專利名稱：一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法
技術領域：
本發明屬固定化酶技術領域，特別是涉及一種以球形細菌纖維素為載體制備固定
化酶的方法。
背景技術：
由于酶具有較好的底物專一性，在許多領域具有重要應用價值。但游離的酶蛋白 在實際應用過程中易受環境條件影響而變性失活，且不易從反應體系中分離以實現重復使 用的目的，這在一定程度上限制了酶的工業化應用。酶固定化技術是實現酶重復連續使用 和改善其穩定性的有效手段。目前酶的固定化載體主要包括無機載體材料(如二氧化硅、 活性炭、多孔性玻璃等)、有機合成高分子材料(如聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯 等)和天然高分子材料(如結構性蛋白，殼聚糖，海藻酸鈉等)，但尚無利用細菌纖維素小 球為載體來固定化酶的報道。現有的固定化酶技術主要有5種(l)微囊法該法是利用半 透膜能阻止大分子的酶從膠囊中擴散出去，而小分子反應物和產物能自由擴散的特性來實 現的；(2)惰性載體吸附法酶可以通過范德華力，氫鍵，疏水作用，靜電相互作用等吸附到 不溶性支持物上，從而達到固定化的目的；(3)共價交聯法利用雙功能試劑可以使分子與 分子交聯起來而形成大分子顆粒，從而實現酶的固定化；(4)膠格物理包埋法該包埋是通 過成膠物質在酶的水溶液中聚合而實現的，最常用的是聚丙烯酰胺膠，其它還有淀粉膠等； (5)與水不溶性載體共價結合法根據酶和載體本身的理化性質，通過共價偶聯使酶和載 體產生共價結合。 細菌纖維素(bacterial cellulose, BC)是一種由微生物合成的高純度胞外生物 纖維。細菌纖維素的初級結構與植物纖維素相似，由吡喃葡萄糖單體以P-l，4糖苷鍵連接 而成的直鏈多糖，但是BC的纖維結構卻與植物纖維大不相同。BC由微纖維絲組成，這種微 纖維絲呈帶狀，其厚度為O. lym左右，比植物纖維的厚度(lOym)小兩個數量級。此外，這 種微纖維絲具有明顯的網狀結構。由于BC微結構的特性，它具有許多獨特的性質，例如良 好的機械強度，超細納米纖維網絡，生物可降解性，較大的比表面積、導電性和高的結晶度 等特性。近幾年，有研究報道利用化學改性后的細菌纖維素膜為載體用于微生物細胞的固 定化，其固定化后的微生物細胞對孔雀石綠染料的降解效果良好，在培養液初始pH值和染 料初始濃度不變的情況下仍能保持穩定的脫色率。細菌纖維素作為一種新型的納米纖維生 物材料，已經成為國內外研究的熱點。細菌纖維素具有納米纖維網絡結構，因此該纖維材料 具有非常高的比表面和數量眾多的空隙結構，有利于吸附和包容酶蛋白。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種以細菌纖維素小球為載體制備固定化酶 的方法，具有工藝簡便，可操作性強，酶活損失小等優點。
本發明提供一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，包括
(1)細菌纖維素小球的制備
將活化的斜面菌種接入pH4. 8 5. 2的種子培養基，在25 30°C 、 100 200rpm 條件下培養12 16h制得液體種子，以體積百分比為4 10%接種量將液體種子轉接至 pH4. 8 5. 2的發酵培養基中，每500mL錐形瓶中含有200 300mL發酵培養液，25 30°C ， 80 200rpm條件下培養48 96h，傾濾，得細菌纖維素小球；
(2)細菌纖維素小球的處理 將發酵收集得到的細菌纖維素小球用質量分數為0. 1 %的NaOH在80 9(TC水浴
中處理30 120min，用去離子水漂洗3 5次，收集，用體積分數為0. 1%的醋酸中和小球
內殘留的堿液，靜置12 24h，用去離子水漂洗2 3次，在水中保持其球狀形態，將小球取
出，吸干表面水分，在液氮中速凍或在低溫冰箱里冷凍，然后在冷凍干燥機中干燥后獲得白 色纖維素小球； (3)細菌纖維素小球固定化酶的制備 以細菌纖維素小球為載體采用物理吸附法或吸附 交聯法制備固定化酶。
