專利名稱：一種重組畢赤酵母發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種新的重組畢赤酵母發酵方法。
背景技術：
巴斯德畢赤酵母表達系統是近20年來發展起來的一種真核表達系統。Koichi Ogata等人于1969年首次發現了可以利用甲醇為唯一碳源和能源生長(Koichi Ogata， et al.l969)的酵母。由于這一特性，早期畢赤酵母被用來生產單細胞蛋白。直到，1987年， Cregg等人才首次將畢赤酵母用于外源基因的表達(JMCregg， etal.1987)。巴斯德畢赤酵 母表達系統既具有原核表達系統基因操作簡易、易于培養、生長速度快、表達量高、生 產成本低等優點，同時還具有真核表達系統的對外源蛋白的翻譯后修飾等特點，如糖基 化、蛋白磷酸化等。與釀酒酵母表達系統相比，它還避免了其分泌效率差、表達菌株不 夠穩定、表達質粒易丟失等缺陷。由于這些優點使得該系統成為目前研究最多、應用最 廣泛的真核表達系統之一。 在畢赤酵母利用甲醇的代謝途徑中存在兩個乙醇氧化酶，AOXl和AOX2。其 中AOXl承擔大部分的乙醇氧化酶活性。根據AOX1和AOX2基因的完整性不同，畢赤 酵母表現出三種甲醇利用表現。當AOXl和AOX2基因都完整時，畢赤酵母菌株表現出 甲醇快速利用的表型(mut+);當AOXl被敲除、AOX2基因完整時，畢赤酵母菌株表現出 甲醇慢速利用的表型(muts);當AOXl和AOX2基因都被敲除時，畢赤酵母菌株表現不利 用甲醇生長的表型(mut-)。在表達外源蛋白時，后面兩種表型有時優于mut+，而且甲醇 的消耗量小。三種表型的菌株均可以在AOXl啟動子的調控下控制外源蛋白的表達。但 是在三種表型重組畢赤酵母菌株的發酵策略上存在一定的差異。 畢赤酵母發酵工藝一般分為三個階段，甘油分批發酵階段、甘油補料階段和外 源基因誘導表達階段。前兩個階段對于三種表型都是一樣，但在外源基因誘導表達階段 卻有較大的不同。對于!!1加+-重組菌，在甲醇誘導時菌體還可以利用甲醇生長，故在誘 導階段多采用直接甲醇補料；對于muts重組菌，在甲醇誘導菌體生長緩慢，為了維持一 定的生長速度，在誘導階段多采用混合補料，如甲醇-甘油混合補料、甲醇-山梨醇混 合補料和甲醇-乳酸混合補料等；對于mut-重組菌，在甲醇誘導菌體不生長，為了維持 一定的生長速度，在誘導階段加入一定量的甲醇后，還需流加甘油等維持菌的生長。在 誘導階段，不同的甲醇流加策略對重組菌表達外源蛋白的影響很大。文獻中報道的甲醇 流加策略有間歇式恒速流加、DO stat流加和居于甲醇傳感器的反饋控制流加。這些 甲醇流加方式在不同程度上存在局限性。間歇式恒速流加流加速率的控制比較困難， 當流加速率設置的太大，容易造成發酵液中甲醇的蓄積，從而影響外源蛋白的表達，當 流加速率設置的太小，發酵液中甲醇濃度始終處于很低的水平，影響誘導效果。DOstat 流加，發酵液中甲醇濃度始終處于很低的水平，誘導效果不加。居于甲醇傳感器的反饋 控制流加，該方法需要使用甲醇傳感器，目前甲醇傳感器還不是很成熟，還存在一些問 題，如傳感器對甲醇濃度非線性響應、零點漂移等，在此基礎上要進行有效控制有一定的困難。因此，設計簡單易行的甲醇流加策略，對于提高發酵表達外源蛋白十分重要。
發明內容
本發明的目的在于提供一種畢赤酵母發酵方法，從而可以通過高密度發酵，高 效地生產外源蛋白。 本發明所述的重組畢赤酵母發酵方法，包括三個階段，甘油分批發酵階段、甘 油補料發酵階段和外源基因誘導表達階段。甘油分批階段，菌體利用培養中甘油生長， 當培養基中甘油耗盡時開始流加甘油，進一步提高菌濃。最后進入外源基因誘導表達階
段，在該階段采用脈沖式流加甲醇誘導外源基因表達。 本發明所說脈沖式甲醇流加是指在發酵液中甲醇耗盡時，以發酵液中溶氧反彈 作為指示， 一次性流加甲醇使發酵液中甲醇濃度至設定值。待下一次甲醇耗盡時，重復 這一操作，周期性執行，直至發酵結束。 本發明的優點是綜合了 DO Stat和間歇式恒速流加的優點，即以溶氧作為發酵液 中甲醇是否耗盡的指示，當溶氧反彈表示發酵液中甲醇耗盡，然后以恒速流加的方式一 段時間甲醇至所需濃度。有效克服了外源基因誘導表達階段甲醇間歇式恒速流加、DO stat流加和居于甲醇傳感器的反饋控制流加存在的不足，
圖1、誘導階段過程數據圖 圖2、誘導不同時間下融合蛋白IFN13 -HSA表達情況的SDS-PAGE分析 M :低分子量標準；1 :誘導前的樣品；2 :誘導12h的樣品；3 :誘導24h的 樣品；4 :誘導36h的樣品；5 :誘導48h的樣品；6 :誘導60h的樣品；7 :誘導72h的 樣品；8 :誘導84h的樣品；9 :誘導96h的樣品； 圖3、誘導不同時間下融合蛋白IFN a 2b-HSA表達情況的SDS-PAGE分析 M :低分子量標準；1 :誘導24h的樣品；2 :誘導36h的樣品；3 :誘導42h的
