一種重組單純皰疹病毒遺傳操作系統及其應用的制作方法

專利名稱：一種重組單純皰疹病毒遺傳操作系統及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及一種應用于基因治療的重組單純皰疹病 毒遺傳操作系統，該系統可廣泛應用于復制缺陷型重組單純皰疹病毒和選擇復制型溶瘤單 純皰疹病毒的建立。
背景技術：
基因治療是近廿年來醫學研究的熱點領域。基因治療就是將人的正常基因或有治 療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達 到治療疾病目的的生物醫學新技術。與常規治療方法不同一般意義上的疾病治療針對的 是因基因異常而導致的各種癥狀，而基因治療針對的是疾病的根源一異常的基因本身。目 前已發現人類與疾病相關的基因約有5000多個，迄今已有1/3被分離和確認。因而，基因 治療將是醫學和藥學領域的一次革命，必將成為21世紀重要的醫藥產業。基因治療的發展 極其迅速，據統計，自1990年美國FDA正式批準第一個基因治療臨床試驗開始，截止2009 年3月，世界范圍內已有1537個各期基因治療臨床研究方案(http://www.wi ley. co.uk/ genmed/clinical/)，涵蓋了遺傳病(如血友病、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血癥等)、惡 性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、類風濕等)等眾多威脅嚴重人類健康的疾病。 其中III期臨床研究有52個，另外中國SFDA還在世界上首次批準了 2個基因治療新藥上 市。但是，總體上講，基因治療技術和產品還處在其發展的初期階段，仍面臨著諸多問題與 挑戰，其中最主要的挑戰之一就是基因導入系統效率低下。發展新的基因導入系統是當前 基因治療的最重要研究方向之一。目前，基因導入系統主要包括病毒載體系統和非病毒載體系統，其中病毒載體系 統由于其天然的嗜細胞活性使之處于基因治療導入系統的主導地位，占目前全體基因治療 臨床方案的68.6%。由于技術原因，逆轉錄病毒(占21. 2%)和腺病毒(占1%) —度 分別成為最主要的基因導入系統。近年來，單純皰疹病毒由于其卓越的性能正越來越受到 基因治療研究專家的重視。單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)HSV分為I型和II型，其中被用作基 因治療載體通常是I型(HSV-I)。HSV-I是包膜雙鏈DNA病毒，其基因組長為1521Λ，由2個 相互連接的長節段( 和短節段(Us)組成，各節段末端為倒轉重復序列。基因組編碼84個 基因，這些基因可根據他們在病毒復制過程中是否表達分為必需基因和非必需基因，不過 非必需基因對于病毒-宿主的相互作用非常重要，如涉及到免疫逃逸、在非分裂細胞中復 制或關閉宿主蛋白合成等功能。HSV-I生活周期包括裂解感染(Lytic infection)和潛伏 期(Latency)。在裂解感染過程中，病毒基因的表達是有嚴格的時空順序的，分為極早期基 因(immediate-early gene, IE 或 α)、早期基因(Early gene，E 或 β)和晚期基因(Late gene, L或Y )，極早期基因包括ICPO、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47等5個感染細胞蛋白 (infected cell protein, I CP)基因，其中 ICP4 和 ICP27 是必需基因。HSV-I是基因治療常用的、也是極其優秀的病毒載體，主要表現在
(I)HSV-I的宿主細胞范圍廣，HSV-I的細胞進入受體HveA和HveC廣泛表達于各 種未知功能的細胞表面蛋白；(2)感染效率高，即使在感染復數(MOI)很低的情況下，復制缺陷的HSV在體外仍 然可以感染70%左右的細胞群體；(3)可高效感染靜息期和非靜息期細胞，表達外源基因；(4)容量大，可插入外源大片段，因為HSV-I基因組編碼的基因中有一半是非必需 基因，可被外源治療基因所替換；(5)可方便地制備和純化高滴度的復制缺陷重組體，沒有野生型病毒體的污染；(6)可在神經元細胞內建立潛伏感染，持續穩定表達治療基因；(7)復制缺陷重組體進入細胞后可產生流產的基因表達級聯鏈(abortive gene expression cascade)，建立類似于潛伏感染的狀態，只不過不能被再激活，這有助 于增強外源基因在神經元細胞和非神經元細胞中的慢性長期表達(chronic transgene expression)0一般來說，可通過三種方式把HSV基因組改造為非致病性的基因治療的載體一 是擴增子(Amplic0ns)載體，即僅把HSV的復制起點和包裝信號序列插入到質粒中，當將其 轉染至包裝細胞并以HSV輔助病毒超感染后，便可獲得含有擴增子的假病毒；二是重組復 制缺陷型載體(Iteplication-defective Vectors)，即剔除了與復制相關的必需基因及非 必需基因，以減少細胞毒性，多用于在宿主神經元細胞內長期表達外源性治療基因；三是條 件復制型載體(Conditionally Replicating Vectors)，即剔除了非必需基因、保留了復制 相關基因，因其具有裂解細胞的特性，主要作為溶瘤病毒來選擇性殺傷腫瘤細胞。