所述步驟(1)中的菌種選自醋桿菌(Acetobacter sp.)、木醋桿菌(A. xylinum)、 產醋醋桿菌(A. acetige皿m)、醋化桿菌(紋膜醋酸菌，A. aceti)、許氏醋酸菌 (A. schutzenbachii)、惡臭醋酸菌(A. rances)、奧爾蘭醋桿菌(A. orleanense)、彎醋桿 菌(A. curvum)、巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteuria皿s)、葡萄糖桿菌(Gluconobacter sp.)、葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)、農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、 豐艮瘤菌(Rhizobium trifolii)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas cepacia)、八疊5求菌(Sarcina ventriculi)、椰毒假單胞菌(P. cocovenenans)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)中 的一種或幾種。 所述步驟(1)中的種子培養基，按重量百分比，包含葡萄糖2. 0%，酵母粉0. 5%， 胰蛋白胨O. 5%， Na2HP04 12H20 0. 27%，擰檬酸0. 115%。 所述步驟(1)中的發酵培養基，按重量百分比，包含葡萄糖2. 0%，酵母粉0. 5%， 胰蛋白胨O. 3%， Na2HP04 12H20 0. 27%，擰檬酸0. 115%。 所述步驟(3)中物理吸附法，包括5 10ml的100 5000U/L酶液中加入細菌 纖維素小球0. 05 0. 4g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4。C條件下吸附6 24h，取出 細菌纖維素小球，用pH4. 8 5. 2的醋酸鈉緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4t: 冰箱保存。 所述步驟(3)中吸附 交聯法，包括5 10ml的100 5000U/L酶液中加入細 菌纖維素小球0. 05 0. 4g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4。C條件下吸附6 24h，以 lg纖維素小球25 200mL戊二醛溶液的比例加入質量體積百分比為25%的戊二醛溶液， 20 3(TC攪拌條件下交聯反應1 3h，取出細菌纖維素小球，用pH4. 8 5. 2的醋酸鈉緩 沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4t:冰箱保存。 有益效果 本發明與現有技術相比存在顯著的進步和積極的效果 (1)本發明提供了一種新型酶固定化技術。本發明能高效吸附生物酶，最大限度地 保持酶的活性，且安全環保，方法簡單，易于操作，可控性強。與采用化學交聯的方法相比， 初始酶活保留率高出約25%。
(2)球狀細菌纖維素的生產并將其作為酶固定化的載體材料，拓寬了細菌纖維素的應用領域。
(3)球狀細菌纖維素材料純度高，生物穩定性強。
(4)球狀細菌纖維素材料傳質性能好，有利于實現酶的高效催化。
(5)球狀細菌纖維素材料在自然界的生物可降解性好，生物相容性好。
圖1為游離漆酶(▲)和本發明的球形細菌纖維素固定化漆酶(■)的最適反應溫度。 圖2為游離漆酶(▲)和本發明的球形細菌纖維素固定化漆酶(■)最適反應pH值。 圖3為游離漆酶(▲)和本發明的球形細菌纖維素固定化漆酶(■)的熱穩定性。
圖4為游離漆酶(▲)和本發明的球形細菌纖維素固定化漆酶(■)的pH穩定性。 圖5為本發明的吸附法( )和吸附_交聯法(■)固定化漆酶的重復使用穩定性。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。 實施例1 從醋酸桿菌斜面上挑取l環單菌落接種于lOOmL無菌種子培養基中，所述的種子培養基包含(質量百分比)葡萄糖2.0%，酵母粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，Na2HP04 *12H200. 27%，擰檬酸0. 115%，pH5. 0，在30°C ， 130rpm條件下培養12h。以6%的接種量將種子液接入到裝有300mL無菌發酵培養基的500mL錐形瓶中。所述的發酵培養基包含(質量百分比)葡萄糖2.0%，酵母粉0. 5%，胰蛋白胨0. 3%，Na2HP04*12H20 0. 27%，檸檬酸O. 115%，pH5.0 ;3(TC，110rpm條件下培養72h后，在培養基中生成許多細菌纖維素小球。將培養基傾濾后取出纖維素小球，用去離子水反復沖洗，除去小球表面培養基及雜質，再將小球浸泡于0. 1 %的NaOH溶液中，8(TC處理60min，去除纖維素小球中的菌體及殘留培養基至乳白色半透明；然后用去離子水沖洗并加入少量O. 1%的醋酸中和小球中殘留的NaOH，靜置過夜后再用去離子水沖洗細菌纖維素小球；將小球表面液體用濾紙吸干，逐個用液氮速凍或置于低溫冰箱中冷凍，然后在冷凍干燥機中干燥，得到細菌纖維素小球載體。
