核酸分子和鑒別gpr84活性調節劑的方法

專利名稱：：核酸分子和鑒別gpr84活性調節劑的方法核酸分子和鑒別GPR84活性調節劑的方法
背景技術：
：在整個動物王國中，從簡單的后生動物到最復雜的脊椎動物，都存在味覺信號轉導。據信味覺是由受體介導的，即促代謝受體或收縮性受體。表達味覺受體的細胞在接觸某些化學刺激時，除極化產生動作電位，由動作電位觸發感覺而引起味覺。這樣，味覺受體特異性識別能夠引起特定味覺的分子。這些分子在這里也被稱為"促味劑"。許多味覺受體屬于7個跨膜受體的超家族(Hoon等，(1999)Cell,96:451;Adler等，(2000)Cell,100:693)，也稱為G蛋白偶聯受體(GPCR)。據信其他味道是由通道蛋白介導的。許多這些受體的生物化學分析和分子克隆揭示了關于這些受體功能的基本原理。例如，美國專利5,691,188描述了配體如何結合GPCR，假定該受體發生構象變化而導致G蛋白的活化。G蛋白包括三個亞單位脒基核苷酸結合a亞單位、P亞單位和Y亞單位。當GDP結合時，G蛋白以異質三聯體形式存在，即Ga^復合物。當GTP結合時，a亞單位從異質三聯體解離，形成GJ^復合物。當Ga(3Y復合物與細胞膜中活化的G蛋白偶聯受體可操作地相關聯時，GTP對結合的GDP的交換速率增加，結合的Ga亞單位從Ga^復合物解離的速率增加。因此，游離的Ga亞單位和G(3Y復合物能夠將信號傳遞到各種信號轉導通路的下游元件。這些事件形成不同細胞信號轉導現象的多樣性的基礎，包括例如鑒別為神經感覺(例如味覺和/或嗅覺)的信號轉導現象。據信哺乳動物具有5種基本的味覺樣態，甜、苦、酸、咸和鮮(谷氨酸鈉的味道)。例如參見，Kinnamon等，(1992)Ann.Rev.Physiol.54:715-31;Lindemann(1996)Physiol.Rev.76:718-66;Stewart等，(1997)Am.JPhysiol.272:1-26。大量動物的生理學研究表明，味覺受體細胞可以對不同的化學刺激選擇性地作出響應。例如參見，Akabas等，(1988)Science242:1047-50;Gilbertson等，(1992)J.Gen.Physiol.100:803-24;Bernhardt等，(1996)J.Physiol.4卯:325-36;Cummings等，(1996)J.Neurophysiol.75:1256-63。關于味覺細胞功能的精神物理和生理學大多已知。因此，新型味覺受體和味覺信號轉導分子的鑒別與分離將實現味道轉導通路的化學和遺傳調節的新方法。例如，利用受體和通道分子可以實現高親和力激動劑、拮抗劑、反相激動劑和味覺活性調節劑。這些味覺調節性化合物可用于藥品和食品工業以改善各種消費品的味道，或阻斷不希望的味道，例如在某些藥物中。各種人和其他真核化學感受受體的完整或部分序列是已知的。參見例如，Pilpel和Lancet(1999)ProteinScience8:969-977;Mombaerts(1999)Annu.Rev.Neurosci,22:487-50;Wang等，(2006)J.Biol.Chem.M608019200。也可見于，美國專利5,874,243，WO92/17585，WO95/18140，WO97/17444，WO99/67282和WO2007/027661。此外，已進行G蛋白偶聯受體如GPR84的配體的鑒別。參見Wang等，(2006)同上；WO2007/027661;和美國專利申請號2007/0196867。發明概述本發明涉及一種編碼CD36、Gqi9和/或G蛋白偶聯受體84(GPR84)蛋白的分離的核酸分子。本發明也包括能使CD36、Gqi9和GPR84誘導型或組成型表達的表達載體，以及共表達CD36、Gw和GPR84蛋白的分離的重組宿主細胞。本發明還涉及鑒別GPR84活性調節劑的方法。該方法包括使共表達CD36、G^和GPR84蛋白的重組宿主細胞與測試化合物相接觸并測定測試化合物對GPR84活性的功能性影響從而鑒別GPR84的調節劑。發明詳述本發明提供了編碼G蛋白偶聯受體84(GPR84)、CD36和Gqi9的分離核酸分子及其在鑒別GPR84的配體(例如激動劑和拮抗劑)中的應用。具體說，本發明涉及作為脂肪味受體的GPR84及其在模擬脂肪味的化合物的篩選試驗中的應用。本文所用術語"分離"表示核酸分子時是指不同于天然存在的純化或濃縮狀態的核酸分子。根據本領域技術人員已知的各種方法和過程，本文所述的核酸分子可以是分離的或者與它們通常不相關的結構或化合物相關聯。GPR84已被鑒定為中鏈游離脂肪酸的受體(Wang等，(2006)同上)。許多物種中存在GPR84蛋白，包括人、小鼠、大鼠等，根據本發明可使用編碼這些蛋白質中任何一種的核酸分子。在這方面，本發明包括表1所列編碼GPR84蛋白的核酸分子。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*%相同性基于與人GPR84蛋白的比對。在一些實施方式中，核酸分子編碼人G2R84蛋白。在其它實施方式中，核酸分子編碼SEQIDNO:1的人GPR84蛋白。在具體實施方式中，編碼人GPR84蛋白的核酸分子如SEQIDNO:9所示。功能上說，本文所述的GPR84蛋白是相關的7個跨膜區的G蛋白偶聯受體家族的成員，據信參與味覺轉導。結構上說，GPR84家族成員的核苷酸序列可編碼相關蛋白，包括胞外區、7個跨膜區和胞質區。來自其他物種的相關GPR84家族成員在長度至少約50個氨基酸殘基，任選IOO、200、300或更多個氨基酸殘基的區域內與SEQIDNO:1，3，5或7有至少約為60%、70%、800/o或90%的蛋白質序列相同性。