溶瘤單純皰疹病毒是目前研究得最多的溶瘤病毒之一，其原因在于溶瘤單純皰疹 病毒具有很多優勢，除了上述單純皰疹病毒的宿主細胞范圍廣、感染效率高的優勢外，還在 于(1)在感染的宿主細胞中，HSV-I的全部復制循環過程可在20小時內結束，釋放出 數千計的子代病毒顆粒；(2) HSV-I病毒顆粒既能通過細胞膜融合進行直接的細胞-細胞傳播，也能通過細 胞外空間(extracellular space)進行傳播，這對于溶瘤病毒尤其有用，因為低劑量的病毒 就可以在實體瘤內實現高效的病毒侵入(Viral Penetration)；(3)臨床上有多種抗HSV-I的藥物(如無環鳥苷、泛昔洛韋等)用于治療HSV-I 的感染，而HSV-I表達抗腫瘤自殺基因——胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)。這就為HSV-TK的抗腫瘤作用提供了一個安全機制，因為可用藥物關閉 HSV-I的復制循環；(4) HSV-I能有效感染多種實驗動物，有利于建立動物模型，也便于把臨床前研究 結果平移到(translation)臨床試驗中。然而，盡管HSV具有如此多的優勢，但相對于腺病毒等而言，HSV基因治療技術還 是發展得較慢，截止2009年3月，以HSV為載體的基因治療臨床方案只有51個，占全部基因 治療方案的 3. 3% (http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/)。這其中的主要原因是 HSV-I是基因組長達152kb的雙鏈DNA病毒，而且有多個基因如ICP0、ICP4、ICP34. 5等為 雙拷貝，因此要對HSV-I進行遺傳操作就相對困難得多。不過，經過近30年的努力，HSV-I遺傳操作的獲得了很大的發展，總體而言涉及HSV-I的遺傳操作的主要技術有(1)化學誘變這是最早的對HSV-I進行遺傳操作的方法，采用化學誘 變劑進行隨機突變并篩選預期表型，這種方法主要篩選到的是溫度敏感型突變體 (Temperature-sensitive Mutant)、細胞溶角軍抗個生突變體(Cytolysis-resistant Mutant)、藥物抗個生突變體(Drug-resistant Mutants)。(2)同源重組這也是一種早期的HSV-I遺傳操作技術，經細胞內同源重組直接將 目的基因插人HSV骨架中，為便于篩選突變體，需要同時導入標記基因。本法若涉及必需基 因(Essential Gene)突變，還需要同時構建包裝細胞系。(3)擴增子所謂擴增子就是僅把HSV-I的DNA復制原點oriS和包裝信號序列 pac插入到細菌質粒中，當其與HSV-I輔助病毒共轉染包裝細胞時，可以串聯體形式包裝形 成獲得含有擴增子的假病毒。但輔助病毒會帶來重組等安全性問題。擴增子載體最大的優 點在于基本上消除了 HSV-I的毒性或免疫原性，外源基因容量較大(通常可達數十1Λ，最高 可達 150kb)。(4) COS系統先把HSV-I基因組分別轉載在一系列交互重疊的COS質粒(通常是 5個或以上)中，然后根據需要用分子生物學技術對其中某一個特定的COS質粒做基因工程 操作，交互重疊的COS質粒經線性化后共轉染許可細胞(Permissive Cell)，從而經同源重 組得到突變體。本法最大的優點在于只有突變體產生，沒有野生型HSV-I的污染，但缺點在 于通常在COS質粒中沒有用于制造突變的合適的限制性內切酶位點可用，且某些COS質粒 遺傳不穩定并由此導致不必要的突變出現。(5) BAC 技術細菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosomes，BAC)技術 是近年來發展起來的HSV-I遺傳操作新技術，主要應用的是等位交換(Allelic Exchange) 原理，其基本過程是首先構建一個攜帶目的基因及同源臂的BAC質粒，與病毒基因組一起 共轉染細胞(如Vero)，經細胞內同源重組把BAC質粒插入病毒基因組中，然后提取可復制 的重組病毒基因組環狀中間體并轉化E. coli，從而獲得大量的HSV-BAC，在對HSV-BAC進行 必要的遺傳操作后轉染Vero細胞，收獲重組病毒。BAC技術最大的優點在于其包裝容量大 (可包裝整個病毒基因組)、無需輔助病毒、遺傳操作簡單。BAC技術是目前HSV-I遺傳操作 的主流技術。