地利用蔗糖、淀粉、糊精、纖維二糖、蕈糖、葡萄糖、木糖，稍利用水楊苷與醋酸鈉，不利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-果糖、肌醇、甘露醇、乳糖、D-半乳糖、棉子糖、甘油、山梨醇、衛毛醇、木糖醇、核糖醇、纖維素等；能夠很好地利用絲氨酸、組氨酸、精氨酸、色氨酸與天門冬素，較好地利用賴氨酸、甲硫氨酸，不利用蘇氨酸、半7胱氨酸。4、菌種的細胞壁化學組分及核酸堿基分析C-3509菌株的全細胞水解產物含有內消旋二氨基庚二酸(Meso-DAP)、少量3-羥基-二氨基庚二酸(3-OH-DAP)、木糖、葡萄糖、半乳糖，及少量的阿拉伯糖。其磷酸類脂屬于n型，有磷脂酰乙醇胺(PE)。甲基萘醌成分為MK-9(H4)、MK9(H6)。核酸分子中G+Cmol。/。含量為71.14mol%。5、16SrDNA分析按常規方法提取菌株C-3509的總DNA，以通用引物PCR擴增16SrDNA.，PCR產物經純化后用相同引物進行測序，所得序列經校正后送Genbank序列數據庫做Blast比較，根據所得結果選取相關模式菌株序列構建系統發育樹；其中多序列匹配排列通過Clustalw軟件進行，Neighbor-Joining(N-J)進化樹由Phylipsoftwqarepackage生成。菌株C-3509與棘孢小單孢菌的16SrDNA序列同源性最高，為99.44%。根據多相分類定種的原則，綜合考慮菌株C-3509的培養特征、生理生化指豐示，16SrDNA，確認C—3509與A/i'cro附owcw;7oraec&wo5pora同屬，il又有另U于同屬中的Mz'cra附o"，omgc/u'wcw/7orasubspcalichensis，故命名為棘孢小單胞菌蛇山變禾中fMz'cramowoSjporaecAz'"osporavaK幼esAawe"57's入該菌禾中已于2009年3月25日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.2978。6、C-3509與Calicheamicin產生株的比較C-3509與Calicheamicin產生株同屬于刺孢小單孢菌屬，且都產生高效的抗腫瘤抗生素Calicheamicins四種組份，但兩者菌種不同(見表2)。表2.C-3509與Calicheamicin產生菌形態培養特征的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>〈實施例3〉小單孢菌C-3509菌株的發酵C-3509的斜面采用TYM培養基(Tryptone5g,酵母浸膏3g,麥芽糖10g，K2HP04lg,KH2P04lg,瓊脂18g，調PH7.0-7.2,去離子水配置成lOOOml)。將C-3509接種于斜面培養基上，28。C培養12天，使得斜面上長滿豐富的黑色孢子。將生長好的斜面培養物挖塊接種于一級種子培養基(糊精15g,MaltExtract10g,ProteosePeptone5g,Yeastextract5g,調PH7.0，去離子水配置成1000ml)，28'C震蕩培養96小時。一級種子轉接二級種子培養基(糊精15g，葡萄糖10g,Yeastextract3g,帶魚蛋白胨5g，調PH7.0,去離子水配置成lOOOml)，接種量為5%，28'C震蕩培養48小時。二級種子接種于發酵培養基(葡萄糖10g,蔗糖15g,酵母浸膏粉3g,帶魚蛋白胨4g,KI0.1g，微量元素液1ml,冷開水1000ml)，接種量為5M，28'C震蕩培養72小時。微量元素液FeS047H20O.lg，MnC124H20O.lg，ZnS047H20O.lg，蒸餾水lOOml，配成lmg/ml溶液。<實施例4>小單孢菌C-3509菌株發酵產物的檢測a).微生物檢定法適用于初篩，離心收集發酵液，測量抑菌圈直徑。檢測菌為枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501];b).DNA斷裂法lmg活性物質，DMSO溶解為lmg/ml溶液，將3.5pL50mol'U1Tris-HCL(pH7.6)緩沖液、4.5^LpBR322DNA溶液(100ng^U1)、1不同濃度的樣品溶液和1|3-巰基乙醇混合，置室溫下暗處反應lh，再加入電泳樣品孔，在P/。瓊脂糖凝膠中電泳lh，用溴化乙錠水溶液(0,45嗎'mL")染色30min。在紫外燈下(302nm)檢測pBR322DNA拓撲結構的變化。并用Chemiimager5500型凝膠成像系統掃描凝膠，記錄結果。〈實施例5〉小單孢菌C-3509菌株發酵產物的分離純化C-3509的發酵液低溫離心，合并離心液，取樣測活。活性部分DIAIONHP20大孔吸附樹脂進行吸附柱層析，流速每分鐘1/100柱體積，80%丙酮洗脫，收集活性部分，低溫吹去丙酮，乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，至紅棕色油狀物。少量乙酸乙酯溶解，正已垸沉淀，靜置24小時，離心收集沉淀，制成粗口叩o干法裝硅膠柱，抽去硅膠柱內空氣，以12個柱體積的流動相A溶液(EA:MeOH95:5)平衡柱子。