GPR84氨基酸序列的特定區域可用于鑒別GPR84家族成員的多態性變體，種間同系物和等位基因。這種鑒別可體外進行，例如在嚴格雜交條件下或PCR(如，采用編碼GPR84共有序列的引物)，或通過使用計算機系統中的序列信息與其他核苷酸序列進行比對。單一物種群體內GPR84基因的不同等位基因也可用于確定等位基因序列的差異是否與群體成員間的味覺差異有關。經典的PCR型擴增和克隆技術可用于分離同源基因，例如簡并足以檢測物種間的相關基因的引物，通常比單一物種內GPR84家族的共生同源成員具有更高水平的相同性。通常，GPR84家族的多態性變體和等位基因的鑒別可通過比較約25個氨基酸或更多，例如50-100個氨基酸的氨基酸序列來進行。至少約60%，70%，75%，80%，85%，90%，95-99%，或更高的氨基酸相同性通常表明，蛋白質是T1R家族成員的多態性變體、種間同系物、或等位基因。序列比對可采用任何常規序列對比算法進行。特異性結合GPR84多肽的抗體或其保守區域也可用于鑒別等位基因、種間同系物和多態性變體。本發明的一個方面中，GPR84核苷酸序列如下atgtggaacagctctgacgccaacttctcctgctaccatgagtcgtgctcaccctactggccttggccatccagcccaagctccgtacccgattcaacctgetcatagccaacctcacactggctgatctcctctactgcacgctccttcagcccttctctgtggacacctacctccacctgcactgaccctctgcctcatcgcactgggacgctacctcctcattgcccaccctaagctttttccccaagttttcagtgccaaggggatagtgctggcactggtgagcacctgggttgtgggcgtggccagctttgctcccctaccaccatcctcatgggcatctactttgtgcttgggctcagcagtgttggcatcttctattgcctcatccggacccagtgaggggatttcatctgagccagtcagtgctgccaccacccagaccctggaaggggactcatcgaatgtgttttgctgtgttcctctgctttgccctgagctacatccccttcttgctgctcaacattctggcaaccctgtgctctatgcagccatgaaccgccaattccgccaagcatatggctccattttaaaaagagggccccggagtttccataggctccattag本發明的一個方面中，GPR84氨基酸序列如下ILMGIYFVLGLSSVGIFYCL工HRQVKRAAQALDQYKLRQASIHSNHVARTDEAMPGRFQELDSRLASGGPSEGISSEPVSAATTQTIiEGDSSEVGDQINSKRAKQMAEKSPPEASAKAQPIKGARRAPDSSSEFGKVTRMCFAVFLCFALSYIPFLLLNILDARVQAPRWHMLAANLTWLNGC工NFVXYAAMNRQFRQAYGSILKRGPRSFHRLH除GPR84之外，本發明的核酸分子還編碼由G蛋白(Xq亞單位組成的嵌合鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)，其中C-端9個殘基被G蛋白質ai亞單位的對應部分取代。該嵌合G蛋白稱為Gqi9，是本領域已知的，參見Parmentier等，(1998)Mol.Pharmacol.53(4):778-86;Perroy等，((2001)J.Biol.Chem.276:45800-45805)對于磷脂酶C的偶聯受體的描述。通過示例的方式，GENBANK登錄號NP—002063.2(SEQIDNO:IO)所示Gq亞單位的9個C端氨基酸殘基被G蛋白(Xi亞單位的9個C端氨基酸殘基，即被Asn-Asn-Leu-Lys-Asp-Cys-Gly-Leu-Phe(SEQIDNO:ll)取代。雖然本發明中優選采用人Gq亞單位，但也可使用非人Gq亞單位。例如，表2所列的Gq亞單位適用于本發明。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*%相同性基于與人Gq蛋白亞單位的比對。根據本發明使用的Gq亞單位優選在長度至少約50個氨基酸殘基，任選地長度IOO、200、300或更多個氨基酸殘基的區域內與SEQIDNO:10，13或15具有至少約90。/。蛋白質序列相同性。如GPR84所述，可采用許多常規方法，采用嚴格雜交條件或抗體交叉反應來鑒別相關序列。在本發明的一個方面中，下文所示為嵌合蛋白——人鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G(q)a亞單位，其最后的9個殘基被鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G(i)a亞單位所取代atgactctggagtccatcatggcgtgctgcctgagcgaggaggccaaggaaagctgctgctgctcgggacaggagagagtggcaagagtacgtttatcaagcagatgagaatcatccatgcaattagttcgagaagttgatgtggagaaggtgtctgcttttgagaatccatatgtagatgcaataaagagtttctagtagcgcttagtgaatatgatcaagttctcgtggagtcagacaatgagaaccgaatggaggaaaccccagagagatgcccaggcagcccgagaattcattctgaagatgttcgtggacctgaacccagacagttcaaggacaccatcctccagaacaacctgaaggactgcggcctcttctaa在本發明的一個方面中，Gqi9的氨基酸序列如下MTLESIMACCLSEEAKEARRINDEIERGLRRDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGSGYSDEDKRGFTKLVYQNIFTAMQAMIRAMDTLKIPYKYEHNKAHAQLVREVDVEKVSAFENPYVDAIKSL麗DPG工QECYDRRREYQLSDSTKYYLNDLDRVADPAYLPTQQDVL本發明核酸分子中還包括編碼CD36的序列。