一類新的單萜類化合物及其制備方法

專利名稱：：一類新的單萜類化合物及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及生物有機化學
技術領域：
，涉及一類新的單薛類化合物及其制備方法。
背景技術：
：近些年來，以天然產物中的活性單體為底物對其進行系統的結構改造和修飾，用以制備活性更好，毒性更低的化合物，是生物有機化學領域的研究熱點同時也具有良好的應用前景。發明人多年來從事天然產物的化學與生物學研究，尤其對萜類化合物有著深入的研究。單萜類的含氧化合物多具有較強的生物活性，是醫藥、化妝品和食品工業的重要原料。芍藥中單薛及單萜苷類化合物是其活性的主要物質基礎，芍藥中代表性成分芍藥苷和芍藥內酯苷為具有籠狀蒎烷結構的單萜苷類化合物。發明人對芍藥內酯苷和芍藥苷的植物來源進行了深入的研究，發現這兩種化合物存在于芍藥和牡丹的根、莖、葉中，資源豐富。發明人以白芍為原料，釆用溶劑提取、液-液萃取和柱層析等多種分離、純化手段相結合，對芍藥中有藥理活性的蒎烷類單萜苷類化合物進一步分離、純化，獲得純度達90%以上的白芍雙苷(芍藥內酯苷、芍藥苷)組合物(專利號為ZL02133298.3)，并將其用于新藥開發，經過藥理、藥效學的研究表明，白芍雙苷具有良好的升白作用，(專利申請號為200510015840.0)。基于白芍雙苷的優良藥理作用及獨特的結構特點，在現有工作的基礎上，發明人以富含蒎垸類單萜苷的提取物為原料，對其進行結構改造，期望得到活性更好的化合物。有文獻報道含芍藥苷的制劑口服后，在腸道細菌分泌的P葡萄糖苷酶和酯酶的催化下轉化成的芍藥苷代謝產物，具有強烈抗人類先天性癲癇中樞性驚厥的作用(劉欣、崔翌，糖苷酶與藥物研發《天然產物與研發》2005,17(2):223)。從結構上看，芍藥苷和芍藥內酯苷非常相似d位羥基與葡萄糖基結合成糖苷，C9位羥甲基與苯甲酸成酯。因而我們認為將芍藥內酯苷的苯甲酰基和葡萄糖基分別水解得到的兩個新化合物很可能具有良好的生物學活性。初步藥理實驗證明兩個新的化合物具有良好的鎮痛作用，同時這兩個化合物還可作為先導化合物，對其做進一步的結構修飾，如烷基化、酰基化及酯化，可以得到一類結構類似，但具有多種不同生物學活性的化合物。發明人最初的技術路線是分別利用堿和酸將原料的苯甲酰基和葡萄糖基水解得到相應的化合物，但實際操作發現在強堿、強酸條件下，生成的目標產物不穩定，產生多種副產物，使目標產物收率極低。因此難以通過化學方法獲得從理論上看較容易得到的化合物I、II。因而尋求一種新的試驗方法來獲得穩定且產率高的目標產物是必需的。
發明內容本發明的一個目的在于公開一類新的單萜類化合物；本發明的另一個目的在于公開這類單萜化合物的制備方法。本發明的單萜類化合物其結構式為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物I化合物II化合物I的制備方法1)微生物培養將產羧酸酯酶的菌體的固體斜面接種于査氏培養基中，置于恒溫搖床于28'C、250rpm震蕩培養48h。2)加入底物將富含蒎烷類單萜苷的組合物溶于水中，配制成濃溶液。加入已培養了48h的菌體發聘液中，同樣條件下繼續培養72h。3)發酵液的處理發酵液抽濾后收集濾液，在減壓條件下低溫濃縮至小體積，用等體積的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并后減壓濃縮，真空干燥得粗粉。4)轉化產物的分離純化將步驟3)得到的粗粉用硅膠柱層析分離，以二氯甲垸甲醇梯度洗脫，分段收集，通過TLC檢測，合并單一點的洗脫液，減壓濃縮，得到白色晶體即為化合物I。其純度經薄層色譜和高效液相色譜(檢測器ELSD)檢測達99%以上。化合物II的制備方法1)軟生物培養將產'葡萄糖苷酶的菌體的固體斜面接種于查氏培養基中，置于恒溫搖床于28。C、250rpm震蕩培養48h。2)加入底物將化合物I溶于水中，配制成濃溶液。加入已培養了48h的菌體發酵液中，同樣條件下繼續培養72h。3)發酵液的處理發酵液抽濾后收集濾液，在減壓條件下低溫濃縮至小體積，用等體積的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并后減壓濃縮，真空干燥得粗粉。