將粗品溶于流動相A溶液中，進行硅膠柱層析，用流動相A溶液進行洗脫，分管收集，微生物檢定法、DNA斷裂法測其活性，TLC測其Rf值，挑取兩種檢測均為高活性部分，參照Rf值進行合并。用流動相B(CH2Cl2:Acetone:MeOH8:l:l)進行TLC薄層層析，刮取TLC條帶，測活，取強活性部分，用流動相B二次TLC。刮取條帶，測活，取強活性部分，合并。將合并部分溶于流動相C(CH3CN:0.2MNH4OAc1:1),ODS的HPLC反相制備柱制備，得到高效抗腫瘤活性樣品。〈實施例6〉C-3509菌株發酵產物的結構鑒定取二次薄層層析得到的高效抗腫瘤活性樣品用LC-MS進行檢測(圖2)，分析結果，其中四個成分的分子量(圖3、圖4、圖5、圖6)分別與Calicheamicin相同，且分子量為1319、1381的組份為典型的含Br元素化合物質譜圖，分子量為1367、1333的組份為典型的含I元素化合物的質譜圖。取二次薄層層析得到的高效抗腫瘤活性樣品測定紫外吸收，紫外吸收圖譜(圖7)與Calicheamicin相似。〈實施例7〉樣品的活性測定(1)DNA斷裂活性測定DNA斷裂檢測方法lmg活性物質，DMSO溶解為lmg/ml溶液，將3.5pL50molL/1Tris-HCL(pH7.6)緩沖液、4單pBR322DNA溶液(100ngnL")、1pL不同濃度的樣品溶液和1pLP-巰基乙醇混合，置室溫下暗處反應lh，再加入電泳樣品孔，在1%瓊脂糖凝膠中電泳1h，用溴化乙錠水溶液(0.45貼mL—1)染色30min。在紫外燈下(302nm)檢測pBR322DNA拓撲結構的變化。并用Chemiimager5500型凝膠成像系統掃描凝膠，記錄結果。DNA斷裂結果見圖8。由圖可以看出，C-3509濃度為0.02Pg/ml時，仍有DNA斷裂活性。C-3509的DNA斷裂活性為陽性的最低樣品濃度在0.02Pg/ml左右。(2)細胞毒性檢測(圖9)MTT法測定細胞存活率MTT是一種可以接受H原子的四甲基偶氮唑藍染料，化學名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴藍，商品名為噻唑藍，簡稱MTT。檢測原理活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。助溶劑二甲基亞楓(DMSO)能溶解細胞中的藍紫色結晶物，測定溶解的藍紫色DMSO溶液在570nm波長處的光吸收值，該值可間接反應活細胞的數量和活性。檢測方法如下①取對數生長期細胞，消化計數后按照各個細胞系生長特性不同以4000~6000個/孔的密度接種于96孔細胞培養板中。②在細胞培養箱中培養24h后加入不同濃度的活性物質，使每孔內給藥后培養液終體積為200|il，每組至少3個平行孔，放入細胞培養箱(培養箱溫度為37'C，C025%)中繼續培養。③MTT用PBS緩沖液配成5mg/ml溶液。給藥48h后取出細胞培養板，向每孔中加入前述的MTT溶液20^1，37。C溫育4h。⑤吸出上清液，加入150plDMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。用酶標儀在570nm處測定每個孔的吸光度(A)。將各測試孔的吸光度A值減去本底吸光度A值(完全培養基加MTT，無細胞)，各平行孔的吸光度A值取平均數。⑦細胞的存活率以T/C(%)表示，T為加藥組細胞的A值，C為對照組細胞的A值。細胞存活率％=(加藥組細胞A值-本底A值)/(對照組細胞的A值-本底A值)X100%⑧根據T/C的值繪制生長曲線。(D根據細胞生長曲線計算活性物質對腫瘤細胞增殖抑制作用的ICso值(半對數抑制濃度)表3.不同的細胞株對C-3509發酵樣品的化學敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>細胞毒性(IC5。值單位M)由MTT檢測方法獲得。A549,人肺癌細胞株；MCF-7，人乳腺癌細胞株；HT-1080,人纖維肉瘤細胞株；Hela，宮頸癌細胞株；MG-63，人成骨肉瘤細胞株；HepG2，人肝癌細胞株；KB，人口腔上皮癌細胞株;Bel-7402，人肝癌細胞系株。權利要求1、一株棘孢小單胞菌變種C-3509，保藏編號為CGMCCNo.2978。2、權利要求l所述小單胞菌變種C-3509在制備抗腫瘤抗生素卡利霉素中的應用。全文摘要本發明涉及一株產生烯二炔類抗腫瘤抗生素的棘孢小單孢菌蛇山變種C3509，實驗結果表明，其發酵液用精原細胞法檢測為陽性，經過分離純化可得到高效抗腫瘤活性物質Calicheamicinsγ₁^I，γ₁^Br，β₁^I，β₁^Br四種組份，因而有望用于制備烯二炔類抗腫瘤抗生素。文檔編號C12N1/20GK101591632SQ20091013616公開日2009年12月2日申請日期2009年4月30日優先權日2009年4月30日發明者張文軍,李電東,楊秀萍,甄永蘇,胡繼蘭,趙春燕,邵榮光申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所