(6)嵌合病毒(Chimeric Virus)，亦稱雜合病毒(Hybrid Virus)。HSV不能整合 入宿主細胞染色體，因此只能短暫表達外源基因，最終在分裂細胞會導致丟失。嵌合病毒就 能彌補這種缺憾，與HSV形成嵌合病毒通常是EBV、AAV和逆轉錄病毒等。基于此，本發明就針對HSV-I的基因組大、遺傳操作難度高的問題，設計并提供一 種新的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，該系統是基于BAC質粒骨架建立的，并融合入了 Cre-loxP, FLP-FRT等位點特異性重組酶系統，有效降低了單純皰疹病毒遺傳操作的難度， 顯著提高了其遺傳操作的便利性和可操控性，可廣泛應用于復制缺陷型重組單純皰疹病毒 和選擇復制型溶瘤單純皰疹病毒的建立。

發明內容
本發明主要目的是設計并建立一種新的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統。應用該 操作系統可以便捷、高效地對單純皰疹病毒進行各種遺傳操作，廣泛地應用于建立各種復制缺陷型重組單純皰疹病毒和選擇復制型溶瘤單純皰疹病毒。本發明提供了一種重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，包括HSV骨架載體和穿梭質 粒；所述的HSV骨架載體包含HSV基因組DNA、BAC質粒骨架、多克隆位點、真核抗性基因以 及原核抗性基因，在多克隆位點和真核抗性基因的外側融入位點特異性重組酶系統識別序 列；所述的穿梭質粒是包含多克隆位點的細菌克隆載體，并且在多克隆位點外側融入位點 特異性重組酶系統識別序列。所述的位點特異性重組酶系統識別序列是LoxP序列、FRT序列、attP或attB序列 中的一種或者幾種。多克隆位點通常用于插入外源DNA序列。HSV骨架載體和穿梭質粒的多克隆位點 都是由一系列外切酶的編碼序列串聯而成，兩者的多克隆位點可以相同，也可以不相同。多 克隆位點含有以下一種或者幾種酶切位點HindI 11,EcoRI、Mel、KpnI、EcoRV、NotI、SphI、 NcoI、XhoI、SmaI、PacI、NheI、BamHI、PmeI 或者 Sail。該重組單純皰疹病毒遺傳操作系統還包括表達重組酶的質粒。所述的重組酶是 Cre酶、FRT酶、Φ031或者ΦΒΤ1整合酶。表達這些重組酶的質粒可以選自市售的相應重 組酶的表達質粒。BAC 質粒骨架來源但不限于BAC 克隆載體 pBeloBACll(New England Biolabs)、 pSMART" BAC(Lucigen)和 pBACe3. 6 (Frengen et al. 1999)等。[Ref :Frengen，Ε· et al. (1999)A Modular, Positive Selection Bacterial Artificial Chromosome Vector with Multiple Cloning Sites. Genomics 58 :250-253.]。真核抗性基因包括但不限于卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene, KanO、潮霉素抗性基因(Hygromycin resistance gene，Hyglr)、新霉素抗性基因(Neomycin resistance gene, Neor)、吉歐霉素抗性基因(Zeocin resistance gene, Zeor)等。原核抗性基因包括但不限于氯霉素抗性基因(Chloramphenicol resistance gene, Cmr)、四環素抗性基因(Tetracycline resistance gene, Tetr)等。位點特異性重組酶系統識別序列包括但不限于Cre酶識別的LoxP序列、FLP酶識 別的FRT序列、Φ〇31與ΦΒΤ1整合酶識別的attP和/或attB序列等。上述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統還可以包含熒光蛋白基因等目標基因。熒 光蛋白基因包括但不限于紅色熒光蛋白基因DsRedl、綠色熒光蛋白基因GFP、黃色熒光蛋 白基因YFP及他們的增強型等。本發明還提供了上述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統的制備方法首先，構建 同源重組前體質粒，該質粒包含多克隆位點MCS、熒光蛋白基因、真核抗性基因以及原核抗 性基因，在MCS和真核抗性基因的外側融入位點特異性重組酶系統識別序列；其次，同源重 組前體質粒pRKBAC-MCS中插入了 HSV基因組的兩條同源臂DNA ；再次，構建穿梭質粒，在細 菌克隆載體的多克隆位點MCS2外側融入位點特異性重組酶系統識別序列。具體步驟包括1.構建同源重組前體質粒通常用于基因治療的單純皰疹病毒HSV-I的基因組達1521Λ，對其整體進行遺傳 操作難度很大。