一種高產γ-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌及構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高產γ-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?glutamicum)NJ-M6，已保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC?NO：M2013486，保藏日期為2013年10月22日，它是導入了來源于節桿菌的谷氨酸脫羧酶基因的谷氨酸棒桿菌。本發明還公開了上述重組谷氨酸棒桿菌的構建方法和應用。通過本發明方法，分批補料發酵液中γ-氨基丁酸的濃度可達36.1g/L，在相同培養條件下C.glutamicum?CICC10240基本不產γ-氨基丁酸。
【專利說明】—種高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌及構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌及其構建方法和在Y-氨基丁酸生產中的應用，屬于生物發酵【技術領域】。
【背景技術】
[0002]Y-氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,GABA)又叫氨酪酸,屬于氨基酸類衍生物，其分子式為C4H9NO2，相對分子質量為103.12。Y-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經遞質，對哺乳動物具有重要的生理調節作用，如降血壓、改善睡眠和抗心率失常等；我國衛生部已經批準Y-氨基丁酸為新資源食品。近年來，Y-氨基丁酸的市場需求與日俱增。
[0003]Y-氨基丁酸的合成方法主要由化學合成法和生物合成法。化學合成法，一般分為兩種，一種是Y-氯丁氰通過發生取代水反應來合成，將鄰苯二甲酰亞氨鉀與Y-氯丁氰在180°C反應，然后將產物與濃硫酸回流，再結晶提純而得；另外一種是毗咯烷酮在氫氧化鈣、碳酸氫銨的作用下水解開環制備獲得。微生物合成法主要分為直接發酵法和全細胞轉化法。利用全細胞轉化法生產Y-氨基丁酸，得到的轉化液成分相對簡單，雜質含量較少，簡化后提取分離步驟，降低了生產成本。直接發酵法合成Y-氨基丁酸得到的發酵液成分較復雜，會增加下游分離提取的成本，是Y-氨基丁酸工業化生產的瓶頸問題之一。
[0004]化學法雖然具有反應迅速的特點，但是由于該方法副反應較多，且有化學物質殘留，即使得到純品也不屬于天然產物，同時，該反應對環境條件要求較為苛刻，且能耗高、危險系數高。與化學法相比，微生物法制備Y-氨基丁酸具有條件溫和，安全性較高，生產成本較低等諸多優點。目前，Y-氨基丁酸的生產企業，大都采用微生物法，因此微生物發酵法最具有商業化開發應用前景。`
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題之一在于提供一株重組谷氨酸棒桿菌。
[0006]本發明要解決的技術問題之二在于提供上述重組菌的構建方法。
[0007]本發明要解決的技術問題之三在于提供所述重組谷氨酸棒桿菌在生產Y-氨基丁酸上的應用。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
[0009]一種高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutami cum) NJ-M6，已保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO:M2013486，保藏日期為2013年10月22日，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，郵編 430072。
[0010]具體來說，所述的高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌，它是導入了來源于節桿菌的谷氨酸脫羧酶基因的谷氨酸棒桿菌。
[0011]其中，所述的谷氨酸脫羧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。[0012]上述高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌的構建方法，它包括如下步驟:
[0013]1)構建含有谷氨酸脫羧酶的重組表達質粒；所述重組表達質粒是將谷氨酸脫羧酶基因gad基因插入pXJ19載體，得到重組質粒pXJ19-gad ；
[0014]2)將步驟I)構建得到的重組質粒轉化入谷氨酸棒桿菌(購于中國工業微生物菌種保藏中心CICC，編號為10240)，得到產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌。
[0015]所述重組質粒為pXJ19_gad，該質粒由以下方法得到:以節桿菌(菌種編號；CGMCCN0.3584)基因組為PCR模板，PCR擴增谷氨酸脫羧酶基因，然后構建入載體pXJ19中，得到重組質粒pXJ19-gad.[0016]上述谷氨酸棒桿菌感受態的制備:挑取新鮮平皿上谷氨酸棒桿菌C.glutamicumCICC10240，接種入含0.5%(質量體積比)葡萄糖的2ml液體LB培養基中，30°C，200r/min培養12小時，再按1%(接種量與培養基的體積百分比)接種到含3%(質量體積比)甘氨酸和0.1% (體積比)Tween80的50mL LB中，使起始OD600達到0.4，在30°C中繼續培養至OD600達到0.9。將菌液冰浴20分鐘，離心收集菌體，用預冷的10%體積百分比)甘油重懸細胞，用1.5ml離心管分裝，每管80uL。將感受態細胞放_70°C冰箱保存或直接用于電擊轉化。