4)轉化產物的分離純化將步驟3)得到的粗粉用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷甲醇梯度洗脫，分段收集，經TLC檢測，合并單一點，減壓濃縮，得棕色油狀物即為化合物II。其純度經薄層色譜和高效液相色譜(檢測器ELSD)檢測達99%以上。化合物I結構鑒定化合物I為白色結晶，薄層色譜法檢查時無紫外吸收，硫酸顯色為褐色。UV譜(MeOH)中，無紫外吸收。質譜(圖l)中顯示[M+Na]+為.399，其分子量可確定為376。IR光譜中(圖2)17Wcm"處可見內酯羰基的特菊萄糖片斷質子信號L54.96(1H，d,glc-rH),2.94-3.19(4H，glc-H),4.02，3.59(2H,glc-6'H)],一個甲基質子信號[力l.31(3H，s)],三個連氧碳上的質子信號[54.46,4.49(2H，d)與4.02(1H,t)]和五個烷基質子信號[51.74(1H，d);2.19(1H,dd)，3.61(1H)，1.79(1H，dd);2.58(1H,t)]。沒有出現芍藥內酯苷單取代苯基的特征質子信號，但在低場區其質子信號峰的裂分情況和化學位移與芍藥內酯苷非常相似。13C-NMR譜(圖4)中給出一組葡萄糖碳信號[597.9、70.3、73.3、76.9、77.0、61.3]，一個羰基碳信號[5175.5],四個連氧碳信號[590.3、66.3、56.2、85.3]和五個烷i碳信號[540.9、40.0、26.8、58.4、20.1]。比芍藥內酯苷少了一組苯甲酰碳信號。基于以上數據分析，鑒定化合物I為芍藥內酯苷去苯甲酰基產物，分子式為C"^0,。，化學結構為[化學名](1R,3A4A6《95)-6-甲基-4-羥基-l-(P-D-葡萄吡喃糖氧基)-9-(羥甲基)-7-氧代三環[4.3.0.O"]壬烷-8-酮化合物II結構鑒定化合物II為白色結晶。硫酸顯色為棕黃色。質譜(圖5)顯示[M]+為214，其分子量可確定為214。IR光譜中(圖6)3445cm—'為羥基峰，1758cm—'為內酯的羰基峰。'H-NMR譜(圖7)給出一個甲基的氫信號[51.15(3H，s)]，三個連氧的氬信號[54.97(1H,t)，5.70(1H，d);6.01(1H,d)]和四個烷基的氫信號[52.19(1H,dd);2.67(1H，dd)，2.01(1H,dd);2.81(1H,dd)]。沒有出現芍藥內酯苷單取代苯基的特征質子信號和葡萄糖質子信號，但在低場區其質子信號的裂分情況和化學位移與芍藥內酯苷非常相似。"C-NMR譜(圖8)中給出五個連氧碳信號[5209.8、169.5、139.3、121.1、74,3〗，五個烷基碳信號[571.9、39.2、38.6、36.6、24.1]。比芍藥內酯苷少了一組苯甲酰碳信號和葡萄糖碳信號。利用HSQC譜(圖9)，可知5.70(1H，d)、6.01(1H，d)為121.1碳(9位羥甲基碳)上的質子信號；4.9(1H，t)為74.3碳(4位碳)上的質子信號；3.65UH，t)為36.6碳上的質子信號；2.81(1H,dd)、2.67(1H，dd)為38.6碳上的質子信號;2.19(1H,dd)、2.01(1H，dd)為39.8碳上的質子信號；1.15(3H,s)為24.l碳(甲基)上的質子信號。HMBC譜中(圖10),2.19(1H,dd,)、2.01(1H，dd,)兩個質子與6位上的甲基碳信號524.l有遠程相關，可判定為5位碳(539.8)上的兩個質子；3.65UH,t)與8位羰基碳信號5209.8有遠程相關，可判定為3位碳(536.6)上的質子，同時3.65(1H,t)與139.3碳有遠程相關，可判定5139.3為l位上的碳信號；2.81(1H,dd)、2.67(1H，dd)兩個質子與1位碳5139.3有遠程相關，可判定為2位碳(538.6)上的兩個質子；571.9與4位碳(574.3)上的質子4.97(1H，t,4H)有遠程相關，可判定其為9位碳信號。基于以上數據分析，鑒定化合物n為芍藥內酯苷去苯甲酰基和葡萄糖基的產物，分子式為C1QH1405，化學結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>[化學名](1R,3A化6《95)-6-甲基-1，4-二羥基-9-(羥甲基)-7-氧代三環[4.3.0.03'9]壬烷-8-酮本發明制備的新的單萜類化合物具有較好的鎮痛作用。