隨著基因工程技術的進步，細菌人工染色體BAC技術成為目前HSV-I遺傳 操作的主流技術。本發明所設計的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統就是建立在BAC技術的基礎上，同時融合入Cre-loXP、FLP-FRT等位點特異性重組酶系統。這些核心特征就完整地 集中設計在同源重組前體質粒中。本發明就應用常規分子克隆技術，構建同源重組前體質 粒pRKBAC-MCS (圖1)，其特征包括但不限于基于BAC質粒骨架建立，包含多克隆位點MCS、 (熒光蛋白基因、)真核抗性基因以及原核抗性基因，在MCS和真核抗性基因的外側融入位 點特異性重組酶系統識別序列。
其中，BAC質粒骨架來源但不限于BAC克隆載體pBeloBACl 1 (New England Biolabs)、pSMAR"T BAC (Lucigen)和 pBACe3. 6 (Frengen et al. 1999)等。[Ref :Frengen， Ε. et al. (1999)A Modular, Positive Selection Bacterial Artificial Chromosome Vector with Multiple Cloning Sites. Genomics 58 :250-253.]多克隆位點MCS 包括但不限于5，-BamHI-Xho I -Pme I -No 11 -Hi nd 111 -Sac I -Pac 1-3，熒光蛋白基因包括但不限于紅色熒光蛋白基因DsRedl、綠色熒光蛋白基因GFP、 黃色熒光蛋白基因YFP及他們的增強型等。真核抗性基因包括但不限于卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene, KanO、潮霉素抗性基因(Hygromycin resistance gene，Hyglr)、新霉素抗性基因(Neomycin resistance gene, Neor)、吉歐霉素抗性基因(Zeocin resistance gene, Zeor)等。原核抗性基因包括但不限于氯霉素抗性基因(Chloramphenicol resistance gene, Cmr)、四環素抗性基因(Tetracycline resistance gene, Tetr)等。位點特異性重組酶系統識別序列包括但不限于Cre酶識別的LoxP序列、FLP酶識 別的FRT序列、Φ〇31與ΦΒΤ1整合酶識別的attP和/或attB序列等。2.構建單純皰疹病毒骨架載體單純皰疹病毒骨架載體是其遺傳操作系統的核心組分之一，它是把單純皰疹病毒 基因組DNA插入BAC質粒內，以便于在大腸桿菌內對單純皰疹病毒基因組進行遺傳操作。本 發明中，單純皰疹病毒骨架載體是基于同源重組前體質粒pRKBAC-MCS建立起來的。首先從 HSV基因組中經PCR或酶切得到兩條同源臂(Homologous Arm,HA)并插入同源重組前體質 粒pRKBAC-MCS中，構建成同源重組質粒pRKBAC-HA，然后把同源重組質粒pRKBAC_HA與HSV 基因組DNA共同轉染包裝細胞系Vero及其衍生細胞系，在包裝細胞系中進行同源重組，并 因此建立HSV骨架載體pHsvfesy-X。HSV骨架載體pHsvfesy-X的特征包括但不限于在同源重組前體質粒pRKBAC-MCS 中插入了 HSV基因組DNA。其中，所插入的HSV基因組DNA可以是全長的HSV基因組DNA， 也可以是缺失部分序列的HSV基因組DNA，HSV基因組既可是野生型，也可是突變型。上述提供基因組的HSV包括但不限于1型HSV (HSV type 1，HSV-1)和2型 HSV(HSV-2)。3.構建穿梭質粒穿梭質粒也是其遺傳操作系統的核心組分之一，它主要功能是向HSV骨架載體 PHsvEasy-X中導入外源基因或基因片段。本發明應用常規的分子克隆技術建立穿梭質粒 pHsvShuttle-MCS(+)(圖2)，其特征包括但不限于基于常規細菌克隆載體建立，包含多克 隆位點MCS，在MCS外側融入位點特異性重組酶系統識別序列。其中，常規細菌克隆載體包括但不限于p0RF_MCS、pTransfer, pUC18等