[0017]電擊轉化上述重組質粒pXJ19_gad:在1.8Kv, 5ms條件下使用電擊儀(BioRad公司產品)將質粒pXJ19_gad轉化入C.glutamicum CICC10240中。在含有25a g/mL卡那霉素的固體LB培養基上篩選出陽性克隆，得到重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum NJ-M6。并通過提取質粒的方法對該重組菌進行驗證，結果表明，重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum NJ-M6含有質粒pXJ19-gad。
[0018]所述PCR擴增的引物為:
[0019]正義鏈:5’-TCGCGGATCCGAATTCATGTCACACGGCGACGACGA-3，
[0020]反義鏈:3，-TGCGGCCGCAAGCTTTCAGCTTCCGCGTACTGCGG-5’
[0021]所述GAD基因如SEQ ID No:1所示。
[0022]上述高產Y -氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌在發酵生產Y -氨基丁酸中的應用。
[0023]上述發酵生產Y -氨基丁酸的方法包括如下步驟:
[0024]I)平板培養:將甘油管保藏的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)NJ-M6接種至LB培養基上，培養溫度30°C，培養時間8_12個小時；
[0025]2)液體種子培養:將平板培養的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)NJ-M6接種至種子培養基中，培養溫度30°C，培養時間8-12h ；
[0026]3)發酵產Y-氨基丁酸:將種子培養液接種到發酵培養基中，接種量5~10 (v/V) %，培養溫度30°C，溶解氧水平控制在25%-45%的飽和度，12h和24h分別補加20g/L谷氨酸鈉，并且12h后，pH控制在5.0,發酵時間40-60h。
[0027]其中，所述的LB培養基配方如下:1L蒸餾水中含IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOg氯化鈉、15g瓊脂粉，ρΗ7.0。
[0028]其中，所述的種子培養基配方如下:1L蒸餾水中含30g葡萄糖、IOg硫酸銨、5g蛋白胨、3.5g玉米衆、1.0g磷酸二氫鉀、1.0g氯化鈉，pH=7.0。
[0029]其中，所述的發酵培養基配方如下:1L蒸餾水中含30g葡萄糖、IOg谷氨酸鈉、26g硫酸銨、20g玉米漿、4.5g磷酸二氫鉀、2.5g硫酸鎂，pH=7.0。
[0030]本發明的有益效果在于:[0031]本發明在谷氨酸棒桿菌(保藏編號:CICC10240)中表達谷氨酸脫羧酶基因，構建并篩選得到一株高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌c.glutamicum NJ-M6 ;補料分批發酵時，發酵液中Y-氨基丁酸的濃度可達36.lg/L。谷氨酸棒桿菌是國際公認的食品安全微生物；并且Y-氨基丁酸的產量高，底物轉化率高，發酵工藝簡單，具有良好的產業化應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為谷氨酸脫羧酶基因gad的電泳圖,其中1，gad基因；2，Marker。
【具體實施方式】
[0033]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0034]實施例1:重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum NJ-M6的構建。
[0035]菌種:谷氨酸棒桿菌C.glutamicum CICC10240。
[0036]外源基因:節桿菌(菌種編號；CGMCC N0.3584)來源的谷氨酸脫羧酶基因gad。
[0037]載體:E.col i/C.glutamicum 穿梭載體 pXJ19。
[0038]以節桿菌CGMCC3584基因組為PCR模板，PCR擴增得到谷氨酸脫羧酶基因gad;電泳圖見圖1，gad基因的大小為1392bp。將gad片段兩端分別接上EcoRI和HindIII位點，引物為:
[0039]正義鏈:5，-TCGCGGATCCGAATTCATGTCACACGGCGACGACGA-3，；
[0040]反義鏈:3，-TGCGGCCGCAAGCTTTCAGCTTCCGCGTACTGCGG-5，。
[0041]將得到的谷氨酸脫羧酶基因gad產物雙酶切裝入穿梭載體PXJ19中形成融合片段，并進行酶切、測序鑒定。
[0042]上述谷氨酸棒桿菌感受態的制備:挑取新鮮平皿上谷氨酸棒桿菌C.glutamicumCICC10240，接種入含0.5%(質量體積比)葡萄糖的2ml液體LB培養基中，30°C，200r/min培養12小時，再按1%(接種量與培養基的體積百分比)接種到含3%(質量體積比)甘氨酸和0.1% (體積比)Tween80的50mL LB中，使起始OD600達到0.4，在30°C中繼續培養至OD600達到0.9。將菌液冰浴放置20分鐘，離心收集菌體，用預冷的10%體積百分比)甘油重懸細胞，用1.5ml離心管分裝，每管80uL。將感受態細胞放_70°C冰箱保存或直接用于電擊轉化。
[0043]電擊轉化上述重組質粒pXJ19_gad:在1.8Kv, 5ms條件下使用電擊儀(BioRad公司產品)將質粒pXJ19_gad轉化入C.glutamicum CICC10240中。在含有25a g/mL卡那霉素的固體LB培養基上篩選出陽性克隆，得到重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum NJ-M6。并通過提取質粒的方法對該重組菌進行驗證，結果表明，重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum NJ-M6含有質粒pXJ19-gad。
