專利名稱：免疫調節肽的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫調節肽的制備方法及其用途，更詳細的說，本發明是利用不 會引起過敏反應的塵螨肽片段，該塵螨肽片段不會與免疫球蛋白E(IgE)結合引起過敏反 應，再添加真菌免疫調節蛋白來加強免疫反應，此種方式具有比單獨分離自真菌免疫調節 蛋白或單獨使用塵螨肽片段，具有更好的免疫治療效果。
背景技術：
過敏性支氣管炎是最常見的慢性疾病之一，通常發生在兒童，其特征為第二型輔 1 T MM (Th2 immune response)弓 1 ! ^! (von MutiusE. , J. Allergy Clin. Immunol. 2004 ；113 :373-379)。因為增加的第二型輔助T細胞和過敏免疫疾病有關，醫 學科學家推測過敏性疾病引起的原因是調節型T細胞(Treg-cells)量的不足，因此調節 型T細胞無法控制第二型輔助T細胞引起的過敏免疫反應(Curotto de Lafaille Μ. A. & LafailleJ. J.，Curr. Opin. Immunol. 2002 ；14 :771-778)。調節型T細胞是胸腺淋巴細胞具有免疫抑制特性的一個次分類(0’ GarraA. & Vieira P. Nat. Med. 2004 ； 10 :801-805)。雖然天然產生 CD4+調節型 T 細胞 (⑶4+Treg-cells)起源于胸腺，但這些調節型T細胞在特定條件下亦可于外圍循環系統 產生(Gavin Μ. A. et al.，Nature 2007;445:771-775)。過敏性支氣管炎的患者外圍血 液衍生的調節型T細胞能夠抑制第一型與第二型細胞激素的產生(Bellinghausen I.et al.，J. Allergy Clin. Immunol. 2003 ；111 :862-868)。更進一步實驗結果證實，過敏患者 調節型T細胞，特別是在花粉季節，抑制功能減弱(Grindebacke H. et al.，Clin. Exp. Allergy. 2004 ；34 :1364-1372)。標準化萃取的過敏原免疫治療是一種傳統治療方法，但會與細胞膜上的免疫球蛋 白E連結引起嚴重的過敏反應。因此使用不會引起過敏反應的肽片段，來避免與免疫球蛋 白E結合引起過敏的治療方式，值得進一步探討。過敏原免疫治療的另一種免疫替代治療策略是添加免疫刺激核苷酸以增強抗原 疫苗功能使免疫偏向于第二型輔助T細胞且增強第一型輔助T細胞(Bohle B. et al. ,Eur. J. Immunol. 1999 ；29 =2344-2353)。具有豬草抗原(Pigweed Amb a 1)結合免疫刺激核苷 酸具有抑制大鼠呼吸道嗜酸性白血球增多與過度反應的作用(Tighe H. et al.，J. Allergy Clin. Immunol. 2000 ；106 :124-134)。對豬草過敏的成人使用逐漸增加劑量的過敏原結 合免疫刺激核苷酸進行治療，具有減低鼻黏膜嗜酸性白血球、白細胞介素_4(IL-4)的表 現和增加干擾素(Interferon-γ)表現作用(Marshall J. D. et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 2001 ；108 :191-197)。白細胞介素-10(IL-10+)具有許多種的抗過敏特性，包含抑制肥大細胞、嗜酸 性白血球與T細胞的反應，同時誘導B細胞(B cell)制造免疫球蛋白G4(IgG4) (Akdis C. A. et al.，J Clin Invest. 1998 ；102 :98-106)。最近研究指出，成功的過敏原免疫治療 能使調節型T細胞增生及分泌白細胞介素-10(Francis J. N. et al.，J. Allergy Clin.Immunol. 2003；111 :1255-1261)。真菌免疫調節蛋白為分離自金針菇(Flammulina velutipes)的一種免疫調節蛋 白。金針菇的免疫調節蛋白具有許多已經被證實的機能性，包含免疫調節、抗腫瘤、預防腫 瘤、抗病毒、保護肝臟、抗氧化、降膽固醇、降血糖與抑制食欲。更進一步，能抑制過敏反應和 提高制造白細胞介素-2(IL-2)和干擾素(IFN-γ)來防止大鼠體內食物過敏的發展(Hsieh K. Y. et al.，Clin. Exp. Allergy. 2003 ；33 :1595-1602)。先前的研究(臺灣專利第097874號)金針菇是一種可食用性的蕈類，經過分 離可純化得到免疫性調節蛋白，命名為飛益福(FlP-fve)。該發明揭露飛益福具有促進 人類淋巴細胞增殖能力，抑制胎牛血清蛋白(BSA)所誘發的全身性過敏反應(Systemic anaphylaxis)。但是在該發明中僅具有增強免疫調節的功效，并不具有過敏原專一性。在先前的研究中(臺灣專利第U99735號)一種免疫調節蛋白 (Immunomodulatory protein)，是克隆自小抱子靈芝 Ganodermamicrosporum,其基因序列 及其轉譯的蛋白質序列，與已知靈芝G. Iucidum菌絲體中分離具有免疫功效的糖蛋白LZ-8 專利所保護的不同，且具有較LZ-8更有效率的免疫調節能力。但上述免疫調節蛋白亦未結 合其它的過敏原，來進一步加強其免疫調節功效。