多克隆位點MCS 但不限于5，-SalI-HindIII-EcoRl-Sacl-KpnI-EcoRV-Not I-SphI-NcoI-XhoI-SmaI-PacI-NheI-BamHI-3‘。該 MCS 方向亦可倒置，則載體命名為 pHsvShuttIe-MCS(-)。位點特異性重組酶系統識別序列包括但不限于Cre酶識別的LoxP序列、FLP酶識 別的FRT序列、Φ031與ΦΒΤ1整合酶識別的attP和/或attB序列等。并且，該位點特異 性重組酶系統識別序列與同源重組前體質粒pRKBAC-MCS中的位點特異性重組酶系統識別 序列相一致。根據需要，穿梭質粒pHsvShuttIe-MCS可攜帶或不攜帶外源腫瘤治療基因。本發明還提供了上述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統的應用，即將該重組單純 皰疹病毒遺傳操作系統用于構建復制缺陷型的重組單純皰疹病毒。也可以，將該重組單純皰疹病毒遺傳操作系統用于構建選擇復制型的溶瘤單純皰 疫病毒。上述同源重組前體質粒pRKBAC-MCS、HSV骨架載體pHsvfesy-X及穿梭質粒 pHsWhuttle-MCS共同構成了多功能、通用型重組單純皰疹病毒遺傳操作系統。該系統基 于BAC技術，并融入了 Cre-loxP、FLP-FRT等位點特異性重組酶系統，有效提高了單純皰疹 病毒遺傳操作的便利性和可操控性。應用基本的分子生物學技術，就可把該重組單純皰疹 病毒遺傳操作系統廣泛地應用于建立各種復制缺陷型重組單純皰疹病毒和選擇復制型溶 瘤單純皰疹病毒，并進一步用于腫瘤基因治療研究。本發明的實施例中，首先用常規方法制備包含HSV骨架載體pHsvfesy-X的電轉化 用E. coli感受態細胞，按照常規的E. coli電轉化方法，把穿梭質粒pHSVaiuttle-MCS(+) 與整合酶(integrates) FTP的表達質粒pET-FTP共同導入上述含HSV骨架載體pHsvfesy-X 的E. coli感受態細胞，電擊后的E. coli細胞抗性篩選，培養過夜。鑒定并獲得FTP-FRT位 點特異性重組所得到的HSV-BAC質粒。繼而用常規試劑盒大規模制備上述得到的HSV-BAC質粒DNA。把HSV-BAC質粒與 整合酶Cre的表達質粒共轉染Vero細胞。常規篩選培養后，分別收獲細胞及上清液，反復 凍融細胞釋放病毒顆粒。取一份凍存病毒液樣品稀釋，感染Vero細胞，培養3_5天，在熒光顯微鏡下挑選 6-10個無紅色熒光的噬斑，分別反復凍融釋放病毒。去上述病毒液感染培養于Vero細胞， 并大量擴增培養，收獲病毒液。用Southern Blot、PCR等常規分子生物學技術對上述病毒 進行鑒定，最終所得到的重組病毒符合預期。按照上述方法構件的含有熒光蛋白基因的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統也同 樣與預期相同，說明本發明的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統不僅是建立復制缺陷型重組 單純皰疹病毒和選擇復制型溶瘤單純皰疹病毒的高效工具，而且能夠有效的攜帶表達外源 目的基因。本發明提供一種重組單純皰疹病毒遺傳操作系統。該系統是基于細菌人工染色體 BAC質粒骨架建立的，融合入Cre-loxP、FLP-FRT等位點特異性重組酶系統，包括同源重組 前體質粒pRKBAC-MCS、HSV骨架載體pHsvfesy-X及穿梭質粒pHsvShuttIe-MCS等部分，有 效提高了單純皰疹病毒遺傳操作的便利性和可操作性，可廣泛應用于復制缺陷型重組單純 皰疹病毒和選擇復制型溶瘤單純皰疹病毒的建立。8
與其它重組單純皰疹病毒遺傳操作系統相比較，本發明提供重組單純皰疹病毒遺 傳操作系統具有更多的優勢和創新性，具體主要表現在(1)單純皰疹病毒的整個重組遺 傳操作過程主要集中在大腸桿菌中完成，方便、快捷且費用低廉；( 全部重組單純皰疹病 毒遺傳操作系統只包含三個質粒，組分簡單、高效。其中同源前體質粒與HSV骨架載體相關 聯可方便克隆不同來源的HSV，穿梭質粒與HSV骨架載體相關聯便于外源基因插入；(3)同 源重組前體質粒、穿梭質粒中特別設計的多克隆位點尤其適合于各種HSV基因組及外源基 因的克隆；(4)該遺傳操作系統把細菌人工染色體技術和位點特異性重組酶系統有機地結 合在一起，解決了 HSV基因組容量大、難操作的問題；(5)該遺傳操作系統可同時適用于復 制缺陷型重組單純皰疹病毒和選擇復制型溶瘤單純皰疹病毒的建立，不需要分列的獨立系 統。


圖1同源重組前體質粒pRKBAC-MCS物理圖譜。圖2穿梭質粒pHsv^iuttIe-MCS物理圖譜。
具體實施例方式實施例1同源重組前體質粒的建立同源重組前體質粒是建立單純皰疹病毒骨架載體的基礎。本發明實施例的同源 重組前體質粒pRKBAC-MCS是基于BAC質粒克隆載體pBeloBACll (New England Biolabs) 建立的。pBeloBACll中包含大腸桿菌(E. coli)F因子的DNA復制原點0ri2、原核生物選 擇標記基因Cnf，它在E. coli中以單拷貝形式存在，可克隆3001Λ的DNA片段并保持其穩 定性。采用常規的分子克隆技術，先行在復制原點0ri2與選擇標記Cnf之間插入來質粒 pDsRedl-Nl (Clontech)中的紅色熒光標記基因 RFP (Red Fluorescent Protein，RFP)，然后 用人工合成的多克隆位點區(Mutiple Cloning Site, MCS)取代pBeloBACll中克隆位點、 克隆選擇標記基因lacZ、COS位點和LoxP位點，該MCS的5’端攜帶LoxP位點，3’端攜帶 FRT位點，從而構成中間質粒pRBAC-MCS。