一種人羊膜間充質干細胞懸液的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥【技術領域】，提供了一種人羊膜間充質干細胞懸液在制備治療對化療藥物導致的不孕癥藥物中的應用。本發明制備的羊膜間充質干細胞懸液可以通過：1.增加化療藥物損傷的卵巢中卵泡數量，防止卵巢組織的纖維化；2.改善下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的生殖內分泌功能，從而恢復受損卵巢的排卵功能，對化療藥物導致的不孕癥小鼠具有明顯的治療作用。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體涉及一種人羊膜間充質干細胞懸液的應用。 一種人羊膜間充質干細胞懸液的應用
【背景技術】
[0002] 隨著化療藥物的廣泛應用，許多惡性腫瘤和自身免疫性疾病患者的病情得到控制 或緩解，壽命延長；但年輕女性患者面臨的一個問題是化療本身引起的卵巢損傷，甚至導致 卵巢早衰，引起不孕，給患者帶來一系列生理、心理、社會問題；現已成為影響婦女生殖健康 和社會穩定的不可忽視的因素。如何減輕或預防化療所致的卵巢損傷、恢復育齡女性的生 育功能，目前已成為生殖醫學、再生醫學界研究的熱點。
[0003] 間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一種具有自我更新、復制和 多潛能細胞，體外培養下的間充質干細胞可向不同的譜系分化，有望充當多種器官改建或 損傷后修復的細胞。羊膜和絨毛膜是胎盤的兩個主要部分，羊膜跟絨毛膜緊貼在一起，為 胎膜的最內層，從細胞滋養層衍化而來，為光滑、無血管、神經以及淋巴的半透明薄膜，有一 定彈性，其厚度為0.02-0.05mm。羊膜由羊膜上皮（Amniotic Epithelial cells，AEC)和 間質層（Amniotic Stromal, AS)組成，上皮層由緊密排列的柱狀上皮細胞構成，面向胎兒， 而間質層則為疏松的結締組織，羊膜間充質干細胞（Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells，hAMSCs)就分散于該間質層。作為取材相對容易的間充質千細胞，目前羊膜間充質干 細胞已成為繼骨髓間充質干細胞之后另一備受關注的間充質干細胞，已成為間充質干細胞 來源的新的研究熱點，羊膜間充質干細胞作為種子細胞在臨床移植治療過程中有著潛在的 運用前景。
[0004] 化療藥物引起的卵巢損傷，屬于目前研究的熱點與難點，尚無統一、有效的治療手 段，尤其對其所導致的無排卵性不孕癥，更是一籌莫展；間充質千細胞的研究，為此類患者 帶來了曙光。以往對該病的生物醫學治療、研究，主要集中在人骨髓或者胚胎來源的間充質 干細胞向卵母細胞的誘導分化方面，但由于人骨髓來源的間充質干細胞的獲得需要通過骨 髓穿刺，而且其數量隨年齡的增長而急劇下降。眾所周知，由于組織中間充質千細胞含量極 少，人骨髓中的間充質干細胞含量極低，一般104-105個單核細胞中僅含有1個間充質千細 胞，這就限制了人骨髓源間充質干細胞的應用。在間充質干細胞培養過程中，眾多因素影響 細胞擴增和分化，其中營養物耗竭和代謝副產物累積所導致的培養環境惡化是限制、抑制 細胞擴增和分化的主要問題之一。而胚胎千細胞多來源于行輔助生殖助孕周期（即試管嬰 兒），病人廢棄的胚胎；這些細胞組織來源稀少，取材比較困難，具有攜帶傳染病的風險、免 疫排斥反應、遠期致瘤性等弊端，同時受到醫學倫理學的限制，難以廣泛開展相關基礎及臨 床研究；且胚胎干細胞在體外長期擴增過程中易于喪失自我更新能力和多向分化潛能，因 此其在臨床上的應用受到嚴重限制。