發明內容
針對上述現有技術存在的缺陷，本發明的主要目的為提供一種免疫調節肽的制備 方法及其用途，該免疫調節肽是一種具有過敏原專一性的免疫調節肽，其用途是在制備過 敏疾病的免疫治療藥物方面的應用，此塵螨肽片段不會與免疫球蛋白E結合而引起過敏反 應，再添加真菌免疫調節蛋白，不僅安全且可加強過敏患者的免疫功能，是一種過敏原專一 性的免疫治療方法。為達成此發明目的，本發明提供一種免疫調節肽，該塵螨肽片段不會與免疫球蛋 白E結合引起過敏反應，再添加真菌免疫調節蛋白，可作為過敏患者的一種過敏原專一性 的免疫治療方法。本發明的重組塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白，不但具有免疫調節功能，而且 不會引起過敏反應，所以本發明關于免疫調節肽組合物的制備方法與用途，為兼顧安全又 具有免疫反應的組合物。本發明將可用于過敏個體，以皮下注射、服用、貼附皮膚或黏膜的 免疫調節肽，來達到免疫調節功能的方法。
圖1為本發明經培養基、培養基添加塵螨過敏原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原 加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段加真菌免疫調 節蛋白處理后，對過敏與非過敏患者的你即3+調節型T細胞的影響。圖2為本發明經培養基、培養基添加塵螨過敏原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原 加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段加真菌免疫調 節蛋白處理后，對你即3+調節型T細胞中白細胞介素-10的影響。圖3為本發明經培養基、培養基添加塵螨過敏原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原 加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段加真菌免疫調節蛋白處理后，對你即3+調節型T細胞中β型轉化生長因子調節型T細胞的影響。圖4為本發明分離過敏與非過敏患者調節型T細胞，培養基、培養基添加塵螨過敏 原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過 敏的塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白處理后，對外圍血液單核球細胞增殖對調節型T細 胞的影響。圖5為為本發明經分離過敏與非過敏患者調節型T細胞，培養基、培養基添加塵螨 過敏原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引 起過敏反應的塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白處理后，對外圍血液單核球細胞增殖對細 胞激素分泌的影響。
具體實施例方式為了使上述本發明和其它目的、特征與優點更能夠明顯易懂，以下特舉較佳實施 例子，并配合附圖，做更進一步說明如下本發明免疫調節肽的制備方法及其用途，包含以下程序一、收集過敏性鼻炎的患者，該過敏性鼻炎患者定義為打噴嚏、流鼻涕、鼻腔窒悶 的病史。伴隨暴露在過敏原導致病情更進一步惡化與皮膚過敏惡化的反應。使用商業試劑 (Pharmacia, CAP System, Upppsala, Sweden)對患者進行塵螨敏感的測試，皮膚陽性反應和 且具有特定塵螨免疫球蛋白E。免疫球蛋白E測定與皮膚測定，兩種反應皆顯示陽性患者包 含在本試驗，兩種反應皆為陰性患者作為對照組。臺中榮民總醫院人體試驗委員會認可本 發明的人體試驗，每一位受試者皆告知此試驗與簽署受試同意書。二、受試者使用塵螨(D.farinae)與含有重組塵螨肽片段(Der f2)進行皮膚 針刺測試，該塵螨肽片段不會與免疫球蛋白E結合引起過敏，在最終滴定后，兩者測試 物濃度為lOOyg/ml溶解于含50%甘油的磷酸緩沖液中(Tsai J. J. et al. , Int Arch Allergy Immunol. 2000 ；121 =205-210) 0簡要的說，試驗進行使用滅菌可拋棄式涂抹器 (Greer Laboratories, Lenoir, NC, USA)。