專利名稱：以病毒mRNA核轉運為靶點的抗HIV-1藥物篩選方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種抗Hiv-I藥物的篩選方法。
背景技術：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)感染導致人體免疫機能缺陷，而易于發生機會性感 染和腫瘤的臨床綜合征。在過去的20多年里造成2000多萬人死亡，目前全世界艾滋病病 毒感染者已達4000萬左右。艾滋病不僅成為我國嚴重的衛生健康問題，同時每年造成了上 千億的直接經濟損失。據中國衛生部2008年通報，全國累計報告HIV感染者達25萬多人， 預計則高達約70萬人。目前臨床使用的傳統的抗艾滋病藥物雖在抗HIV-I方面起到了很大的作用，但仍 存在一些問題，如在人體內活性不高、口服生物利用度低、易產生耐藥性或交叉耐藥性及生 產成本高等。耐藥是病毒的藥物作用靶位蛋白變異的結果。因為耐藥株經常對一組抗病毒 藥物耐藥，并且同一類藥物之間交叉耐藥非常常見。因此，急需尋找作用于新靶點的高效低 毒的抗艾滋病藥物。21世紀以來，研究人員的視線已集中到很多的新的靶點上。HIV-I基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個基因組約為9. 71Λ。結構上包括 LTR，結構蛋白編碼區(gag)，多種酶活性的蛋白編碼區(pol)，外膜蛋白(erw)編碼區以 及6個調節基因。gag基因編碼病毒的核心蛋白，翻譯時先形成一個分子量大約是55kD 的前體蛋白(P55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成matrix(MA)、Capsid(CA)、p2、 nucleocapsid(NC)、pl和p6g#。pol基因產物與各種酶的功能相關，如HIV-1蛋白酶(PR)， 逆轉錄酶(RT)、整合酶(IN)等。Pol基因不能單獨翻譯，gag基因翻譯過程中，會有5% 10%的幾率發生特定的移碼，使翻譯繼續下去，得到160kD的feig-Pol。Gag-Pol在HIV蛋 白酶的作用下裂解成MA、CA、p2、NC、移碼蛋白(TF)、PR、RT、IN。HIV-I病毒的增殖、有效表達都依賴于一種調控蛋白一Rev蛋白。Rev蛋白即病毒 顆粒蛋白表達調節因子(Regulator of expression ofvirion protein，Rev)，是 HIV-1 病 毒復制非常重要的的一個反式激活因子，能夠促進HIV-I的基因轉錄由早期向晚期轉變， 即由調節蛋白基因的轉錄向結構蛋白基因的轉錄進行轉變。Rev蛋白大小為19KD，由Rev 基因編碼。Rev基因是由HIV-I病毒mRNA完全剪輯后的兩個外顯子組成，分別編碼25個氨 基酸和91個氨基酸的肽段，兩個肽段聚合形成116個氨基酸的Rev蛋白。Rev蛋白含有四 個功能結構域核定位信號(NLQ、RNA連接區域(RBD)、NLS/RBD側面低聚合區、核轉運信號 (NES)。其中RBD域在HIV-I基因組RNA核轉運時特異性地與HIV-I的RRE片段結合；NES 與CRMl蛋白的HllA和H12A片段特異性結合。逆轉錄病毒HIV-I的mRNA通過轉錄后剪輯成為30多種mRNA，按照大小可分 為三類未剪輯mRNA、部分剪輯mRNA、完全剪輯mRNA。在病毒的生命過程中，這些mRNA 只有轉運出細胞核才能完成其生物功能。其中，未剪輯mRNA和部分剪輯mRNA都因含 有 RRE (Rev-response element, Rev 蛋白效應原件)片段，從而通過 Rev (Regulator ofexpression of virion protein)依賴性途徑從細胞核內轉運到細胞質中的，前者作為 基因組RNA進行病毒包裝，后者作為編碼feg/Pol的mRNA進行翻譯；完全剪輯mRNA因無 RRE片段則由另一種途徑一 NXFl途徑轉運出核，其主要是作為編碼調控蛋白和Env蛋白的 mRNA。HIV-ImRNA的Rev蛋白依賴性轉運途徑是依賴于Rev蛋白與核膜上的CRMl蛋白特異 性結合而完成的。CRMl是一個較為保守的蛋白，屬于RNA轉運超家族蛋白。其專一性抑制 劑為來普霉素B(1印tomycin B，Iiffi)。尋找新的有效的抗HIV藥物，一直是本領域研究的熱點。然而，到目前為止仍然鮮 有有關簡便、高效地篩選抗HIV的方法的報道。
發明內容