中間質粒pRBAC_MCS經I^acI酶切后插入真核抗 性基因Karf，從而建立同源重組前體質粒pRKBAC-MCS (附圖1和SEQ No. 1)。實施例2單純皰疹病毒骨架載體的建立單純皰疹病毒骨架載體是基于同源重組前體質粒pRKBAC-MCS，應用基因克隆和同 源重組等技術把HSV基因組DNA導入到BAC質粒中，因此便于HSV基因組在E. coli中保 存、傳代和進行遺傳操作。本發明實施例中，以HSV-I突變系G47 Δ (溶瘤HSV)為對象，應 用常規PCR技術擴增長約1. 0-2. Okb的同源臂haL和haR，并經酶切插入同源重組前體質粒 pRKBAC-MCS的多克隆位點區，構建成同源重組質粒pRKBAC-HA。把同源重組質粒pRKBAC_HA 與G47 Δ基因組DNA混合共同轉染非洲綠猴腎細胞系Vero，進行同源重組，3天后收獲子代 病毒。繼而用子代病毒感染Vero細胞，并覆蓋以0. 75%的瓊脂糖上層，同時以G418抗性 選擇，繼續進行常規細胞培養5-7天后，在熒光顯微鏡下挑選紅色的G418抗性噬斑。這些 紅色的抗性噬斑繼續在Vero細胞中感染倍增一次后繼而感染HEK293，2小時后收獲全細胞DNA，并電轉E. coli DHlOB(Invitrogen)，并涂布于含Cm(15 μ g/ml)的瓊脂平皿。挑選若 干Cm抗性菌落，抽提BAC質粒DNA，用HindIII酶切和PCR擴增鑒定重組子。所得到的包含 HSV基因組的重組BAC質粒即是HSV骨架載體pHsvfesy-X。實施例3穿梭質粒的建立穿梭質粒是向HSV骨架載體pHsvfesy-X中導入外源基因或基因片段的載體。本 發明實施例中，穿梭質粒骨架來源于質粒pORF-MCS anvivogen)。通過平端連接的方法用人 工合成的多克隆位點區MCS取代pORF-MCS中的全部開放閱讀框(經NdeI與I^cI雙酶切 后補平末端)，在MCS的兩端包含LoxP和FRT序列。重組質粒根據MCS的插入方向分別命 名為 pHsvShuttle-MCS(+)(附圖 2 和 SEQNo. 2)或 pHsvShuttle-MCS (-)。穿梭質粒pHSVaiuttle-MCS(+)可進一步用于插入外源腫瘤治療基因、報告基因 或其它需要克隆入HSV基因組中的DNA片段(如腫瘤特異性基因啟動子等)。本發明實 施例進一步向pHsvShuttle-MCS(+)中插入綠色熒光蛋白報告基因EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)，完整的EGFP表達框來源于質粒pFUGW(Addgene)。重組質粒 命名為 pHsvShuttle-EGFP。實施例4復制缺陷型的重組單純皰疹病毒的建立上述建立的HSV骨架載體pHsvfesy-X與穿梭質粒pHsvShuttle-MCS (+)或其衍 生質粒可直接用于構建復制缺陷型的重組單純皰疹病毒。本發明實施例中，首先用常規方 法制備包含HSV骨架載體pHsvfesy-X的電轉化用E. coli感受態細胞，按照常規的E. coli 電轉化方法，把穿梭質粒pHSVaiuttle-MCS(+)及其報告基因pHsvShuttIe-EGFP與整合酶 (integrates) FTP的表達質粒pET_FTP共同導入上述含HSV骨架載體pHsvEasy-X的E. coli 感受態細胞，電擊后的E. coli細胞首先轉入加入含四環素(10 μ g/ml)的500 1S0C的試管 中30°C振蕩培養1小時，然后取其中100 μ 1轉入含四環素(10 μ g/ml)、氨芐(50 μ g/ml) 和氯霉素(15 μ g/ml)的900 μ 1 SOC中在30°C下繼續振蕩培養3小時。取50-250 μ 1上 述培養物涂布于含氨芐(50 μ g/ml)和氯霉素(15 μ g/ml)的LB平皿，于43°C下培養過夜。 從平皿中挑選6-10個單菌落于37°C下小規模體積(5ml)培養過夜。用常規堿法提取上述 BAC的DNA，并用HindIII酶切和PCR擴增等常規方式鑒定其重組結果。經上述FTP-FRT位 點特異性重組所得到的HSV-BAC質粒分別命名為pHsvfesy-null及pHsvfesy-EGFP。繼而用常規試劑盒大規模制備( 250ml)pHsvfesy-null及pHsvfesy-EGFP質 粒DNA。把HSV-BAC質粒pHsvEasy-nul 1及pHsvEasy-EGFP與整合酶Cre的表達質粒 pcDNA3-nCre按常規方法共轉染Vero細胞，并在含6% FBS和G418 (300mg/ml)的DMEM中繼 續常規培養60小時。分別收獲細胞及上清液，反復凍融細胞釋放病毒顆粒，4°C下3500rpm 離心15分鐘除去細胞碎片，將上清液合并轉入上述病毒液中，分成若干等分，于-80°C下凍 存。