專利名稱：一株高效轉化L-谷氨酸為γ-氨基丁酸乳酸菌的選育的制作方法
技術領域：
一株高效轉化L-谷氨酸為Y-氨基丁酸乳酸菌的選育，屬于生物工程中發酵技術 領域。
背景技術：
Y-氨基丁酸又名 4-氨基丁酸(4-Aminobutanoicacid，4-AB，簡稱 GABA)和 γ-氨 酪酸，是在丁酸的Y位上有一個氨基，以非結合態的形式存在。它極易溶于水，不溶于醇、 醚和苯，可以通過化學法或生物合成，也可從食品中直接攝取得到補充。廣泛存在于自然 界，是一種非蛋白質組成的天然氨基酸，由谷氨酸(Glutamic acid, Glu)經谷氨酸脫羧酶 (Glutamatedecarboxylase, EC4. 1. 1. 15，簡稱GAD或GDC)催化而來，以自由態形式廣泛存 在于原核生物和真核生物中。是哺乳動物中樞神經系統中的重要的抑制性神經遞質，具有 重要的生理功能，已報道的生理活性有調節血壓、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活 力、增加生長激素分泌、健肝利腎、預防肥胖、鎮痛、解毒、促進乙醇代謝(醒酒)、改善更年 期綜合癥等多種功效。作為一種化學物質來說，早在1883年GABA就被人工合成。1950年有人發現哺乳 動物正常腦內的GABA的濃度很高，但生理意義不明。隨后，有人從牛腦中提取出一種能抑 制螯蝦牽張感受器神經元產生沖動提取液，發現其具有抗乙酰膽堿及對脈鼠和家兔的回腸 有收縮作用，并證明此提取液中起抑制作用的組分就是GABA。Segal SA等又證實GABA對 哺乳動物的中樞神經具有普遍抑制作用，將用離子電泳分離得到的GABA注射于貓皮層十 字溝周圍的神經元，可引起神經元的超極化，其電位與刺激皮層表面突觸所產生的抑制性 電位相同，并發現用電刺激貓的小腦浦氏細胞時第四腦室灌流液中的GABA含量增加3倍， 因而推測浦氏神經元釋放的化學遞質是GABA。但是，GABA的意義和作用被真正確認是在 1975年的第二屆國際GABA專題討論會上。在那次會議上，GABA被正式確認為哺乳動物中 樞的一種抑制性遞質。由于GABA有很高的生理功能和廣闊的應用前景，已受到世界學術和企業界越來 越多的注意和研究。歐美和日本等少數發達國家有很多研究人員從事GABA的研制開發工 作，并在其生理功效方面的研究處于領先水平。本發明篩選到高效轉化L-谷氨酸為Y -氨基丁酸的菌株，對該菌進行了鑒定，對 其轉化條件進行了初步研究，為微生物轉化L-谷氨酸為γ -氨基丁酸工業化提供了基礎。
發明內容
本發明的目的在于提供從自制酸菜中篩選到轉化L-谷氨酸為Y-氨基丁酸的菌 株，經紫外誘變后篩選得到高產Y-氨基丁酸的菌株，并對其進行了形態學與遺傳學方面 的鑒定，將該菌命名為LP-GB 01-21。對轉化產物Y-氨基丁酸進行了鑒定，為微生物轉化 L-谷氨酸為Y-氨基丁酸的工業化提供了有益的指導。本發明的技術方案一株轉化L-谷氨酸為Y-氨基丁酸的菌株，其分類命名為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)GB 01-21，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏 編號為 CCTCCM 209102。目的菌株的鑒定采用16S rDNA測序，與數據庫對照后鑒定該菌為植物乳桿菌 Lactobacillus ρIantarum0轉化菌株的篩選從自制酸菜取樣，分離進行初步篩選，斜面保藏。把培養好的 斜面種子活化后接種于種子培養基中，在30°C，靜置培養ld，離心收集菌體，用滅菌水洗滌 菌體。在IOOmL三角瓶中加入濕菌體0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸緩沖液(pH = 5. 0) 30mL,吐溫-80 0. Olgo于30°C、160r/min振蕩反應24h，氨基酸測定儀測定轉化液中 的Y-氨基丁酸含量。將轉化率高的留下進一步實驗，復篩得到一株轉化效果較好的菌株， 命名為LP-GBO1，并對其進行鑒定。通過進行形態觀察、生理生化實驗及分子生物學鑒定，確 定了該菌的分子水平的生物學地位。以該菌作為出發菌株進一步經紫外誘變篩選得到一株 高產Y-氨基丁酸的菌株，命名為LP-GB 01-21。