已提出GPR120和CD36形成脂肪酸接收的獨立途徑(Matsumura等，(2007)Biomed.Res.28:49-55)。而且，考慮CD36還與GPR84在脂肪酸轉運和飲食脂質的傳感中聯合起作用。因此，本發明涵蓋CD36與GPR84和Gqi9的共表達。雖然本發明優選采用人CD36，但也可使用非人CD36。例如，表3所列的CD36蛋白適用于本發明。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*%相同性基于與人CD36蛋白的比對。既然本文所述的CD36蛋白用作脂肪酸轉運蛋白，本發明涵蓋了在長度至少約50個氨基酸殘基，任選地長度100、200、300或更多個氨基酸殘基的區域內與SEQIDNO:17，19或21具有至少約90%蛋白質序列相同性的其他CD36蛋白。本發明的一個方面中，CD36核苷酸序列如下tattctaatgccagttggagacctgcttatccagaagacaattaaaaagcaagttgtcctcgaagaaggtacaattgcttttaaaaattgggttaaaacaggcacagaagtttacagacagttttggatctttgatgtgcaaaatccacaggaagtgatgatgaacagcagcaacattcaagttaagcaaagaggtccttatacgtacagagttcgttttctagccaaggaaaatgtaacccaggacgctgaggacaacacagtctctttcctgcagcccaatggtgccatcttcgaaccttcactatcagttggaacagaggctgacaacttcacagttctcaatctggctgtgttccgtaccctgttactaccacagttggtctgttttatccttacaacaatactgcagatggagtttataaagttttcaatggaaaagataacataagtaaagttgccataatcgacacatataaaggtaaaaggaatctgtcaatgcaaagaagggagacctgtgtacatttcacttcctcattttctgtatgcaagtcctgatgtttcagaaggtgatgagsaggcaaacatgttcagaagtcaagtaactggaaaaataaacctccttggcctgatagaaat在本發明的一個方面中，CD36的氨基酸序列如下:MGCDRNCGL工AGAVIGAVLAVFGGILMPVGDLLIQKTIKKQWLEEGT工AFKNWVKTGTEVYRQFW工FDVQNPQEVMMNSSNIQVKQRGPYTYRVRFLAKENVTQDAEDNTVSFLQPNGAIFEPSLSVGTEADNFTVLNLAVAAASH工YGN(2FVQMILNSL工NKSKSSMFQVRTLRELLWTIGDEKANMFRSQVTGKINLLGLIEMILLSVGVVMFVAFMISYCACRSKTIK本發明蛋白質的氨基酸序列可通過編碼核酸序列的推定翻譯來鑒別。這些氨基酸序列和編碼核酸序列可采用許多方法相互比較或與其他序列進行比較。例如，在序列比對中，通常一個序列用作參比序列，測試序列與其進行比較。采用序列比較算法時，將測試序列和參比序列輸入計算機，如果需要設定坐標軸，然后指定序列算法程序參數。可使用BLASTN和BLASTP程序的默認程序參數，如下所述，或者指定參數。然后序列比較算法基于程序參數計算測試序列相對于參比序列的百分序列相同性。本文所用"比較窗"包括在毗連位置數例如20-600，通常約50-200或約100-150個位置中的任一個區段內，最佳排列后將序列與相同毗連位置數的參比序列進行比較。用于比較的序列的排列方法是本領域所公知的。用于比較的序列的最佳排列可通過以下方法實現，例如Sm池和Waterman的局部同源性算法((1981)Adv.Appl.Math.2:482)，Needleman和Wunsch的同源性比對算法((1970)J.Mol.Biol.48:443)，Pearson和Lipman的搜索相似性方法((1988)Proc.Natl.AcadSci.USA85:2444)，這些算法的計算機化實現(威斯康星遺傳軟件包(VisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳計算機公司(GeneticsComputerGroup),威斯康星州麥迪遜)，或通過手動比對和視覺檢查(參見例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(最新分子生物學實驗方法)(1995)Ausubd等編，增補本)。