針對上述不足，本發明的提供一種用于篩選HIV藥物的方法。為實現上述目的，本發明首先提供一種真核表達載體，該表達載體具有報告基因， 在所述報告基因的上游和下游分別具有SD序列的UTR片段和RRE片段。所述報告基因可 以是常規報告基因，為了便于檢測，所述報告基因優選為熒光蛋白基因，所述熒光蛋白可以 是GFP、RFP、YFP等。為了提高表達效率，根據密碼子的偏愛性對熒光蛋白基因作適當的改 造是必要的。在本發明中，優選根據HIV-I病毒密碼子的偏愛性設計熒光蛋白編碼基因。在本發明的實例中，將正常GFP蛋白的密碼子改造成為Hiv-I病毒偏愛性的 hivGFP密碼子。使得hivGFP與正常GFP基因的同源性最終達到68%。在此基礎上，本發明提供一種篩選抗HIV-I藥物的方法，其是將上述的表達載體 與表達Rev的表達載體共轉染宿主細胞，添加待檢樣品至共轉染后的宿主細胞，檢測細胞 中報告基因編碼產物的表達量，判斷樣品是否對Rev蛋白具有抑制作用。當報告基因為熒 光蛋白基因時，則可方便地通過檢測熒光的強弱來進行判斷。必要時，可以在檢測時以LMB 作為陽性藥物對照，來檢測細胞中熒光的強弱。這里所述的宿主細胞是指能夠表達Rev所 述報告基因的細胞，如動物細胞。在本發明的實例中，用于共轉染宿主細胞的表達載體(質粒載體)分別是 pUTR-hivGFP-RRE和pCDNA3_Rev，宿主細胞是^3T。該實例通過將正常GFP蛋白的密碼子 改造成為HIV-I病毒偏愛性的hivGFP密碼子，使得hivGFP與正常GFP基因的同源性最終達 到68%，然后將hivGFP基因片段克隆到ρ⑶NA3質粒載體上，轉染到細胞即可表達hivGFP 蛋白。為了模擬自然生境下HIV-I的非剪切RNAs的核轉運狀態，在質粒PCDNA3-HIVGFP上 hiv-GFP片段上下游分別添加了含有SD序列(major splice donor)的UTR片段和可以與 Rev蛋白特異性結合的RRE片段。其中SD序列可以防止hiv-GFP基因被細胞降解并得以 順利轉錄；RRE片段可以介導hivGFP mRNA通過Rev-CRMl途徑轉運出核。，藥物對Rev蛋 白的抑制作用可以通過檢測hivGF熒光的強弱來判斷。通過將質粒pUTR-hivGFP-RRE和 ρ⑶NA3_Rev按照一定比例共轉染到細胞中，由于hivGFP的表達量受Rev蛋白的特異性的調 控，LMB作為專一性抑制Rev-CRMl核轉運途徑的陽性藥物，備篩選化合物作用于共轉染的 細胞后，通過檢測GFP熒光的強弱來判斷藥物對Rev蛋白的抑制作用。本發明以病毒mRNA核轉運為靶點提供一種用于篩選抗HIV-I藥物的方法，利用該 方法能夠方便、快速地篩選抗HIV-I的藥物，為抗HIV藥物的篩選提供了新途徑。
圖 1 為 pUTR-hivGFP-RRE 的質粒圖譜。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例11 質粒 pUTR-hivGFP-RRE 的構建根據HIV-I病毒密碼子的偏愛性對正常GFP蛋白的密碼子進行改造得到hivGFP 編碼序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示)，使得hivGFP與正常GFP基因的同源性最終 達到68%，然后將hivGFP基因片段克隆到ρ⑶NA3質粒載體上，得到質粒ρ⑶NA3-HIVGFP。以BHlO質粒(為NIH AIDS Reagent Program提供)(含有HIV-1毒株全序列)為 模板，用以下引物 5 ‘ ATCGAATTCCGACGCAGGACTCGGCTTGC-3 和 5 ‘ GATCCCATGGCTCTCTCCTTC AGCCTCCG-3 ‘進行 PCR 擴增，得到 UTR 片段；用 5 ‘ GATCGGATCCGAGATCTTCAGACCTGGAGGAG-3 '禾Π 5' GATCCTCGAGGTTCACTAATCGAATGGATCTG-3'兩個引物進行PCR擴增獲得 RRE 片段。然 后分別在ρ⑶NA3-HIVGFP質粒上Kpn I和EcoR I兩個酶切位點之間插入UTR片段；在BamH I和Β ο I兩個酶切位點之間插入RRE片段。繼而將所得質粒命名為pUTR-hivGFP-RRE。 (圖譜見圖1，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示)。