所述菌株LP-GB 01-21的誘變選育方法，步驟為(1)轉化菌株的篩選從自制酸菜取樣，稀釋至不同的濃度，分別吸取0.2mL不同 濃度的菌懸液涂布于選擇性平板培養基上，肉眼挑出生長并有透明圈的單菌落，轉接于斜 面培養基保藏，以此野生菌株LP-GB 01作為出發菌株；(2)出發菌株生長曲線與紫外致死率曲線的制定誘變培養菌懸液置于15W的紫 外燈下，距離照射菌懸液30 11，照射0、158、308、458、608、758、908，制定致死率曲線，選擇 致死率在70% -90%的時間誘變；(3)初篩出發菌株經15W紫外燈下30cm處照射45s，菌懸液經過誘變處理后，稀 釋涂布于含代謝產物GABA的梯度平板上，30°C下培養Id。肉眼觀察，挑出在梯度平板上層 培養基的相對較厚處生長的菌落，于斜面保藏；(4)從平板中挑取單菌落活化后分別接入IOOmL種子培養基(500mL三角瓶)， 30°C培養Id后離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體。在IOOmL三角瓶中加入濕菌體0.5g， L-谷氨酸 2. 4g，0. 2mol/L 醋酸緩沖液(pH = 5. 0) 30mL,吐溫-800. Olgo 于 30°C、160r/min 振蕩反應24h，停止轉化，氨基酸測定儀測定轉化液中的Y-氨基丁酸含量。所述培養基組成(1)乳酸菌分離培養基牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L， 吐溫0. 5g/L，番茄汁200g/L，溴甲酚綠0. lg/L，碳酸鈣20g/L，瓊脂20g/L, pH 6. 5。(2)菌種保藏活化培養基(MRS培養基)酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵 母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L,磷酸氫二鉀 0. 2g/L，硫酸鎂 0. 2g/L，硫酸錳 0. 05g/L，碳酸鈣 20g/L，瓊脂 20g/L, pH 6. 5。(3)種子培養基(TYG液體培養基)蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁 二酸鈉 5g/L，pH 6.5。3、用權利要求1所述LP-GB 01_21菌株產Y -氨基丁酸的方法，其特征是GA 01-21在固體培養基以g/L計酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄 糖5g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L,磷酸氫二鉀0. 2g/L，硫酸鎂0. 2g/ L，硫酸錳0. 05g/L，碳酸鈣20g/L，瓊脂20g/L，pH 6. 5，培養18h，挑取單菌落接種于液體活 化培養基以g/L計酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L，磷酸氫二鉀0. 2g/L，硫酸鎂0. 2g/L，硫酸錳 0. 05g/L，碳酸鈣20g/L，pH 6. 5，然后轉入種子培養基以g/L計蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L， 葡萄糖10g/L，丁二酸鈉5g/L，pH 6. 5，30°C培養Id后離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體。在 IOOmL三角瓶中加入濕菌體0. 5g，L-谷氨酸2. 4g，0. 2mol/L醋酸緩沖液(pH = 5. 0) 30mL, 吐溫-80 0. Olgo于30°C、160r/min振蕩反應24h，停止轉化，氨基酸測定儀測定轉化液中 的Y-氨基丁酸含量。(6)氨基酸測定儀對產物進行定性與定量分析利用氨基酸測定儀分別測定標準 樣品Y-氨基丁酸和轉化液中各物質的出峰時間與峰面積，比較標準樣品與轉化液各自的 出峰時間和峰面積，即可以對轉化液中γ -氨基丁酸進行定性定量檢測。本發明的有益效果從自制酸菜中取樣，分離進行初步篩選，斜面保藏，以野生 菌株LP-GB 01作為出發菌株；經紫外誘變后篩選得到高產Y-氨基丁酸的菌株LP-GB 01-21，并對其進行了形態學與遺傳學方面的鑒定，對該菌的生長條件進行了摸索，結果顯 示在溫度30°C、pH 6. 5、靜置培養20h達到對數生長期。將生長期的菌體以12% (V/V)的接 種量接入種子培養基，在30°C、pH 6. 5、靜置培養Id后，離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體， 在IOOmL三角瓶中加入濕菌體0. 5g，L-谷氨酸2. 4g，0. 2mol/L醋酸緩沖液(pH = 5. 0) 30mL, 吐溫-80 0.01go于30°C，160r/min振蕩反應24h，氨基酸測定儀測定轉化液中的Y -氨基 丁酸含量，為微生物轉化L-谷氨酸為Y -氨基丁酸工業化提供了基礎。產品純度高，轉化率高，轉化周期短，一般只需24h左右即可轉化完全。技術可移 植性強，只要一般的發酵車間(如抗生素、維生素、氨基酸生產車間)即可進行生產，不需購 置特殊設備和儀器，易于推廣應用。