適用于測定百分序列相同性的算法的一個優選的例子是BLAST和BLAST2.0算法，參見Latched等，(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等，(1990)J.MolBiol.215:403-410的描述。進行BLAST分析的軟件通過生物技術信息國立中心公眾可得。該算法包括首先通過鑒別詢問序列中長度W的短字來鑒別高得分序列對(HSP)，與數據庫序列中相同長度的字對齊時匹配或滿足某一正值閾得分T。T表示鄰域字得分閾值(Altschul等，(1990)同上；Altschul等，(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402)。這些初始鄰域字值(wordhit)用作啟動搜索的種子以發現包含它們的較長的HSP。該字值沿各個序列雙向延伸直到累積比對得分增加。累積得分是采用核苷酸序列，參數M(對于一對匹配的殘基的犒賞得分；總是>0)計算的。對于氨基酸序列，采用評分矩陣來計算累積得分。當累積比對得分從其最大實現的值下降量X時；由于一種或多種負評分殘基比對的累積而導致累積得分變成零或零以下時；或者到達序列末端時，字值沿各個方向的延伸停止。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默認值為字長(W)11，期望值(E)10，M=5，N=4，兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP采用的默認值為字長3，期望值(E)10，BLOSUM62評分矩陣(參見，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nati.Acad.Sci.USA89:10915)為比對(B)50，期望值(E)IO，M=5，Nz=4，兩條鏈的比較。有用的算法的另一個例子是PILEUP。PILEUP采用進行性配對比對產生來自相關序列組的多重序列比對以顯示關系和百分序列相同性。它還繪制所謂的"樹"或"樹圖"，顯示用于產生比對的成簇關系。PILEUP采用Fang和Doolittle((1987)J.Mol.Evol.35:351-360)的進行性比對方法的簡化形式。所用方法類似于Higgins和Sharp((1989)CABIOS5:151-153)所述的方法。程序可比對至多300個序列，各自的最大長度為5000個核苷酸或氨基酸。多重比對程序從兩個最相似序列的配對比對開始，產生兩個比對序列的簇。然后將該簇與下一最相關序列或比對序列的簇進行比對。兩個序列簇通過兩個單獨序列的配對比對的簡單延伸進行比對。最終的比對可通過一系列進行性配對比對來實現。該程序的運行包括指定具體序列及其氨基酸或核苷酸坐標軸中用于序列比較的區域，并指定程序參數。采用PILEUP，將參比序列與其他測試序列進行比較以確定百分序列相同性關系，參數如下默認間隙權重(3.00)，默認間隙長度權重(0.10)和加權端隙。PILEUP可從GCG序列分析軟件包(Devereaux等，(1984)Nuc.AcidsRes.12:387-395)獲得。如本文所示，采用BLASTP算法進行的本發明人蛋白質序列與公共序列數據庫中的所有已知蛋白質的比較表明，與人序列具有至少約80%氨基酸相同性的其他GPR84、G。亞單位和CD36蛋白具有強同源性。作為直接氨基酸或核酸序列比較的替代方式，合適的GPR84、Gq亞單位和CD36蛋白可通過嚴格雜交條件下的核酸分子(例如，表1-3所示的核酸分子或其探針)與其他種類的核酸(例如，基因組或cDNA序列)的雜交來鑒別。短語"嚴格雜交條件"表示通常在核酸的復雜混合物中，探針可與其靶序列雜交但不與其他序列雜交的條件。嚴謹條件是序列依賴性的，不同環境中不同。較長的序列在較高的穩定性同源性雜交。核酸雜交的詳細指導參見Tijssan(1993)，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,HybridizationwithNucleicProbes(生物化學與分子生物學技術，與核酸探針的雜交)，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays(雜交原理綜述與核酸分析戰略)"。通常，選定的嚴謹條件為在規定的離子強度、pH下，比特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-l(TC。Tm是平衡時50%的與靶互補的探針與靶序列雜交的溫度(在規定的離子強度、pH和核酸濃度下)(靶序列過量，TmT，平衡時50%的探針被占據)。嚴謹條件是鹽濃度小于約1.0M鈉離子，通常約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，pH7.0-8.3，對于短探針(例如10-50個核苷酸)溫度至少約為3(TC，對于長探針(例如大于50個核苷酸)溫度至少約為60°C。嚴謹條件也可通過加入去穩定劑甲酰胺來實現。為實現選擇性或特異性雜交，正信號是背景的至少2倍，任選10倍。示例性的雜交嚴謹條件如下50%甲酰胺，5XSSC和P/oSDS，在42。C孵育(或5XSSC，1%SDS，在65。C孵育)，在65i:用0.2XSSC和0.1%SDS洗滌。這種雜交和洗滌步驟可進行例如1、2、5、10、15、30、60分鐘或更長時間。嚴謹條件下未能相互雜交的核酸如果它們所編碼的多肽實質相關，則這些核酸仍然實質相關。例如當使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并產生核酸拷貝時發生上述情況。在這種情況下，核酸通常在中等嚴格雜交條件下雜交。