[0005] 羊膜作為孕婦分娩后的廢棄物，與捐獻骨髓、胚胎或采集臍帶、臍血等其它組織來 源間充質千細胞相比，具有組織來源廣泛、易于獲得，且污染機會少；獲取方便、對供體無傷 害；無血液制品攜帶傳染病的風險；羊膜為胚胎時期的組織，且直接由中胚層發育而來，分 化程度較低，因此羊膜間充質干細胞免疫原性更低，無免疫排斥反應；不具有無遠期致瘤 性；無倫理道德問題，對其研究和應用無倫理學的爭論等優勢。羊膜間充質干細胞和其他胎 盤源性干細胞相比，在未來的應用中具有明顯優勢。作為取材相對容易的間充質干細胞，目 前羊膜間充質干細胞已成為繼骨髓間充質干細胞之后另一備受關注的間充質干細胞，已成 為間充質干細胞來源的新的研究熱點，羊膜間充質干細胞作為種子細胞在臨床移植治療過 程中有著潛在的運用前景。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種人羊膜間充質千細胞懸液的新應用。
[0007] 具體而言，本發明提供一種人羊膜間充質干細胞懸液在制備治療對化療藥物導致 的不孕癥藥物中的應用。
[0008] 優選的，所述不孕癥為卵巢早衰導致的下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的生殖內分泌 失調、無排卵性不孕癥。
[0009] 優選的，人羊膜間充質干細胞懸液濃度為1X 106/ml?2X 106/ml干細胞懸液。 [0010]優選的，用1ml注射器將0.6ml人羊膜間充質干細胞懸液注入靜脈中；隔日注射一 次，共注射兩次。
[0011]所述人羊膜間充質干細胞懸液可由常規方法制備而成，優選的，人羊膜間充質干 細胞懸液的制備方法，包括以下步驟：
[0012] 1)選取無菌條件下獲取的剖腹產足月胎兒的胎盤儲存于無菌玻璃器皿；
[0013] 2)超凈臺內鈍性機械剝離胎盤羊膜組織，PBS緩沖液反復沖洗清除血凝塊，小彎 眼科剪將羊膜剪碎為面積約lcmX lcm的組織碎片；光鏡下分辨羊膜上皮層及間質層； [00M] 3)將羊膜間質層組織以無菌PBS緩沖液洗滌后，剪碎，置于培養瓶中，加入〇. 25% 胰酶，封好瓶口，放于搖床中，37°C、震蕩ΙδΟ次/min,消化60min ;加入溶液體積10%的胎 牛血清終止，PBS緩沖液充分洗潘去除胰酶殘留；1· 〇g/L膠原酶IV型37。(：消化60min ;羊 膜組織的最終消化液通過200目不銹鋼網濾過制備為單細胞懸液； '
[0015] 4)細胞懸液轉入咼心管，1000轉/min離心5min ;棄上清液，PBS緩沖液10ml再次 洗漆和懸浮細胞，1000轉/min離心5min棄上清液，反復三次；離心管加入2ml含10%胎牛 血清的L-DMEM，輕柔吹打，制成（4-5) X 106/ml的羊膜間充質干細胞細胞懸液，置于5% c〇2、 37 °C培養箱中培養。
[0016] 5)羊膜間充質千細胞原代培養至第3天后首次換液，此后每3天更換培養基，定 期倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，待細胞鋪滿瓶底達S0% _9〇%，進行首次傳代（一般 12-14天后細胞按常規方法傳代），代培養過程每3天全量換液。
[0017] 6)選擇生長^好的第2代的羊膜間充質干細胞，用等體積的〇_25%胰酶和0.02% EDTA消化，10〇〇r/min離心，棄去培養基。PBS緩沖液洗滌后制成懸液濃度為 （1-2) X 1〇6干 細胞/ml。
[0018] 本發明的有益效果：
[0019] 1、本發明使用的"種子細胞" 一羊膜間充質干細胞懸液，取材于人胎羊膜組織， 具有來源廣泛、易于獲得，且污染機會少；獲取方便、對供體無傷害；無血液制品攜帶傳染 病的風險；免疫原性更低，無免疫排斥反應；不具有無遠期致瘤性；其研究和應用不涉及倫 理學問題等優點。
[0020] 2、目前并無明確、安全、有效的治療化療藥物導致的不孕癥的藥物及方法，本發明 通過羊膜間充質干細胞懸液對化療藥物導致的不孕癥小鼠進行治療，其妊娠率與正常小鼠 的妊娠率無顯著性差異，對該類不孕癥的治療效果明顯，無副作用及倫理學爭議。