圖 1 菌株(Lactobacillus plantarum)GB 01-21 電鏡圖片；圖2氨基酸測定儀測定LP-GB 01搖瓶轉化液中底物與產物的含量圖譜；圖3氨基酸測定儀測定LP-GB 01-21搖瓶轉化液中底物與產物的含量圖譜；圖4氨基酸測定儀測定LP-GB 015L發酵罐轉化液中底物與產物的含量圖譜；生物材料樣品保藏一株轉化L-谷氨酸為Y-氨基丁酸的菌株，其分類命名為植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum)GB 01-21，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2009 年5月7日，保藏編號為CCTCC M 209102。
具體實施例方式實施例1 有效轉化L-谷氨酸為Y -氨基丁酸的菌株篩選菌種篩選培養選用土壤、酸奶、自制酸菜等樣品為材料，分別取稀釋成不同濃度 的汁液0. lmL，無菌涂布到乳酸菌選擇培養基平板上，30°C培養l-2d，挑取能產生透明圈， 菌落周圍培養基變為黃色的單菌落，初步確定為乳酸菌。采用平板劃線法在MRS平板上反 復多次劃線培養，獲得純菌株。將分離純化后的單菌落接入MRS固體斜面培養基于4°C冰箱 保存，每2周轉接1次。乳酸菌分離培養基組成牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，吐溫0. 5g/L，番茄汁200g/L，溴甲酚綠0. lg/L，碳酸鈣20g/L，瓊脂20g/L, pH 6. 5。MRS培養基酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L， 乙酸鈉5g/L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L，磷酸氫二鉀0. 2g/L，硫酸鎂0. 2g/L，硫酸錳 0. 05g/L，碳酸鈣 20g/L，瓊脂 20g/L, pH 6. 5。微生物轉化產GABA能力篩選篩選得到菌株以12% (V/V)的接種量分別接種于 裝有IOOmL種子培養基(MRS培養基)的500mL三角瓶中，30°C、pH 6. 5靜置培養Id。用 IOOmL離心管離心收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體后，用30mL醋酸緩沖液(0. 2mol/L, pH 5. 0)懸浮菌體，加入裝有2%的L-谷氨酸(0. 6g)及吐溫-80 0. Olg的IOOmL的三角瓶中， 然后將三角瓶置于30°C、160r/min條件下震蕩培養24h。收集轉化液，離心，比色法檢測上 清液中Y-氨基丁酸的含量。選取其中4株轉化率明顯較高的菌株，添加5%底物來進行進一步產GABA能力篩 選，利用氨基酸測定儀檢測轉化液中產物Y-氨基丁酸的含量，選擇了一株高產Y-氨基丁 酸的菌株，并進行傳代穩定性驗證確定目的菌株。實施例2 高產Y _氨基丁酸菌株的紫外誘變篩選以實施例1中得到的菌株為出發菌株，菌株活化后，菌體用無菌生理鹽水(0. 85% 的NaCl溶液)稀釋，紫外線前稀釋制成細胞密度為IO8個/mL的菌懸液；在15W的紫外燈 下進行，距離照射菌懸液30cm，通過改變照射時間來獲得不同的誘變劑量；制定其生長曲 線、紫外致死率曲線，菌懸液經過誘變處理后，稀釋涂布于含代謝產物GABA的梯度平板上， 30°C下培養Id。肉眼觀察，挑出在梯度平板上層培養基的相對較厚處生長的菌落，于斜面保 藏。實施例3 突變菌株的轉化能力的研究將實施例2中篩選得到的菌株在固體培養基(酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物IOg/ L,酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L,磷酸氫二 鉀0. 2g/L，硫酸鎂0. 2g/L，硫酸錳0. 05g/L,碳酸鈣20g/L,瓊脂20g/L, pH 6. 5)上培養18h， 挑取單菌落接種于液體活化培養基(酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/ L,葡萄糖5g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L,磷酸氫二鉀0. 