示例性的"中等嚴格雜交條件"包括37。C在40%甲酰胺，1MNaCl，1%SDS的緩沖液中雜交，以及45"C在1XSSC中洗滌。這種雜交和洗滌步驟可進行例如1、2、5、10、15、30、60分鐘或更長時間。陽性雜交是背景的至少2倍。本領域普通技術人員容易明白，可采用替代的雜交和洗滌條件來提供類似的嚴謹性條件。由本發明可知，編碼本發明GPR84、Gq亞單位和CD36蛋白的核酸分子11可根據本領域公知的方法從許多來源分離得到，例如遺傳工程改造、擴增、合成和/或重組表達。本發明蛋白質的分離和表達過程如下所述。采用PCR引物擴增編碼GPR84、Gq亞單位和CD36蛋白核酸，可任選地產生和篩選這些核酸文庫以鑒別適用于蛋白質表達的核酸。擴增方法是本領域所公知的，包括例如聚合酶鏈反應，PCR(《PCR方案，方法與應用指導》(PCRProtocols,aGuidetoMethodsandApplications)(1990)，Innis編，學術出版社(AcademicPress),紐約)；和《PCR策略》(PCRStrategies)(1995)，Innis編，學術出版社(AcademicPress,Inc.),紐約)；連接酶鏈反應(LCR)(參見例如，Wu(1989)Genomics4:560;Landegren(1988)Science241:1077;Barringar(1990)，Gene89:117);轉錄擴增(參見例如，Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173);自動維持序列復制(參見例如，Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874);QP復制酶(QBetareplicase)擴增(參見例如，Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35:1477-1491);自動Q-P復制酶擴增試驗(參見例如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes10:257-271)和其他RNA聚合酶-介導的技術(例如，NASBA;看基因公司(Cangene)，安大略省米西索加(Mississauga，Ontario))。引物可設計成保留感興趣蛋白質的原始序列。或者，引物可編碼保守取代(例如，疏水取代疏水殘基)或功能良性取代(例如，不阻礙質膜插入，導致肽酶裂解，導致受體異常折疊等)的氨基酸殘基。一旦擴增，根據本領域已知的方法單獨或以文庫形式克隆核酸。事實上，操縱核酸的技術，例如在序列中產生突變、亞克隆、標記探針、測序、雜交等是科技文獻和專利文獻中公開描述的。參見例如，Sambrook編，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)(第2版)，第1-3巻，冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory)禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology(最親jf分子生物學實驗方法)(1997)Ausubel編，約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.),紐約。作為擴增和/或克隆的替代方式，可根據公知的化學合成技術來合成本發明的核酸，例如參見Carruthers(1982)ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.47:411-418;Adams(簡)Am.Chem.Soc.105:661;Belousov(1997)NucleicAcidsRes.25:3440-3444;Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19:373-380;Blommers(1994)10Biochemistry33:7886-7896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109所述。然后，合成互補鏈并使該連在適當條件下退火在一起而獲得雙鏈DNA片段，或者采用具有適當引物序列的DNA聚合酶，通過加入互補鏈而獲得雙鏈DNA片段。一旦獲得，將編碼GPR84、Gq亞單位和CD36蛋白的核酸引入重組蛋白表達的表達載體中。根據指定用途(例如，在表型或配體結合試驗中)，可釆用任何表達載體系統，除哺乳動物細胞外，包括例如細菌、酵母、昆蟲或植物系統。如本文所用，術語"表達載體"表示用于在任意細胞，包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞中，組成型或誘導型表達本發明核酸分子的任何重組表達系統。該術語包括線性或環形表達系統。該術語包括保持游離或整合到宿主細胞基因組內的表達系統。該表達系統具有自身復制的能力，或者不具有，即在細胞中僅短暫表達。該術語包括僅含有重組核酸轉錄所需最少元件的重組表達盒。為實現重組蛋白表達，要求本發明核酸可操作地連接于轉錄或翻譯控制元件，例如轉錄和翻譯引發序列，、啟動子和增強子、轉錄和翻譯終止子、聚腺苷酸化序列和用于將DNA轉錄成RNA的其他序列。在重組核酸分子和載體的結構中，啟動子可操作地連接一個或多個本發明的核酸分子，以介導所需核酸在細胞或組織的所有類型或亞類中的表達。"啟動子"定義為介導核酸轉錄的核酸陣列。如本文所用，啟動子包括陣列開始位置附近的必需核酸序列，例如對于聚合酶II型啟動子來說是TATA元件。