陽性對照組與陰性對照組，分別使用商業用塵螨 (D. farinae)，該萃取物的濃度為0. 8 μ g/10 μ g，磷酸甘油緩沖液含組織胺的濃度1. Omg/ ml。陽性反應患者的過敏反應面積大于3X3mm2。使用Wiarmacia CAPSystem測定塵螨 (D. farinae)免疫球蛋白E含量。測定過程為自動化進行，以世界衛生組織免疫球蛋白E標 準品作為結果計算標準品，濃度超過0. 35kU/L視為陽性反應。三、重組塵螨肽片段和真菌免疫調節蛋白的表現系統轉化(Transformation)至 酵母菌(Pichia pastoris)。通過聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction)產生重組 塵螨肽片段和真菌免疫調節蛋白的編碼脫氧核糖核酸(Encoding DNA)。聚合酶鏈式反應擴 增脫氧核糖核酸的片段，然后通過酶(EcoRI/NotI)切割塵螨肽片段，切開的重組塵螨肽片 段不會與免疫球蛋白E結合引起過敏反應，再連結至pPIC9K載體anvitr0gen，San Diego, CA)。轉化此結構物進入大腸桿菌(E.coli T0P10F)，依序再一次確認此插入物的構造。依 照操作手冊，此PPIC9K塵螨肽片段不會與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的載體與真菌免 疫調節蛋白被轉化進入酵母菌內(Strain GS115, Pichia pastoris)。該重組物培養在酵 母萃取物培養基，震蕩水浴槽200rpm的轉速、培養溫度與持續48小時。培養后細胞 離心，然后轉換至甲醇緩沖液(PH 6.0)，培養物于培養后96小時收獲，接著使用50%硫酸銨進行部份純化沉淀的步驟。該沉淀物溶于0. 02M的磷酸緩沖液(pH 7.幻，并使用Amicon Ultra PL-IO (Millipore, Bedford, ΜΑ)將樣品去鹽化。經此步驟，重組塵螨肽片段是由塵 螨(D. farinae)過敏原前面1_63個氨基酸所構成的肽片段，該塵螨肽片段不會與免疫球蛋 白E結合引起過敏反應。此聚合酶鏈式反應產物連接于pGEM-Τ載體(ftOmega，Madison, WI, USA)，使用酶(Baml/Sall)雙重水解，目標基因亞克隆(Subclone)進入pET_30a質體， 使用DNA序列分析確認此組成物基因序列。不會與免疫球蛋白E結合引起過敏的肽片段的 質體pET-30a被轉化進入大腸桿菌細胞內(Escherichia coli BL21)。依據使用者操作手 冊純化蛋白質(Novagen，Valencia, CA, USA)，此塵螨肽片段不會與免疫球蛋白E結合引起 過敏表現為六倍組氨酸標記蛋白質(6x His-tagged proteins)。四、使用含有肝素的針筒收集50ml血液樣品用于細胞分離與培養，通過 Ficoll-Paque Plus 密度梯度離心(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)分離夕卜圍血 液單核球細胞。再通過陰極免疫磁性選擇法分離CD4+T細胞；通過陽極磁性細胞篩選分離 CD25+T細胞(MACS ；Miltenyi, Gladbach, Germany)。細胞培養在5ml試管中，細胞數目為 lX106/ml，培養基(RPMI1640)添加青霉素、鏈霉素與谷胺酰胺(Gibco，Grand Island, NY, USA)，持續培養六天。⑶4+⑶25+調節型T細胞使用培養基(Medium)、培養基添加塵螨過敏原(Der f2)、真菌免疫調節蛋白(FlP-fve)、塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白(Der f2+FIP-fve)、 不會與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段加真菌免疫調節蛋白共同培養(Der f2 N ρ印tide+FIP-fve)。外圍血液單核球細胞(50 μ g/ml)與絲裂霉素C(Mitomycin C)共同培養對⑶4+⑶25+T細胞是作為存在的抗原細胞。細胞使用anti-⑶4-PE-Cy5與 anti-⑶25-APC作為細胞表面標記，然后R)xp3-FITC作為轉錄因子。在第六天，添加植物 性血液凝集素A(Phytohemagglutinin A, 1 μ g/ml)于培養基，繼續培養二天。