[0044]實施例2:
[0045]本實施例說明谷氨酸棒桿菌C.glutamicum NJ-M6補料發酵生產Y-氨基丁酸的工藝。[0046]本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比):
[0047]固體平板培養基:1L蒸餾水中含:1L蒸餾水中含IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg氯化鈉，15g瓊脂粉，ρΗ7.0。
[0048]種子培養基:1L蒸懼水中含30g葡萄糖，IOg硫酸銨,5g蛋白胨,3.5g玉米衆,1.0g磷酸二氫鉀，1.0g氯化鈉，pH=7.0。
[0049]發酵培養基:1L蒸餾水中含30g葡萄糖，IOg谷氨酸鈉，26g硫酸銨，20g玉米漿，
4.5g磷酸二氫鉀，2.5g硫酸鎂，pH=7.0。
[0050]將甘油管保藏的谷氨酸棒桿菌C.glutamicum NJ-M6接種至LB培養基上,培養溫度30度，培養時間8-12個小時；將平板培養的谷氨酸棒桿菌C.glutamicum NJ-M6接種至種子培養基中，500mL搖瓶裝液量IOOmL,培養溫度30度，轉速250rpm，培養時間8_12個小時；然后轉接發酵培養基中發酵，接種量5% (v/v),2L發酵罐裝液量1L，溶解氧水平控制在40%的飽和度，12h和24h分別補加20g/L谷氨酸鈉，并且12h后，pH控制在5.0(用2M濃硫酸和NaOH來調節)；發酵時間50h后，檢測Y-氨基丁酸產量；發酵液中Y-氨基丁酸的含量可達36.lg/L,而同等培養條件下，出發菌株重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum CICC10240基本不產Y-氨基丁酸。`
【權利要求】
1.一種高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) NJ-M6，已保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO:M2013486，保藏日期為 2013 年 10 月 22 日。
2.根據權利要求1所述的高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，它是導入了來源于節桿菌的谷氨酸脫羧酶基因的谷氨酸棒桿菌。
3.根據權利要求2所述的高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述的谷氨酸脫羧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
4.權利要求1所述高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌的構建方法，其特征在于，它包括如下步驟: 1)構建含有谷氨酸脫羧酶的重組表達質粒；所述重組表達質粒是將谷氨酸脫羧酶基因gad基因插入pXJ19載體，得到重組質粒pXJ19-gad ； 2)將步驟I)構建得到的重組質粒轉化入谷氨酸棒桿菌，得到產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌。
5.權利要求1所述的高產Y-氨基丁酸的重組谷氨酸棒桿菌在發酵生產Y-氨基丁酸中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，發酵生產Y-氨基丁酸的方法包括如下步驟: 1)平板培養:將甘油管保藏的谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutami cum) NJ-M6接種至LB培養基上，培養溫度30°C，培養時間8-12個小時；` 2)液體種子培養:將平板培養的谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutami cum) NJ-M6接種至種子培養基中，培養溫度30°C，培養時間8-12h ； 3)發酵產Y-氨基丁酸:將種子培養液接種到發酵培養基中，接種量5~10 (v/v) %，培養溫度30°C，溶解氧水平控制在25%-45%的飽和度，12h和24h分別補加20g/L谷氨酸鈉，并且12h后，pH控制在5.0,發酵時間40-60h。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的LB培養基配方如下:1L蒸餾水中含IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOg氯化鈉、15g瓊脂粉，pH7.0。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的種子培養基配方如下:1L蒸餾水中含30g葡萄糖、IOg硫酸銨、5g蛋白胨、3.5g玉米楽；、1.0g磷酸二氫鉀、1.0g氯化鈉，pH=7.0。
9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的發酵培養基配方如下:IL蒸餾水中含30g葡萄糖、IOg谷氨酸鈉、26g硫酸銨、20g玉米漿、4.5g磷酸二氫鉀、2.5g硫酸鎂，pH=7.0。
【文檔編號】C12N15/77GK103555647SQ201310545908
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】謝婧婧, 郭亭, 周韜玉, 陳可泉, 周治, 馮曉慈 申請人:南京工業大學