啟動子也任選地包括遠端增強子或阻抑物元件，它們可離開陣列開始位置差不多幾千個堿基對的距離。在具體實施方式中，采用組成型或誘導型啟動子。"組成型"啟動子是在大多數環境和發育條件下具有活性的啟動子。組成型啟動子的例子包括但不限于P-肌動蛋白啟動子和CMV啟動子、"誘導型"啟動子是在環境或發育調節中具有活性的啟動子。誘導型啟動子的例子包括但不限于人c-fos啟動子、類固醇誘導型啟動子如糖皮質激素-誘導型啟動子和小分子誘導型啟動子如四環素調節的啟動子。術語"可操作地連接"表示核酸表達控制序列(例如啟動子，或轉錄因子結合位置的陣列)與第二核酸分子之間的功能性連接，其中表達控制序列介導對應于第二序列的核酸的轉錄。根據本發明的一些實施方式，將編碼GPR84、CD36和的核酸分子串聯引入一個表達載體中，用于在宿主細胞中以單獨蛋白質的形式表達。在其它實施方式中，將編碼GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子各自引入不同的表達載體中，用于在宿主細胞共表達。在另一些實施方式中，釆用編碼GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子的各種組合的兩個表達載體(例如，一個表達載體包含GPR84和Gqi9核酸，另一個表達載體包含CD36核酸)。此外，還考慮本發明蛋白質可以融合蛋白的形式表達，例如GPR84-Gqi9融合蛋白。將編碼GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子串聯引入表達載體，用于在宿主細胞中共表達單獨的蛋白質的情況下，一些實施方式包括使用一種用于調節所有三種蛋白質的表達的啟動子。這樣，編碼G2R84、CD36和Gqi9的核酸分子相互間被內部核糖體進入位點(IRES)隔離。IRES元件已知來自病毒和哺乳動物基因(Martinez-Salas(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10:458-64)，并且也已在小合成寡核苷酸的篩選中鑒別(Vankatesan禾卩Dasgupta(2001)Mol.Cell.Biol.21:2826-37)。已詳細分析來自腦心肌炎病毒的IRES(Mizuguchi等，(2000)Mol.Ther.1:376-82)。IRES是導致轉錄的RNA中真核核糖體可結合并啟動翻譯的結構的DNA中的編碼元件。IRES能夠從單個RNA分子產生兩種或更多種蛋白質(第一種蛋白質是5'-端封端結構處結合RNA的核糖體的翻譯得到的，(Martinez-Salas(1999)同上)。或者，其他實施方式包括將編碼GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子串聯引入一個表達載體中，其中各個蛋白質的編碼序列具有其各自的調節序列。這樣，本發明的具體實施方式包括順序含有以下序列的核酸分子啟動子CD36編碼序列一多聚腺苷酸信號一啟動子2—Gqi9編碼序列一多聚腺苷酸信號一啟動子3—GPR84編碼序列一多聚腺苷酸信號，其中啟動子w可相同或不同，或者誘導型或組成型。將表達載體，用于共表達GPR84、CD36或Gqi9蛋白的單獨的表達載體，或者含有編碼GPR84、CD36和Gqi9蛋白的核酸的一個表達載體引入宿主細胞基因組中或引入胞質或細胞核中，通過科技文獻和專利文獻領域所公知的各種常規技術進行表達。例如參見，Roberts,(1987)Nature328:731;和Sambrook編，(1989)同上)。來自生物試劑和實驗設備生產商的產品信息也提供了關于已知的生物方法的信息。載體可從天然來源分離，從諸如ATCC或GENBANK文庫等來源獲得，或者通過合成或重組方法制備。本發明的核酸可以在細胞中穩定或短暫維持的表達盒或載體(包括質粒和病毒)中表達(例如游離型表達系統)。可將選擇標記物引入表達盒和載體中，以賦予轉化細胞和序列以可選擇的表型。例如，選擇標記物可編碼游離型維持與復制，從而不再要求整合到宿主基因組中。例如，標記物可編碼抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素)或除草劑抗性(如，氯磺隆(chlorosulfiiron))以實現用所需DNA序列轉化的那些細胞的選擇(參見例如，Blondelat誦Rouault(1997)，Gene190:315-317;Aubrecht(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281:992-997)。本發明范圍內還包括用于共表達本發明蛋白質的重組宿主細胞。據稱本發明的蛋白質"共表達"，因為用編碼GPR84、CD36或Gqi9蛋白的核酸轉染時，宿主細胞轉錄和翻譯GPR84、CD36或Gqi9蛋白。"宿主細胞"表示包含表達載體并且支持表達載體的復制或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母，昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞如CHO、HeLa、HEK-293等，例如培養的細胞、外植體和體內細胞。如上所述，宿主細胞可以是哺乳動物或非哺乳動物細胞，優選哺乳動物宿主細胞。可使用將本發明表達載體引入宿主細胞的任何公知的方法。這些方法包括利用磷酸鈣轉染、凝聚胺(polybrene)、原生質體融合、電穿孔、脂質體、顯微注射、等離子體載體，病毒載體以及用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其他外來遺傳物質引入宿主細胞的任何其他公知方法(參見例如，Sambrook等，同上)。