2g/L，硫酸鎂 0. 2g/L，硫酸錳0. 05g/L，碳酸鈣20g/L, pH 6. 5)，然后轉接于種子培養基(蛋白胨5g/L， 酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸鈉5g/L，pH 6. 5)，培養Id ；離心收集菌體，用滅菌水洗 滌菌體，在IOOmL三角瓶中加入濕菌體0. 5g，L-谷氨酸2. 4g，0. 2mol/L醋酸緩沖液(pH = 5. 0) 30mL,吐溫-80 0. Olgo于30°C，160r/min振蕩反應24h，停止轉化，氨基酸測定儀測定 轉化液中的Y-氨基丁酸含量。選擇得到一株高產Y-氨基丁酸的菌株，菌落經鑒定為植 物乳桿菌LP-GB 01-21。如圖2和圖3所示，轉化液中對應的出峰時間為2. 525min的物質為L-谷氨酸，對 應的出峰時間9. 389min的物質為Y -氨基丁酸，原始菌和誘變后的菌株分別以8% L-谷氨 酸為底物轉化24h后，檢測得到誘變菌株的轉化液中Y-氨基丁酸含量較原始菌明顯提高， Y“氨基丁酸的合成由摩爾生成率來表示。 由表中可以看出菌株誘變后轉化能力提高了 33. 1%。實施例4 :5L發酵罐的轉化用實施例3相同的方法制備在100mL/500mL的MRS培養液中培養的種子按12% 的接種量接種于裝有3L的無菌TYG液體培養基的5L發酵罐中，于0. 2vvm, 30°C，靜置培 養36h，離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體，在5L發酵罐中加入濕菌體，L-谷氨酸500g， 0. 2mol/L醋酸緩沖液(pH = 5. 0) 2. 5L，吐溫-80 Ig,于30°C，200r/min振蕩反應，氨基酸測 定儀測定轉化液中的Y-氨基丁酸含量，，結果如圖4所示，Y-氨基丁酸濃度為132g/L，摩 爾轉化率為94. 3%。
權利要求
一株高效轉化L 谷氨酸為γ 氨基丁酸乳酸菌的選育，其分類命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GB 01 21，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 209102。
2.權利要求1所述菌株LP-GB01-21的誘變選育方法，其特征是(1)轉化菌株的篩選從自制酸菜采樣，稀釋至不同的濃度，分別吸取0.2mL不同濃度 的菌懸液涂布于選擇性平板培養基上，肉眼挑出生長并有透明圈的單菌落，轉接于斜面培 養基保藏，以此野生菌株LP-GB 01作為出發菌株；(2)出發菌株生長曲線與紫外致死率曲線的制定誘變培養菌懸液置于15W的紫外燈 下，距離照射菌懸液30 11，照射0、158、308、458、608、758、908，制定致死率曲線，選擇致死 率在70% -90%的時間誘變；(3)初篩出發菌株經15W紫外燈下30cm處照射45s，菌懸液經過誘變處理后，稀釋涂 布于含代謝產物GABA的梯度平板上，30°C下培養2d。肉眼觀察，挑出在梯度平板上層培養 基的相對較厚處生長的菌落，于斜面保藏；(4)GABA鑒定方法精確定量分析采用氨基酸自動分析儀法，氨基酸自動分析儀日 立835-50型，2619#樹脂(陽離子交換柱①2. 6 X 150mm)，53 °C分析。氨基丁酸標樣 (Sigma,純度99. 9%以上)，配制lOmg/lOOmL溶液。轉化液離心取上清液，加入15%的三氯 乙酸終止反應，離心取上清液lmL，送樣至江南大學測試中心，采用氨基酸自動分析儀來精 確測定轉化液中GABA的含量。(5)轉化從平板中挑取單菌落活化后分別接入100mL種子培養基(500mL三角瓶)， 30°C培養Id后離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體。在100mL三角瓶中加入濕菌體0.5g， L-谷氨酸 2. 4g，0. 2mol/L 醋酸緩沖液(pH = 5. 0) 30mL,吐溫-800. 01g。于 30°C、160r/min 振蕩反應24h，停止轉化，氨基酸測定儀測定轉化液中的Y -氨基丁酸含量。(6)菌株鑒定提取出發菌株的基因組DNA，以出發菌株的基因組DNA為模板，使用細菌 16S rDNA的通用引物進行擴增，正向引物為 F :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物為 R :5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’PCR方法如下:50uL反應體系加入取DNA模板luL,10XPCR緩沖液5 y L，引物1 y L， dNTPs 4,ii L, Taq DNA聚合酶1 y L，總反應體積為50 u L。