使用三色 細胞流變儀(FACSCalibur ；Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany)運用下列的單株 抗體CD4-藻紅蛋白-Cy5(CD4-phycoerythrin-Cy5(CD4-PE-Cy5))小鼠 IgGl、CD25-別 藻藍蛋白(CD25-allophycocyanine (CD25-APC))小鼠 IgGl (BD Pharmingen, San Diego, CA)與 Foxp3_ 異硫氰酸焚光素(Foxp3-f luorescein isothiocyanate (Foxp3_FITC)) (eBioscience, San Diego, CA)分析調節型 T 細胞，以確認 CD4+CD25+Foxp3+ 調節型 T 細 胞在⑶4+⑶25+T細胞占有百分比。使用兩種蛋白質MAb IL-IO-多甲藻黃素葉綠素蛋白 (IL-10-peridinin chlorophyll protein (IL-lO-PerCP))與MAb TGF-β-多甲藻黃素葉綠 素蛋白(TGF-β-peridininchlorophyll protein(TGF-β-PerCP))依序作為第四種顏色以 區分IL-IO+與TGF- β +調節型T細胞。五、分析⑶4+⑶25+Foxp3+調節型T細胞占有⑶4+⑶25+調節型T細胞之百分比。 ⑶4+⑶25+Foxp3+調節型T細胞與絲裂霉素C經單株抗體處理后培養基、培養基添加塵螨 過敏原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引 起過敏反應的塵螨肽片段加真菌免疫調節蛋白處理后共同培養。數據表示為平均值士七 位過敏與非過敏患者樣本平均數的標準差。與培養基對照組比較，*p = 0.01。結果顯示， Foxp3+調節型T細胞培養后數目增加。與對照組比較，培養基含有塵螨過敏原加真菌免疫 調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段加真菌免疫調節蛋白共同 培養，過敏患者的⑶4+⑶25+Foxp3+調節型T細胞百分比顯著增加(p = 0. 01)。但是非過敏患者對過敏原刺激，則無顯著增加。僅含有塵螨過敏原或真菌免疫調節蛋白的刺激組別， 過敏患者或非過敏患者的⑶4+⑶25+Foxp3+調節型T細胞百分比皆無顯著增加(如圖一所 示)°六、分析白細胞介素-10(IL-10+)在⑶4+⑶25+Foxp3+調節型T細胞占有百分比。 經單株抗體處理后的CD4+CD25+調節型T細胞與絲裂霉素C，培養基、培養基添加塵螨過 敏原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起 過敏的塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白(FIP-fve+N-termial)處理后共同培養。數據 表示為平均值士七位過敏與非過敏患者樣本平均數的標準差。與培養基對照組比較，*P < 0. 01。結果顯示，白細胞介素-10在對照組過敏患者與非過敏患者，此二組別無顯著差 異。經塵螨過敏原添加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽 片段加真菌免疫調節蛋白刺激后，過敏患者白細胞介素-10顯著的增加(p<0. 05)。然而， 非過敏患者的白細胞介素-10，試驗期間并未顯著增加(如圖二所示)。七、分析β型轉化生長因子(TGF- β +)調節型T細胞在⑶4+⑶25+Foxp3+調節型 T細胞占有百分比。經單株抗體處理后的⑶4+⑶25+調節型T細胞與絲裂霉素C，培養基、 培養基添加塵螨過敏原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫 球蛋白E結合引起過敏的塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白處理后共同培養。分析β型 轉化生長因子調節型T細胞占R)xp3+調節型T細胞增加的百分比。數據表示為平均值士 七位過敏與非過敏患者樣本平均數的標準差。與培養基對照組比較，*p<0.01。結果顯 示，β型轉化生長因子調節型T細胞在對照組過敏患者與非過敏患者，此二組別無顯著差 異。經塵螨過敏原添加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽 片段加真菌免疫調節蛋白刺激后，過敏患者β型轉化生長因子調節型T細胞顯著的增加(ρ <0.05)。然而，非過敏患者的β型轉化生長因子調節型T細胞，試驗期間并未顯著增加。 僅過敏患者組別經真菌免疫調節蛋白刺激后，過敏患者調節型T細胞顯著的增加(如圖三 所示)。八、依據使用者手冊，植物性血液凝集素A刺激外圍血液單核球細胞與調節型 T細胞，分離過敏與非過敏患者調節型T細胞，培養基、培養基添加塵螨過敏原、真菌免 疫調節蛋白、塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏的塵螨 肽片段添加真菌免疫調節蛋白處理后共同培養，持續培養七日，然后使用BrdU流變商業 套組(Becton-DickinsonWiarmingen)試劑固定與滲透性。