將表達載體引入宿主細胞之后，在有利于本發明蛋白質的表達的條件下培養經轉染的細胞。共表達來自一個或多個表達載體的GPR84、CD36或Gqi9蛋白的本發明的宿主細胞可用于分析脂肪酸轉運和感應飲食脂質以及鑒別調節GPR84活性的試劑的方法中。因此，本發明也提供了篩選GPR84活性調節劑的方法，例如活化劑、抑制劑、刺激劑、增強劑、激動劑和拮抗劑。這些GPR84活性的調節劑可用于味覺信號轉導途徑的藥理學、化學和遺傳調節。這些篩選方法可用于鑒別味細胞活性的高親和力激動劑和拮抗劑。這些調節性化合物可以在食品和藥品工業15中用于定制味道，例如調節食品的味道。GPR84活性的"抑制劑"、"活化劑"和"調節劑"可互換使用，表示用本發明試驗鑒別的抑制性、活化性或調節性分子。抑制劑是例如結合，部分或完全阻斷刺激、降低、防止、延遲活化、滅活、脫敏或下調GPR84活性的化合物，例如拮抗劑。活化劑是例如結合、刺激、提高、打開、活化、促進、增強活化、致敏、或上調GPR84活性的化合物，例如激動劑。調節劑也包括例如改變受體與結合活化劑或抑制劑、G蛋白或激酶的胞外蛋白間相互作用的化合物。抑制劑或活化劑的試驗包括例如，在細胞或細胞膜中表達GPR84、CD36和G^，施加假定的調節劑化合物，然后測定對味覺轉導的功能性影響。將對潛在的活化劑、抑制劑或調節劑的試驗結果與沒有抑制劑、活化劑或調節劑的對照樣品進行比較，以檢査GPR84活性的調節程度。將對照樣品(未用調節劑處理)的相對GPR84活性值設定為100%。當GPR84活性值相對于對照約為80%，任選地50%或25-0%時，實現GPR84的抑制。當GPR84活性值相對于對照為110%，任選地150%，任選地200-500%，或1000-3000%時，實現GPR84的活化。因此，本發明提供了檢測和表征味覺調節的試驗，其中使用GPR84作為報告分子以確定調節劑對脂肪酸味覺轉導的功能性影響。試驗內容中調節GPR84活性的測試化合物的"功能性影響"包括間接或直接地受到受體影響，例如功能、物理和化學影響的任何參數的確認。包括配體結合、離子流的改變、膜電位、電流量、轉錄、G蛋白結合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信號轉導、受體-配體相互作用、第二信使濃度(例如，cAMP、cGMP、lP3或胞內Ca")。試驗內容中"確定功能性影響"表示在GPR84的影響，例如功能、物理和化學影響下，間接或直接地增加或降低參數的化合物的試驗。這些功能性影響可通過本領域技術人員已知的任何方式進行測定，例如分光光度特征的改變(例如熒光、吸收度、折射率)、流體動力學特征(例如，形狀)、色譜特征或溶解度特性；膜片鉗；壓敏染料；全細胞電流；放射性同位素通量；誘導型標記物；配體結合試驗；電壓、膜地位和導電性改變；離子流試驗；胞內第二信使如cAMP、CGMP和肌醇三磷酸(IP3)的改變；胞內鈣水平的改變；等等。味覺受體結合促味劑并啟動化學刺激向電信號的轉導。活化或抑制的G蛋白質將改變目標酶、通道和其他效應蛋白的性質。一些例子是視覺系統中轉運蛋白導致的CGMP磷酸二酯酶的活化，刺激性G蛋白導致的腺苷酸環化酶的活化，Gq和其他關聯G蛋白導致的磷脂酶C的活性，以及Gi和其他G蛋白導致的各種通道的調節。也可由磷脂酶C導致的二酰甘油和IP3的產生，IP3導致的鈣運動來檢查下游結果。因此，在一個實施方式中，通過檢測宿主細胞中FURA-2-依賴性熒光監測胞內鈣的變化來檢測GPR84的活化。活化的GPCR受體成為將受體C端尾部(以及可能的其他位點)磷酸化的激酶的底物。因此，活化劑可促進"P從Y標記的GTP轉移到受體，可用閃爍計數器進行分析。C端尾部的磷酸化將促進抑制蛋白(arrestin)樣蛋白質的結合并干擾與G蛋白質的結合。激酶/抑制蛋白途徑在許多GPCR受體的脫敏過程中起關鍵作用。例如，調節味覺受體持續時間的化合物保持活性可用作延長所需味道或切斷令人不快味道的方式。GPCR信號轉導的一般綜述以及分析信號轉導的方法可參見例如，《酶學方法》(MethodsinEnzymology)，第237和238巻(1994)和第96巻(1983);Bourne等，(1991)Nature10:349:117-27;Bourne等，(1990)Nature348:125-32;Pitcher等，(1998)Annu.Rev.Biochem.67:653-92。如上所述，可進行離子流分析以確定化合物是否能夠調節GPR84活性。離子流的變化可通過測定表達GPR84蛋白的細胞或膜的離子極化(即電位)來評價。測定細胞極化變化的一種方式是用壓片鉗和膜片鉗技術測量電流變化(從而測量極化的改變)(參見例如，Ackerman等，(1997)NewEngl.JMed.30336:1575-1595)。采用表征方法可方便地測定全細胞電流。其他已知的試驗包括放射性標記的離子流試驗和利用壓敏染料的熒光試驗(參見例如，Vestergarrd-Bogind等，(1988)J.MembraneBiol.88:67-75;Gonzales&Tsien(1997)Chem.Biol.4:269-277;Daniel等，(1991)J.Pharmacol.Meth.25:185-193;Holevinsky等，(1994)J.MembraneBiology137:59-70)。一般來說，待測化合物的濃度在從1pM到100mM的范圍內。測試化合物對GPR84功能的影響可通過檢查上述任一種參數來測定。影響GPCR活性的任何合適的生理學變化可用于評價測試化合物對GPR84的影響。