取一份凍存病毒液樣品分別用含G418(300mg/ml)和2% FBS的DMEM稀釋103、IO4UO5 和IO6倍，每一稀釋度取其中的100 μ 1用于感染培養于96孔板中的Vero細胞，37°C下常 規細胞培養3-5天，在熒光顯微鏡下挑選6-10個無紅色熒光的噬斑，分別反復凍融釋放病 毒，離心后將病毒上清液轉入EP管中于-80°C下凍存。取上述凍存病毒液50 μ 1梯級感染 培養于Vero細胞，并大量擴增培養，收獲病毒液。用Southern Blot、PCR等常規分子生物學技術對上述病毒進行鑒定，最終所得到的重組病毒分別命名為oHSV-null和oHSV-EGFP。SEQUENCE LISTING<110>復旦大學<120> 一種重組單純皰疹病毒遺傳操作系統及其應用<130>76<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>9725<212>DNA<213>Artificial<400>10093]agatctataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgtaccaggagtaggtaggat600094]ccctcgaggtttaaacgcggccgcaagcttgagctcttaatatgtatccg1200095]ctcatgagacaataaccctgataaatgcttgaaaaaggaagagtcctgag1800096]gcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccc2400097]cagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagt3000098]ccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaacca3600099]tagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctc4200100]cgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctg4800101]agctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgat5400102]caagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttct6000103]ccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgc6600104]tctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagacc7200105]gacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggcc7800106]acgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactgg8400107]ctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgag9000108]aaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc9600109]ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggt10200110]cttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttc10800111]gccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc11400112]tgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg12000113]ctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggcta cccgtgatattgctgaagag12600114]CttggCggCgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacg gtatcgccgctcccgattcg13200115]cagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagaattcag ctcgctgatc13800116]agcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttc14400117]cttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc15000118]gcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg15600119]ggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcg gtgggctcta tggcttctga1620