發明人用生物轉化的方法，分別利用具有羧酸酯酶和葡萄糖苷酶活性的真菌將蒎烷類單萜苷的苯甲酰基和葡萄糖基溫和的水解掉，轉化產物單一，轉化率可達92%，目標產物的總收率在63%以上。因而該方法與化學方法相比具有明顯的優勢。本發明的優點是首次以芍藥中有代表性的活性蒎烷類單萜苷的提取物為原料，通過微生物轉化法得到兩個新的單萜類化合物，本發明的制備方法簡單，成本低，對環境污染小，得到的兩個全新活性單體化合物，可作為先導化合物，做進一步結構修飾后，可以獲得一大類新的結構類似，但具有多種生物學活性的化合物，也可以直接將其開發成高活性的新藥。化合物I的質譜化合物I的IR光譜化合物I的'H-NMR譜圖化合物I的"C-NMR譜圖化合物II的質譜化合物II的IR光譜化合物II的力-NMR譜圖化合物II的13C-NMR譜圖化合物II的HMQC譜圖11:化合物I的'H-腿譜和"C-隨譜歸屬表圖12:化合^II的'H-NMR譜和"C-NMR譜歸屬襄具體實施方式實驗例l:i、化合物i、n的鎮痛作用--大鼠扭體實驗實驗方法取雄性大鼠50只，隨機分為空白對照組，陽性對照組，白芍雙苷注射液組(100mg/kg)、化合物I組(100mg/kg)及化合物II組(100mg/kg),每組各10只動物。分別尾靜脈注射生理鹽水，陽性藥(康萊特注射液)，白芍雙苦注射液，化合物I的鹽溶液及化合物II的鹽溶液，給藥30分鐘之后，腹腔注射1°/。醋酸(0.5ml/只)，觀察并記錄注射醋酸后0-15分鐘及15-30分鐘兩個時間段內扭體次數。如表l所示，化合物I、II能顯著減少大鼠扭體反應次數，與白芍雙苷注射液相比，鎮痛作用稍強。陽性對照藥康萊特注射液與空白組相比也具有顯著性差異。疼痛抑制率-(生理鹽水組扭體均數-藥物扭體均數)/生理鹽水組扭體均數表1化合物I、II對醋酸致大鼠扭體反應的影響扭體次數扭體抑制率組另u前15min后15min前15min后15mi空白組20.25±5.615.13±7.8陽性組6.75±1.6"9.25±4,460.660.37白芍雙苷注射液12.1±6.9'9.625±3.960.450.36化合物I9.4±2.9.7.2±2.070.560.54化合物II8.6±3.9'6.9±3.930.580.55*:p<0.05，**:p<0.01，均與空白組比較2.化合物I、II的鎮痛作用一小鼠熱板實驗實驗方法實驗前首先篩選小鼠，將反應潛伏期小于5秒，大于30秒者剔除，取合格雌性小鼠90只，隨機分為空白對照組，陽性對照組，白芍雙苷注射液組(50mg/kg)、化合物I組(50mg/kg)及化合物II組(50mg/kg),每組各18只動物，給藥前測定兩次痛閾值(兩次間隔5分鐘)，取其均值為其基礎痛閩值，分別尾靜脈注射生理鹽水，陽性藥(康萊特注射液)，白芍雙苷注射液，化合物I的鹽溶液及化合物II的鹽溶液。給藥后15、30、45、60、90分鐘分別將小鼠置于54.5*C±0.5'C的恒溫熱板上，以小鼠舔后足為痛反應指標，測定其痛閾值，并計算出痛閾提高百分率。如表2、3所示陽性組與給藥組均表現出顯著的陣痛趨勢。7痛閾提髙百分率=(給藥后痛閾值-基礎痛閾值)/基礎痛閾值表2化合物I、II鎮痛作用(小鼠熱板法)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:p〈0.05**:p〈0.01，與各自給藥前比較表3化合物I、n痛閾提高百分率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例2:干燥芍藥藥材切片1Kg，用水煮沸提取2次，每次2小時，提取液過濾后通過反向吸附樹脂柱，再用醇-水溶液(50%)洗脫，洗脫液濃縮后用氧化鋁柱層析，得富含蒎烷類單萜苷的提取物12.5g(經液相檢測芍藥內酯苷含量為42.2%)。蒎烷類單萜苷的提取物5g,溶解后加入到已培養48h的菌體[梅林青霉3.4474(xxl)]發酵液中，繼續培養72h后取下搖瓶。發酵液抽濾去除菌絲體，濾液減壓濃縮至小體積，用等量乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并后減壓濃縮，真空干燥得12g粗粉。