用完整細胞或動物測定功能結果時，也可測量諸如遞質釋放、激素釋放、已知和未表征遺傳標記物的轉錄變化(northem印跡)、細胞代謝改變(例如細胞生長或pH變化)、胞內第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的變化等各種影響。GPCR的優選試驗包括負載離子或壓敏染料以報告受體活性的細胞。測定這種受體活性的試驗也可采用其他G蛋白偶聯受體的己知激動劑和拮抗劑作為陰性或陽性對照以評價測試化合物的活性。在鑒別調節性化合物(例如激動劑、拮抗劑)的試驗中，使用離子敏感或膜電壓熒光指示劑分別檢測胞質中離子水平或膜電壓的變化。可使用的離子敏感指示劑和電壓探針包括在分子探針(MolecularProbes)1997目錄中列出的那些。其他試驗包括測定受體活性，當受體活化時，通過激活或抑制諸如腺苷酸環化酶之類的酶，可導致胞內環狀核苷酸如cAMP或cGMP的水平發生變化。存在環狀核苷酸門控離子通道，例如桿狀感光細胞通道和嗅神經元通道，cAMP或cGMP結合后陽離子可滲透(例如參見，Altenhofan等，(1991)Proc.NatlAced.Sci.USA88:9868-9872和Dhallan等，(1990)Nature347:184-187)。試驗中，當受體活化導致環狀核苷酸水平降低時，優選使細胞暴露于能夠增加胞內環狀核苷酸水平的試齊U，例如福斯高林(forskolin)，然后在細胞中加入受體活化化合物。該類試驗中的細胞可以是用環狀核苷酸包圍的(cyclicnucleotide-crated)離子通道編碼DNA、GPCR磷酸酶和受體(例如，某些谷氨酸鹽受體、蕈毒堿乙酰膽堿受體、多巴胺受體、5-羥色胺受體等)編碼DNA共轉染宿主細胞制備的，所述受體激活后可導致胞質中環狀核苷酸水平改變。此外，熒光標記的脂肪酸經CD36的攝取可用作活性標志。該試驗可從分子裝置公司(MolecularDevices)(加利福尼亞州桑尼維爾(Sunnyvale，CA))等來源商業獲得，與FLIPR—起使用。也可使用表達GPR84的非人動物進行受體分析。這種表達可用于確定測試化合物在體內是否能夠特異性結合哺乳動物味覺跨膜受體多肽，該過程包括使測試化合物與用本發明核酸分子穩定或短暫轉染的非人動物相接觸，并通過測試化合物與受體多肽的特異性結合來確定動物對測試化合物是否有反應。用本發明載體轉染或感染的動物尤其適用于鑒別和表征能夠結合特定或一組受體的促味劑/配體的試驗。這些表達人化學感應受體序列的載體感染的動物可用于促味劑的體內篩選及其對細胞生理學(例如對味覺神經元)、對CNS或對行為的影響。感染/表達核酸和載體的方法是本領域公知的。通過許多方式可測定各種單細胞、器官或整個動物的參數。通過遞送感染試劑，例如腺病毒表達載體，本發明核酸分子例如可以在動物味覺組織中表達。檢測為GPR84調節劑的化合物可以是任何小分子化學物質或生物實體，例如蛋白質、核酸或脂質。通常，測試化合物是小化學分子和肽。本發明的試驗中基本上任何化學物質都可用作潛在的調節劑或配體，雖然常常使用溶于水性或有機(尤其是基于DMASO的)溶液的化合物。將設計試驗成篩選大型化學物質文庫，該過程包括自動進行試驗步驟并由任何方便來源向試驗提供化合物，通常平行進行(例如，在機器試驗中在微量滴定板上采取微量滴定模式)。應理解，存在許多化合物的供應商，包括西格瑪公司(Sigma)使蘇里州圣路易斯(St,Louis，MO))，阿爾德里奇公司(Aldrich)(密蘇里州圣路易斯)，西格瑪-阿爾德里奇公司(Sigma-AldrichX密蘇里州圣路易斯)，FCBA公司(FlukaChemika-BiochemicaAnalytika)(瑞士布咨(Buchs，Switzerland))等。在一個優選的實施方式中，高通量篩選方法包括提供含有大量潛在治療化合物(潛在調節劑或配體化合物)的組合化學或肽文庫。然后在如上所述的一種或多種試驗中篩選這些文庫，以鑒別那些具有所需特征性活性的文庫成員(具體的化學類型或亞類)。所鑒別的化合物可用作常規的"先導化合物"或者其本身可用作潛在的或實際的治療劑。根據本發明鑒別的GPR84調節劑可用于任何食品、糖果、藥物組合物或其成分中，從而以所需方式調節產品、組合物、成分的味道。19權利要求1.一種編碼CD36、Gqi9和G蛋白偶聯受體84(GPR84)蛋白的分離的核酸分子。2.包含如權利要求1所述的核酸分子的表達載體。3.如權利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述CD36、Gqi9和GPR84的表達為誘導型。4.如權利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述'CD36、Gqj9和GPR84的表達為組成型。5.—種共表達CD36、Gqi9和GPR84蛋白的分離的重組宿主細胞。6.—種鑒別GPR84調節劑的方法，所述方法包括使如權利要求5所述的重組宿主細胞與測試化合物相接觸，并測定所述測試化合物對GPR84活性的功能性影響，從而鑒別GPR84的調節劑。7.通過權利要求6所述方法鑒別的GPR84的調節劑。全文摘要本發明提供了編碼CD36、G_qi9和G蛋白偶聯受體84(GPR84)蛋白的分離的核酸以及共表達CD36、G_qi9和GPR84蛋白的載體和重組宿主細胞在鑒別GPR84活性調節劑中的應用。文檔編號C12N15/12GK101654676SQ20091016117公開日2010年2月24日申請日期2009年8月3日優先權日2008年8月1日發明者H·王,J·M·蒙特茲,S·A·格拉維納申請人:國際香料和香精公司