固定化漆酶的制備 吸附法向50mL燒杯中加入酶活單位300U/L的漆酶酶液10mL，加入0. 2g凍干的細菌纖維素小球并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4。C條件下吸附24h，取出細菌纖維素小球，用200mM、pH5. 2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4t:冰箱保存備用。 吸附-交聯法向50mL燒杯中加入酶活單位300U/L的漆酶酶液10mL，加入0. 2g凍干的細菌纖維素小球并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在fC條件下吸附24h，加入10mL戊二醛溶液，3(TC、磁力攪拌條件下交聯反應1 3h，取出細菌纖維素小球，用pH4. 8 5. 2的醋酸鈉緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4t:冰箱保存。
酶的表征如下 (a)游離酶和固定化酶的最適反應溫度 以0.4mM2，2'-連氮基-雙-(3_乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2， 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)，簡稱ABTS)為底物，在50mM醋酸鈉緩沖溶液中(pH = 5. 2)測定漆酶活力，以確定固定化漆酶和游離漆酶的最適反應溫度，結果如圖1所示。從圖中相對酶活力的變化(以同組實驗中最高酶活力為100% )可知，當反應溫度< 6(TC時，固定化酶的活力隨著反應溫度的升高而增大，當反應溫度> 6(TC時，固定化酶的活力有所下降，其最佳反應溫度(60°C )比游離酶(50°C )提高了 l(TC。
(b)游離酶和固定化酶的最適反應pH值 以O. 4mM ABTS為底物，在200mM的擰檬酸緩沖液中，5(TC條件下測定漆酶活力，以
確定游離酶和固定化酶的最適反應pH。以每組最高酶活力為100%作圖，結果如圖2所示。
從圖中可知，游離酶和固定化酶的最適反應pH值都為3. 5，在pH3. 5-5. 5之間，pH值對固定
化酶的影響要小于對游離酶的影響。 (c)游離酶和固定化酶的熱穩定性將游離酶酶液和固定化酶分別在30 7(TC水浴中保持30min后，以0. 4mM ABTS
為底物，在5(TC條件下測定漆酶活力，確定游離酶和固定化酶的溫度穩定性。以每組的最高
酶活力為100%，結果見圖3。由圖可知，游離酶在4(TC以內較為穩定，而固定化酶在5(rC
以內較穩定，比游離酶提高了 10°C。 (d)游離酶和固定化酶的pH穩定性 將游離酶和固定化酶分別置于含0. 2M不同pH的磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖溶液和0. 4mM ABTS底物的反應液中，30。C下保溫30min后，以0. 4mM ABTS為底物，在50mM醋酸鈉緩沖溶液(PH5. 2)中，5(TC條件下測定漆酶活力，以確定游離酶和固定化酶的pH穩定性。以每組的最高酶活力為100%，其結果見圖4。從圖中可以看出，游離酶在pH5時較穩定，其酶活在pH4 7的范圍內保持了 90%以上的相對活力；固定化酶在pH4時較穩定，其酶活在pH3 6的范圍內保持80%以上的相對活力。固定化酶的酸堿穩定性較游離酶向酸性方向移動了 l個pH單位。 (e)固定化酶的重復使用穩定性 在50mL小燒杯中，加入10mL去離子水、5mL醋酸鈉緩沖溶液(200mM， pH5. 2)和5mLABTS(2mM)，磁力攪拌子緩慢攪拌，當溫度達到5(TC后加入0.2g固定化酶。按照(d)中酶活力測定方法測定固定化酶酶活。20min后，取出固定化酶，用醋酸鈉緩沖溶液沖洗1 2次，再用去離子水反復沖洗，充分洗滌反應底物和產物。用濾紙吸干殘留水分并重復以上操作，直到得到重復使用7次后的固定化酶。測定酶活力的結果見圖5，以吸附法固定化漆酶第一次使用所測酶活為100%計，其它所測的酶活以其為基準計算相對酶活。由圖可知，兩種固定化酶經多次重復使用后，都具有較好的穩定性，在經過4次使用后，其相對酶活力仍高于35%。
權利要求