打開合并的BrdU，使用脫氧 核糖核酸水解酶(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)分解 DNA 在 37 °C 持續一小 時。使用連結FITC特異性抗體(Anti-BrdU Ab)染色后，使用細胞流變儀(FACSCalibur， Becton-Dickinson)，運用 CellQuest 軟件分析試驗結果(Becton-Dickinson)。分析塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的 塵螨肽片段加真菌免疫調節蛋白刺激后對免疫調節作用，結果顯示，塵螨過敏原或真菌免 疫調節蛋白刺激周邊血液單核球細胞能抑制植物性血液凝集素A刺激外圍血液單核球細 胞增殖(如圖四所示)。九、使用商業用試劑(A bead-based Flowcytomix)分析細胞培養基上層液的四種 細胞激素(IL-2，IL-5，IL-IO與IFN-Y)。分離過敏與非過敏患者調節型T細胞，培養基、 培養基添加塵螨過敏原、真菌免疫調節蛋白、塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白處理后共同培養。測定植 物性血液凝集素A刺激外圍血液單核球細胞的細胞激素分泌，比較每一試驗組別培養基上 層液四種細胞激素(11^-2，仏-5，11^-10與0^-^)的濃度。簡述此流程，每一個測試物與細 胞激素05 μ 1)加入96孔盤中連結抗體的小珠(25 μ 1)。培養一小時之后，清洗孔盤，加入 50 μ 1聚合生物素2級抗體溶液，再繼續培養一小時。孔盤清洗后加入50 μ 1蛋白質抗原的 聚合物質(抗生物素蛋白鏈菌素綴合的抗生物素蛋白鏈菌素(Mr印tavidin-conjugatedp hycoerythrin))，接著再繼續培養一小時。最終清洗后，每一孔盤使用測試緩沖液使內容物 懸浮，放于聚苯乙烯小管，再用FACScan細胞流變儀讀取數據。該細胞流變儀配備雷射檢測 488nm波長和熒光波長575和685nm。細胞激素濃度的計算，以細胞激素標準品做成標準曲 線后比較，計算其濃度。塵螨過敏原加真菌免疫調節蛋白或不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨 肽片段加真菌免疫調節蛋白刺激后，測定細胞激素，結果顯示，四種細胞激素(IL-2，IL-5， IL-10與IFN-γ)濃度沒有顯著差異。同時在過敏患者或非過敏患者亦無顯著差異(如圖 五所示)O以上所述僅為本發明較佳實施例，不能以此限定本發明實施的范圍。凡依本發明 要求保護的技術方案所做的均等變化與修飾，均應屬本發明專利涵蓋的范圍之內。<110>行政院國軍退除役官兵輔導委員會臺中榮民總醫院<120>免疫調節肽的制備方法及其用途<130>TI09-1655-XC49<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>63<212>PRT<213>人工序列<220><223>塵螨肽片段<400>1Asp Gln Val Asp Val15Met Val Asp Gly Cys20Lys pro Phe Thr Leu35Thr Ala Lys lie Glu50<210>2<211>115<212>PRT
9
Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu lie Lys Lys Val
1015
His Gly Ser Asp Pro Cys lie lie His Arg Gly
2530
Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
4045
lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu lie 5560
<213>人工序列
<220>
<223>真菌免疫調節蛋白
<400>2
Met Ser Ala ThrSerLeuThr PheGlnLeuAlaTyrLeuValLys
151015
lie Asp Phe AspTyrThrPro AsnTrpGlyArgGlyThrProSer
202530
Tyr lie Asp AsnLeuThrPhe proLysValLeuThrAspLysLys
354045
Ser Tyr Arg ValValValAsn GlySerAspLeuGlyValGluSer
505560
Phe Ala Val ThrProSerGly GlyGlnThrlieAsnPheLeuGln
657075
Asn Lys Gly TyrGlyValAla AspThrLysThrlieGlnValPhe