[0021] 3、本發明制備的羊膜間充質千細胞懸液可以通過：L增加化療藥物損傷的卵巢 中卵泡數量，防止卵巢組織的纖維化；2.改善下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的生殖內分泌功 能，從而恢復受損卵巢的排卵功能，對化療藥物導致的不孕癥小鼠具有明顯的治療作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1造模后第30天正常組小鼠陰道脫落細胞涂片；
[0023] 圖2造模后第30天模型組小鼠陰道脫落細胞涂片；
[0024] 圖3造模后第30天補佳樂組小鼠陰道脫落細胞涂片；
[0025]圖4造模后第30天羊膜間充質千細胞移植組小鼠陰道脫落細胞涂片；
[0026]圖5造模后第30天正常組小鼠卵巢組織切片；
[0027]圖6造模后第30天模型組小鼠卵巢組織切片；
[0028] 圖7造模后第30天補佳樂組小鼠卵巢組織切片；
[0029]圖8造模后第30天羊膜間充質干細胞移植組小鼠卵巢組織切片。
【具體實施方式】
[0030]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0031] 實施例1
[0032]羊膜間充質干細胞懸液的制備，包括以下步驟：
[0033] 1)選取無菌條件下獲取的剖腹產足月胎兒的胎盤儲存于無菌玻璃器皿；
[0034] 2)超凈臺內鈍性機械剝離胎盤羊膜組織，PBS緩沖液反復沖洗清除血凝塊，小彎 眼科剪將羊膜剪碎為面積約lcmX lcm的組織碎片；光鏡下分辨羊膜上皮層及間質層； [0035] 3)將羊膜間質層組織以無菌PBS緩沖液洗滌后，剪碎，置于培養瓶中，加入〇. 25% 胰酶，封好瓶口，放于搖床中，37°C、震蕩150次/min,消化60min ;加入適量胎牛血清終止， PBS緩沖液充分洗滌去除胰酶殘留；1. 〇g/L膠原酶IV型37。(：消化60min ;羊膜組織的最終 消化液通過200目不銹鋼網濾過制備為單細胞懸液；
[0036] 4)細胞懸液轉入尚心管，1〇〇〇轉/min離心 5mj_n ;棄上清液，pbs緩沖液i〇mi再 次洗漆和懸浮細胞，1000轉/min離心5min棄上清液，反復三次；離心管加入2ml含1〇%胎 牛血清的L-DMEM，輕柔吹打，制成（4-5) X l〇6/ml的羊膜間充質干細胞細胞懸液，置于5% C〇2、37°C培養箱中培養。羊膜組織中間充質干細胞含量同樣很少，丨克羊膜組織中可分離到 約106個有核細胞。
[0037] 5)羊膜間充質干細胞原代培養至第3天后首次換液，此后每3天更換培養基，定 期倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，待細胞鋪滿瓶底達8〇% -9〇%，進行首次傳代（一般 I2-14天后細胞按常規方法傳代），代培養過程每3天全量換液。
[0038] 6)選擇生長^好的第2代的羊膜間充質干細胞，用等體積的〇· 25%胰酶和〇· 〇2% EDTA消化，lOOOr/min離心，棄去培養基。PBS洗滌后制成懸液濃度為丨χ 1〇7ml?2 χ 1〇S/ ml干細胞懸液。
[0039] 實施例2
[0040] 試驗動物為昆明種SPF小白鼠（6_8周齡、體重約27-29g，經陰道脫落細胞涂片檢 查確定其動情周期正常），由河南省試驗動物中心提供。
[0041] 將雌性小鼠60只隨機分為4組，正常對照組、模型組、補佳樂組、羊膜間充質干 細胞移植組，每組15只；除正常對照組外，其余各組分別給予腹腔注射環磷酰胺（〇. lg,粉 針劑，國藥準字H32020857,由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，將0. lg環磷酰胺溶解于 l〇〇ml氯化鈉注射液，濃度為lmg/ml,環磷酰胺是一種治療腫瘤的化療藥物，在此處用來制 備化療藥物導致不孕癥的動物模型），首次50mg/kg/d的負荷量，以8mg/kg/d的劑量維持 14天，共給藥15天；停藥7天后，開始每日定時觀察陰道細胞形態，連續1周，如呈現動情 周期紊亂，動情間期延長的即為卵巢早衰模型成功，環磷酰胺停藥后2周，各治療組開始給 藥。