一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，包括(1)細菌纖維素小球的制備將活化的斜面菌種接入pH4.8～5.2的種子培養基，在25～30℃、100～200rpm條件下培養12～16h制得液體種子，以體積百分比為4～10％接種量將液體種子轉接至pH4.8～5.2的發酵培養基中，每500mL錐形瓶中含有200～300mL發酵培養液，25～30℃，80～200rpm條件下培養48～96h，傾濾，得細菌纖維素小球；(2)細菌纖維素小球的處理將發酵收集得到的細菌纖維素小球用質量分數為0.1％的NaOH在80～90℃水浴中處理30～120min，用去離子水漂洗3～5次，收集，用體積分數為0.1％的醋酸中和小球內殘留的堿液，靜置12～24h，用去離子水漂洗2～3次，在水中保持其球狀形態，將小球取出，吸干表面水分，在液氮中速凍或在低溫冰箱里冷凍，然后在冷凍干燥機中干燥后獲得白色纖維素小球；(3)細菌纖維素小球固定化酶的制備以細菌纖維素小球為載體采用物理吸附法或吸附～交聯法制備固定化酶。
2. 根據權利要求1所述的一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟(1)中的菌種選自醋桿菌、木醋桿菌、產醋醋桿菌、醋化桿菌、許氏醋酸菌、 惡臭醋酸菌、奧爾蘭醋桿菌、彎醋桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、葡萄糖氧化桿菌、農桿菌、 根瘤菌、洋蔥假單胞菌、八疊球菌、椰毒假單胞菌、空腸彎曲菌中的一種或幾種。
3. 根據權利要求1所述的一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟(1)中的種子培養基，按重量百分比，包含葡萄糖2.0%，酵母粉0.5%，胰 蛋白胨0. 5%， Na2HP04 12H20 0. 27%，擰檬酸0. 115%。
4. 根據權利要求1所述的一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟(1)中的發酵培養基，按重量百分比，包含葡萄糖2. 0 % ，酵母粉0. 5% ，胰 蛋白胨O. 3%， Na2HP04 12H20 0. 27%，擰檬酸0. 115%。
5. 根據權利要求1所述的一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟(3)中物理吸附法，包括5 10ml的100 5000U/L酶液中加入細菌纖維 素小球0. 05 0. 4g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4。C條件下吸附6 24h，取出細菌 纖維素小球，用pH4. 8 5. 2的醋酸鈉緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4t:冰箱 保存。
6. 根據權利要求1所述的一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟(3)中吸附 交聯法，包括5 10ml的100 5000U/L酶液中加入細菌纖 維素小球0. 05 0. 4g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4。C條件下吸附6 24h，以lg纖 維素小球25 200mL戊二醛溶液的比例加入質量體積百分比為25%的戊二醛溶液，20 3(TC攪拌條件下交聯反應1 3h，取出細菌纖維素小球，用pH4. 8 5. 2的醋酸鈉緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4t:冰箱保存。 全文摘要
本發明涉及一種以球形細菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，包括將活化的斜面菌種接入種子培養基培養制得液體種子，然后轉接至發酵培養基中，25～30℃，80～200rpm條件下培養48～96h，傾濾，得細菌纖維素小球；將細菌纖維素小球用0.1％的NaOH在80～90℃水浴中處理30～120min，去離子水漂洗，收集，用0.1％的醋酸中和小球內殘留的堿液，靜置，去離子水漂洗，將小球取出，吸干表面水分，冷凍，然后冷凍干燥后獲得纖維素小球；最后采用物理吸附法或吸附～交聯法制備固定化酶。本發明的球形細菌纖維素小球能高效吸附生物酶，最大限度地保持酶的活性，且安全環保，方法簡單，易于操作，可控性強。
文檔編號C12P19/04GK101705222SQ20091019853
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月10日 優先權日2009年11月10日
發明者曹張軍, 杜明, 楊光, 楊雪霞, 洪楓, 鄒敏 申請人:東華大學