859095
Val lie Pro AspThrGlyAsn SerGluGluTyrlielieAlaGlu
100105110
Lys Lys Thr
11權利要求
1.一種免疫調節肽的制備方法，包括聚合酶鏈式反應擴增脫氧核糖核酸的片段，通 過酶切割塵螨肽片段，切開的重組塵螨肽片段不會與免疫球蛋白E結合引起過敏反應，再 連結至載體，轉化此結構物進入大腸桿菌；此塵螨肽片段的載體與真菌免疫調節蛋白被轉 化進入酵母菌內，該重組物培養在培養基，培養后細胞離心，轉換至緩沖液，培養物于培養 后收獲，接著進行部份純化沉淀的步驟，該沉淀物溶于磷酸緩沖液，將樣品去鹽化。
2.根據權利要求1所述的免疫調節肽制備方法，其特征在于，該免疫調節肽制備方法 其中包括不與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段或以其它一種或一種以上塵 螨過敏來源，經酶切除特定引起過敏的免疫球蛋白E連接的過敏原的步驟。
3.根據權利要求1所述的免疫調節肽制備方法，其特征在于，其中包括一種不會引起 過敏反應的肽片段添加真菌免疫調節蛋白。
4.根據權利要求1所述的免疫調節肽制備方法，其特征在于，其中包含不與免疫球蛋 白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白。
5.根據申請權利要求1所述的免疫調節肽制備方法，其特征在于，其中包含不與免疫 球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段，該肽片段1-63個氨基酸序列識別編號1 DQVDVKDCAN NEIKKVMVDG CHGSDPCIIHRGKPFTLEAL FDANQNTKTA KIEIKASLDGLEIο
6.根據權利要求1所述的免疫調節肽制備方法，其特征在于，其中包含真菌免疫調節 蛋白1-115個氨基酸序列識別編號2 MSATSLTFQL AYLVKKIDFDYTPNWGRGTPSSYIDNLTFP KVLTDKKYSYRVVVNGSDLGVESNFAVTPS GGQTINFLQYNKGYGVADTKTIQVFVVIPD TGNSEEYIIAEffKKTο
7.一種免疫調節肽的組成物的用途，其中包含不會引起過敏反應的塵螨肽片段添加真 菌免疫調節蛋白具有調節型T細胞增生與分泌的效果，其在制備調節過敏患者免疫功能的 藥物方面的應用。
8.根據權利要求7所述的免疫調節肽的組成物的用途，其特征在于，其中包含不與免 疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段添加不同來源真菌免疫調節蛋白，其在制備預 防過敏反應的藥物方面的應用。
9.根據權利要求7所述的免疫調節肽的組成物的用途，其特征在于，其在制備治療過 敏反應的藥物方面的應用。
10.根據權利要求7所述的免疫調節肽的組成物的用途，其特征在于，其在制備過敏患 者的一種過敏原專一性的免疫治療藥物方面的應用。
11.根據權利要求7所述的免疫調節肽的組成物的用途，其特征在于，所述個體應用用 途其中包含以皮下注射、服用、貼附皮膚或黏膜免疫調節肽或與真菌免疫調節蛋白混合的方式，以達到免疫調節功能之方法。
12.根據權利要求7所述的免疫調節肽的組成物的用途，其特征在于，其中包含過敏性 來源的疾病，該疾病包含過敏性鼻炎、支氣管氣喘、過敏性支氣管炎或鼻竇炎。
13.根據權利要求7所述的免疫調節肽的組成物的用途，其特征在于，其用于制備醫藥 品、飲料、化妝品或食品或者作為添加于這些制品或原料物中的添加物中的用途。
14.根據權利要求7所述的免疫調節肽的組成物的用途，其特征在于，其在作為具有抗 發炎的免疫調節劑的應用。
全文摘要
本發明提供一種免疫調節肽的制備方法及其用途，此免疫調節肽為一種不會與免疫球蛋白E結合引起過敏反應的塵螨肽片段，再添加真菌免疫調節蛋白的合成蛋白。研究結果顯示，與對照組比較，培養基中含有不會引起過敏反應的塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白共同培養，過敏患者不僅CD4+CD25+Foxp3+調節型T細胞顯著的增加，而且抑制免疫反應的功能也增加。培養基中含有不會引起過敏反應的塵螨肽片段添加真菌免疫調節蛋白共同培養，過敏患者CD4+CD25+Foxp3+調節型T細胞會分泌白細胞介素-10與β型轉化生長因子的百分比也顯著增加。因此本發明具有調節型T細胞增生與分泌的效果，可調節過敏患者免疫功能，以此治療過敏。
文檔編號C12P21/02GK102061306SQ200910224659
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月18日 優先權日2009年11月18日
發明者蔡肇基 申請人:臺中榮民總醫院