循環參數94°C預變性5min， 94°C lmin,60°C 2min,72°C 2min，30 個循環，72°C延伸 lOmin。取擴增產物 10ii L 用 0. 8% 瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色，紫外燈下觀測結果。用膠回收試劑盒純化PCR擴增產物，電泳驗證；連接到pMD18-T載體，轉化 E. coliJM109。經氨芐抗性篩選，獲得陽性克隆。16S rDNA測序由上海生工生物科技有限公 司完成，將測序結果在NCBI中與數據庫已有序列進行比較分析。
3.所述培養基組成(1)乳酸菌分離培養基牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，吐溫 0. 5g/L，番茄汁 200g/L，溴甲酚綠 0. lg/L，碳酸鈣 20g/L，瓊脂 20g/L，pH 6. 5。(2)菌種保藏活化培養基(MRS培養基)酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取 物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L,磷酸氫二鉀0. 2g/L， 硫酸鎂0. 2g/L，硫酸錳0. 05g/L，碳酸鈣20g/L，瓊脂20g/L, pH 6. 5。(3)種子培養基(TYG培養基)蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸鈉5g/ L, pH 6. 5。
4.用權利要求1所述LP-GB 01-21菌株生產氨基丁酸的方法，其特征是GA 01-21 在固體培養基以g/L計酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/ L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L，磷酸氫二鉀0. 2g/L，硫酸鎂0. 2g/L，硫酸 錳0. 05g/L，碳酸鈣20g/L，瓊脂20g/L，pH 6. 5，培養18h，挑取單菌落接種于液體活化培養 基以g/L計酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸鈉5g/ L，檸檬酸二胺0. 2g/L，吐溫0. lg/L，磷酸氫二鉀0. 2g/L，硫酸鎂0. 2g/L，硫酸錳0. 05g/L，碳 酸鈣20g/L，pH 6. 5然后轉入種子培養基以g/L計蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/ L，丁二酸鈉5g/L，pH 6. 5，30°C培養Id后離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體。在100mL三 角瓶中加入濕菌體0. 5g，L-谷氨酸2. 4g，0. 2mol/L醋酸緩沖液(pH = 5. 0) 30mL,吐溫-80 O.Olg。于30°C、160r/min振蕩反應24h，停止轉化，氨基酸測定儀測定轉化液中的氨基 丁酸含量。
全文摘要
一株高效轉化L-谷氨酸為γ-氨基丁酸乳酸菌株的選育，屬于生物工程中發酵技術領域。本發明篩選的菌株，分類命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GB 01-21，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCM 209102。從自制酸菜中篩選出一株能利用L-谷氨酸生產γ-氨基丁酸的乳酸菌，命名為LP-GB 01，以此菌株作為出發菌株；經紫外誘變后篩選得到一株正突變株，命名為LP-GB 01-21。在100mL三角瓶中進行初步轉化實驗，停止轉化后，利用氨基酸測定儀測定轉化液中的γ-氨基丁酸，其濃度為51.9g/L，摩爾轉化率達到了92.7％。在5L發酵罐放大轉化實驗，最終獲得γ-氨基丁酸濃度為132g/L，摩爾轉化率為94.3％。這為微生物法生產γ-氨基丁酸的工業化提供了基礎。
文檔編號C12Q1/04GK101928679SQ200910183478
公開日2010年12月29日 申請日期2009年9月22日 優先權日2009年9月22日
發明者劉婷婷, 夏海鋒, 張術聰, 楊套偉, 饒志明 申請人:江南大學