將該粗粉用甲醇溶解，拌入36glOO-140目硅膠，揮發溶劑至干，待上樣。取200g200-30G目硅膠，濕法裝柱，然后加入拌樣硅膠，進行柱層析。以二氯甲烷甲醇梯度洗脫(20:1，15:1,12:1),分段收集，經TLC檢測，收集12:1洗脫部分，得白色粉末1040mg(收率63%)即為化合物I。實施例3:化合物I500mg，溶解后加入到已培養48h的菌體[總狀共頭霉3.264(xxl)]發酵液中，繼續培養72h后取下搖瓶。發酵液抽濾除去菌絲體，濾液減壓濃縮至小體積，用等量乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并后減壓濃縮，真空干燥得600mg粗粉。將該粗粉用甲醇溶解，拌入1.8gl00-140目硅膠，揮發溶劑至干，待上樣。取24g200-300目硅膠，濕法裝柱，然后加入拌樣硅膠，進行柱層析。以二氯甲烷甲醇(30:l)為洗脫劑，分段收集，經TLC檢測，合并單點，得白色粉末200mg(收率70%)即為化合物II。實施例4:化合物12.5g，與微晶纖維素2.25g及硬脂酸鎂0.25g混合，混合物用于打片，每片重0.2g，每片含化合物10.lg。實施例5:膠囊劑的制備化合物II2.5g,與玉米淀粉2.5g,加水制成軟材，過12目篩造粒，干燥，制得顆粒，裝入膠囊，每粒膠囊內容物重0.2g，含化合物IIO.lg。實施例6:顆粒劑的制備化合物II2.5g,淀粉5.Og,糖粉2.0g。將化合物I、藥用淀粉和糖粉分別過IOO目篩后混合均勾，用適量乙醇制粒，于60度干燥，經整粒機整粒，分裝即得。實施例7:注射劑的制備化合物I2.Og，甘油20mi，注射用水200ml。將處方量化合物I加入20%甘油溶液100ml中，攪拌至溶解，加入1%。活性炭，6(TC加熱攪拌30min，過濾，補加注射用水至200ml,無菌條件下0.22pm微孔濾膜過濾，灌裝于5ml^瓿中,封口，115。C滅菌30min。權利要求1、一類新的單萜類化合物，其特征在于化合物具有如下所示的結構通式。2、如權利要求l所述的一類新的單萜類化合物，其特征在于當R為葡萄糖基時，其化合物為(1R，3A4A6《9i)-6-甲基-4-羥基-1-(p-D-葡萄吡喃糖氧基)-9-(羥甲基)-7-氧代三環[4.3.0.03'9]壬烷-8-酮(I)，當R為H時，其化合物為(1R,3A4A6《9》-6-甲基-l，4-二羥基-9-(羥甲基)-7-氧代三環[4.3.0.03'9]壬烷-8-酮(II)。3、一種如權利要求1或2所述的一類新的單萜類化合物的制備方法，其特征在于化合物(I)的制備方法為以富含蒎烷類單萜苷的提取物為底物，利用產羧酸酯酶的微生物對底物進行生物轉化，用乙酸乙酯對發酵液中的轉化產物進行萃取、利用硅膠柱層析進行轉化產物的制備分離；化合物(II)制備方法為以化合物I為底物，利用產葡萄糖苷酶的微生物對底物進行生物轉化，用乙酸乙酯對發酵液中的轉化產物進行萃取、利用硅膠柱層析進行轉化產物的制備分離。4、如權利要求1或2所述的一類新的單萜類化合物，其特征在于該類化合物可與藥學可接受的載體結合制成各種單方藥物制劑。5、如權利要求1所述的一類新的單萜類化合物在制備鎮痛藥物中的應用。全文摘要本發明屬于醫藥
技術領域：
，公布了一類新的單萜類化合物及其制備方法。化合物I由富含蒎烷類單萜苷的提取物經產羧酸酯酶的微生物轉化，并利用硅膠柱層析方法對轉化產物進行分離制備。化合物II由化合物I經產葡萄糖苷酶的微生物轉化，并利用硅膠柱層析方法對轉化產物進行分離制備。化合物I和化合物II的化學名分別為(1R，3R，4R，6S，9S)-6-甲基-4-羥基-1-(β-D-葡萄吡喃糖氧基)-9-(羥甲基-7-氧代三環[4.3.0.0^3，9]壬烷-8-酮和(1R，3R，4R，6S，9S)-6-甲基-1，4-二羥基-9-(羥甲基-7-氧代三環[4.3.0.0^3，9]壬烷-8-酮。藥理實驗表明本發明公布的兩個單萜化合物具有良好的鎮痛效果。本發明的制備方法簡單，成本低，對環境污染小。文檔編號C12P19/60GK101555237SQ20091013822公開日2009年10月14日申請日期2009年5月6日優先權日2008年5月9日發明者偉劉,燕孫,徐秀玲,松游,靜趙,鄭亞明申請人:沈陽藥科大學