樣品；4 :誘導59h的樣品；5 :誘導66h的樣品；7 :誘導70h的樣品；7 :誘導90h的 樣品；8 :誘導96h的樣品
實施例1表達P干擾素-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GS115/pPIC9K-IFNP -HSA由
本室構建保存，該重組畢赤酵母甲醇利用表型為mut+。 取lml-8(TC甘油管保存的菌種GS115/pPIC9K-IFNP-HSA，融化后，接入裝 有50ml BMGY培養基(1 % Yeast Extract, 2 % Peptone, 2 % Glycerol, lOOmM potassium phosphate pH6.0， 1.34 % Yeast Nitrogen Base, 4X 10-5Biotin)的250ml搖瓶中，于 200rmp， 3(TC培養24h，制備得到一級種子。取以5 %的接種量將一級種子接入裝有 100ml BMGY培養基的1L三角瓶中，于200rmp， 3(TC培養24h，制備得到二級種子。 按5%的接種量把二級種子接入裝有2L BMGY培養基的5L發酵罐中，設定發酵初始條 件為溫度3(TC、轉速500rpm、通氣量2VVM、 pH6.0后開始發酵。發酵約22h左右，初 始培養基中的碳源甘油消耗完，溶氧開始反彈，此時開始流加補料生長培養基(5% Yeast Extract, 10 % Peptone, 10 % Glycerol, 6.7 % YNB， 2X10-4 % Biotin)，流速為2.5mL/min，共補料600mL。補料完成后，待再次溶氧上升超過60%時，開啟甲醇脈沖式流加， 一次性補加0.5%發酵液體積的甲醇。周期性執行，每當溶氧上升超過60%時， 一次性補 加0.5%發酵液體積的甲醇，誘導96h，典型的誘導階段過程曲線如圖1。 SDS-PAGE電 泳檢測不同時段表達情況(如圖2)，用雙抗體夾心Elisa方法定量檢測發酵結束時融合蛋 白的表達量為500mg/L。
實施例2表達干擾素a 2b-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GS115/pPIC9K-IFN a 2b-HSA
由本室構建保存，該重組畢赤酵母甲醇利用表型為mut+。 取lml-80。C甘油管保存的菌種GS115/pPIC9K-IFNa 2b-HSA，融化后，接入裝 有50mlBMGY培養基的250ml搖瓶中，于200rmp， 3(TC培養24h，制備得到一級種子。 取以5%的接種量將一級種子接入裝有100mlBMGY培養基的1L三角瓶中，于200rmp， 3(TC培養24h，制備得到二級種子。按5X的接種量把二級種子接入裝有2LBMGY培養 基的5L發酵罐中，設定發酵初始條件為溫度3(TC、轉速500rpm、通氣量2VVM、 pH6.0 后開始發酵。發酵約22h左右，初始培養基中的碳源甘油消耗完，溶氧開始反彈，此時 開始流加補料生長培養基，流速為2.5mL/min，共補料600mL。補料完成后，待再次溶 氧上升超過60%時，開啟甲醇脈沖式流加， 一次性補加0.5%發酵液體積的甲醇。周期性 執行，每當溶氧上升超過60%時， 一次性補加0.5%發酵液體積的甲醇，誘導96h，典型 的誘導階段過程曲線如圖1。 SDS-PAGE電泳檢測不同時段表達情況(如圖3)，用雙抗體 夾心Elisa方法定量檢測發酵結束時融合蛋白的表達量為300mg/L。
權利要求
一種重組畢赤酵母的發酵方法，該發酵方法包括三個部分，甘油分批階段、甘油補料階段和甲醇誘導表達表達階段，其特征在于，甲醇誘導表達表達階段甲醇誘導表達階段采用甲醇脈沖式補料。
2. 如權利要求1所述發酵方法，其特征在于，其中所說的甲醇脈沖脈沖式補料是在發 酵液中甲醇耗盡時一次性補入甲醇使發酵液中甲醇濃度至設定值，周期性執行這一操作 直至發酵結束。
3. 如權利要求2所述，其特征在于，設定的甲醇濃度范圍為0.05%至5%。
4. 如權利要求3所述，其特征在于，設定的甲醇最佳濃度為0.5%。
全文摘要
本發明涉及一種新的重組畢赤酵母的發酵方法。在甘油生長重組畢赤酵母的基礎上，采用脈沖式甲醇補料誘導重組蛋白的表達。該方法在甲醇流加控制時不需使用甲醇傳感器，同時克服DO stat補料誘導過程中的甲醇濃度過低，也克服了恒速間歇式恒速流加誘導過程中由于補料速度過快而帶來的甲醇蓄積和補料速度過低導致的甲醇濃度過低等缺點。采用脈沖式甲醇補料后，重組長效融合干擾素的表達量得到了很大程度的提高。
文檔編號C12P21/02GK101691595SQ20091018469
公開日2010年4月7日 申請日期2009年8月28日 優先權日2009年8月28日
發明者儲敏, 朱瑞宇, 李英, 金堅, 陳蘊, 雷楗勇 申請人:江南大學