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1.一種重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，其特征在于，該重組單純皰疹病毒遺傳操作 系統包括HSV骨架載體和穿梭質粒；所述的HSV骨架載體包含HSV基因組DNA、BAC質粒骨 架、多克隆位點、真核抗性基因以及原核抗性基因，在多克隆位點和真核抗性基因的外側融 入位點特異性重組酶系統識別序列；所述的穿梭質粒是包含多克隆位點的細菌克隆載體， 并且在多克隆位點外側融入位點特異性重組酶系統識別序列。
2.根據權利要求1所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，其特征在于，所述的位點 特異性重組酶系統識別序列是LoxP序列、FRT序列、attP或attB序列中的一種或者幾種。
3.根據權利要求1所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，其特征在于，所述的多克 隆位點含有以下一種或者幾種酶切位點HindIII、EcoRI、SacI、KpnI、EcoRV、NotI、SphI、 NcoI、XhoI、SmaI、PacI、NheI、BamHI、PmeI 或者 Sail。
4.根據權利要求1所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，其特征在于，所述的原核 抗性基因是氯霉素抗性基因或者四環素抗性基因。
5.根據權利要求1所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，其特征在于，所述的真核 抗性基因是卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因或者吉歐霉素抗性基因 中的一種或者幾種。
6.根據權利要求1所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，其特征在于，該重組單純 皰疹病毒遺傳操作系統還包括重組酶。
7.根據權利要求6所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，其特征在于，所述的重組 酶是Cre酶、FRT酶、C31或者BTl整合酶。
8.根據權利要求1所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統的制備方法，其特征在于， 首先，構建同源重組前體質粒，該質粒包含多克隆位點MCS、熒光蛋白基因、真核抗性基因以 及原核抗性基因，在MCS和真核抗性基因的外側融入位點特異性重組酶系統識別序列；其 次，同源重組前體質粒pRKBAC-MCS中插入了 HSV基因組的兩條同源臂DNA ；再次，構建穿梭 質粒，在細菌克隆載體的多克隆位點MCS2外側融入位點特異性重組酶系統識別序列。
9.權利要求1所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統在構建復制缺陷型的重組單純 皰疹病毒中的應用。
10.權利要求1所述的重組單純皰疹病毒遺傳操作系統在構建選擇復制型的溶瘤單純 皰疹病毒中的應用。
全文摘要
本發明屬于醫藥生物技術領域，提供了一種重組單純皰疹病毒遺傳操作系統。該重組單純皰疹病毒遺傳操作系統，包括HSV骨架載體和穿梭質粒；所述的HSV骨架載體包含HSV基因組DNA、BAC質粒骨架、多克隆位點、真核抗性基因以及原核抗性基因，在多克隆位點和真核抗性基因的外側融入位點特異性重組酶系統識別序列；所述的穿梭質粒是包含多克隆位點的細菌克隆載體，并且在多克隆位點外側融入位點特異性重組酶系統識別序列。該系統有效提高了單純皰疹病毒遺傳操作的便利性和可操作性，可廣泛應用于復制缺陷型重組單純皰疹病毒和選擇復制型溶瘤單純皰疹病毒的建立。
文檔編號C12N7/00GK102051379SQ20091019857
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月10日 優先權日2009年11月10日
發明者方煜翔, 田聆, 薛京倫, 陳金中 申請人:復旦大學