[0042] 預防或減輕化療導致的卵巢損傷，緩解由于低雌激素導致的潮熱、出汗、煩躁、 骨質疏松等臨床癥狀是該病的主要治療原則。目前臨床主要的方法為雌激素替代治療 (Hormone Replacement Therapy，HRT);因此，本實施例選擇雌激素制劑（補佳樂）作為治 療的對照藥物。
[0043] 將補佳樂（戊酸雌二醇片，lmg/片，國藥準字J20080036,由拜耳醫藥保健有限公 司廣州分公司提供）用蒸餾水配制成混懸液備用，對補佳樂組小鼠進行灌胃。按臨床該類 患者補佳樂生理替代劑量（2mg/50kg/d，連續使用3個月經周期計算）計算，每只小鼠灌胃 劑量為0. 3mg/kg/d，連續15天（2-3個動情周期）。
[0044] 對羊膜間充質干細胞移植組小鼠，用1ml注射器將實施例1制得的羊膜間充質干 細胞懸液0.6ml注入尾靜脈中。隔日注射一次，共注射兩次，待末次注射完成等待小鼠恢 復三天；各組給予定時飼養、定期觀察。飼養、觀察條件為：12h :12h的明、暗光照，溫度為 18?25°C，空氣相對濕度為40?6〇%，噪音< 60分貝條件下飼養、觀察（每日上午8時， 觀察、記錄小鼠皮毛變化，進食、體重、活動情況，對外界刺激的反應性、靈活性）。
[0045] 小鼠性成熟早，35日齡雄性附睪精液中有運動的精子，雌鼠在35日齡即可發情排 卵、受孕。將各組15只小鼠于造模后第30天，雌雄鼠1:1合籠。合籠、交配前，查看雌鼠外 陰和陰道口，外陰充血腫脹，陰道口張開且呈干燥狀態，確認為動情期雌鼠。取雌鼠陰道分 泌物涂片、經巴氏染色，10X10倍光學顯微鏡鏡檢，觀察陰道涂片的組織細胞學變化，可確 定小鼠動情情況。
[0046] 參見圖1，正常組小鼠陰道涂片的特征為角化上皮細胞占絕大多數，由散在增至集 塊，白細胞和有核上皮細胞很少。
[0047] 參見圖2,模型組期陰道涂片的特征為白細胞占絕大多數，有核上皮細胞和角質化 上皮細胞很少。
[0048] 參見圖3,補佳樂組小鼠陰道涂片的特征為片狀角化上皮細胞、有核上皮細胞和白 細胞3種細胞都有，并且比例無明顯差異。
[0049] 參見圖4,羊膜間充質干細胞移植組小鼠陰道涂片的特征為橢圓形的有核上皮細 胞占絕大多數，白細胞和角質化上皮細胞很少。
[0050] 正常情況下，雌鼠在每隔4-5天為一個動情周期，發情后2_3小時即可排卵。由于 小鼠交配后能產生陰栓，它是由雄性小鼠精囊腺和凝固腺的分泌物在陰道內凝固而形成的 產物；所以常把陰栓的有無作為判斷是否交配的重要標志。進行本研究所用雄鼠均單只單 籠飼養，雄鼠每次交配至少間隔3天以上。合籠后第二天清晨檢查雌鼠陰栓判斷交配情況， 觀察小鼠妊娠、分婉情況，參見表1。
[0051] 表1卵巢早衰性不孕癥小鼠經羊膜間充質干細胞懸液治療后妊娠情況（η = 15， X2)
[0052]
【權利要求】
1. 一種人羊膜間充質干細胞懸液在制備治療對化療藥物導致的不孕癥藥物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述不孕癥為卵巢早衰導致的下丘腦-垂 體-卵巢性腺軸的生殖內分泌失調、無排卵性不孕癥。
【文檔編號】A61K35/50GK104189012SQ201410381176
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優先權日:2014年8月5日
【發明者】羅秋燕, 姚志軍, 牛慧軍, 買茹, 張晨光, 李慧智, 李霞, 陳帆, 劉鳳艷, 任太芳 申請人:新鄉醫學院第三附屬醫院