UTR片段的PCR擴增反應體系(總體積50 μ 1)上游引物(10 μ Μ) :2μ 1下游引物(10 μ Μ) :2 μ 1模板質粒 BHlO :1 μ 1Takara 公司 Pfu DNA 聚合酶 2 XMIX :25 μ 1ddH20 20 μ 1反應條件95°C預變性:3min ；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，四個循 環；72°C衍生IOmin ；4°C保存。RRE片段PCR擴增的條件與UTR片段的PCR擴增相同。2細胞培養取細胞進行培養，待細胞長滿培養瓶后，棄培養瓶中的培養基，用含0. 25% 胰酶、0. 02% EDTA的消化液消化。待細胞變圓，棄消化液，立即加入含10% FBS的高糖DMEM 培養基(HyClone)，用吸管輕輕吹打瓶底，使細胞完全脫離瓶底且使之分散為單細胞懸液。 血球計數板計數后，IOcm細胞培養皿共接種2. 4 X IO6個細胞，培養24h后轉染。3細胞轉染轉染步驟按Lipofectamine 2000 Qnvitrogene)的說明書進行。具體操作如下 用1. 5ml高糖DMEM培養基稀釋質粒，pUTR-hivGFP-RRE和pCDNA Rev質粒用量分別為20 μ g 和 2 μ g，比例為 10 1。用 1. 5ml 高糖 DMEM 培養基稀釋 60 μ 1 Lipofectamine 2000。室 溫孵育5min，將含有轉染質粒和Lipofectamine 2000的培養基輕輕混勻(總體積為:3ml)，5室溫孵育20min，加到IOcm培養皿的細胞培養上清中。轉染后，37°C，5%的CO2培養12h。然后吸去培養皿的培養基，用含0. 25 %胰酶、0.02% EDTA的消化液消化，棄消化液，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培養基，輕輕吹打， 使細胞分散為單細胞懸液。血球計數板計數后，用培養基將細胞濃度調整為2. 5X105個/ ml，混勻后于四周黑色不透明、底部透明、平底的96孔板(Costar)每孔接種150 μ 1細胞懸液。4樣品制備化合物樣品IOmg純品化合物溶到ImlDMSO中，50 % DMSO稀釋到lmg/ml，取1.5μ 1作用于150 μ 1細胞體系，使其終濃度為 ομ g/ml。發酵液樣品菌種發酵，從斜面上挑取一小塊培養物種入盛有50ml發酵培養基的 250ml三角瓶中，28°C、190rpm旋轉搖床培養4d。取IOml發酵液用IOml的丙酮抽提，揮干 后，用Iml的DMSO溶解。取IOyl加IOyl水倍比稀釋，取1.5μ1作用于150μ1細胞體系。來普霉素B(1印tomycin B，LMB)購于USB公司(Lot No. 115925)，甲醇稀釋至終 濃度為ι μ g/ml。可以專一性抑制Rev-CRMl核轉運途徑，從而降低hivGFP的表達。在本篩 選模型里作為陽性化合物。5樣品活性檢測96孔板培養1 后，按以下分組進行操作溶劑對照組加入1. 5 μ 1 50% DMSO于細胞培養上清中，該組反映DMSO對hivGFP 蛋白表達的影響程度。陽性藥對照組加0. 75 μ 1的1 μ g/mlLMB于150 μ 1的細胞體系中。該組反映LMB 對Rev-CRMl核轉運途徑的特異性抑制程度，同時反映hivGFP在Rev蛋白的介導下表達受 抑制程度。樣品實驗組加藥篩選的樣品1. 5 μ 1于150 μ 1的細胞體系中。該組反映篩選樣 品程度對Rev-CRMl核轉運途徑的特異性抑制程度，同時反映hivGFP在Rev蛋白的介導下 表達受抑制程度。繼續培養16h后，吸去96孔板中的培養基，每孔加入100 μ L PBS,使用 480nm(±10nm)激發光，520nm(士 lOnm)處發射光，檢測GFP強度。結果，陽性藥物對照組的熒光強度顯著弱于溶劑對照組，表明LMB對hivGFP在Rev 蛋白的介導下表達產生了抑制作用。從組合化學庫共篩選3000個樣品，其中初篩陽性化合 物23個。序列表<110>中國醫學科學院生物技術研究所<120>以病毒mRNA核轉運為靶點的抗HIV-I藥物篩選方法<130>KHP09113514. 4<160>5<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>720
atggtaagcaaaggagaagaattatttacaggagtagtaccaatattagtagaattagac60ggtgacgtaaatggacataaatttagcgtaagcggagaaggagaaggtgacgcaacatat120ggaaaattaacatttttatatgtacaacaggaaaattaccagtaccctggccaaca180ttagtaacaacatttacatatggagtacaatgttttagcagatatccagaccatatgaaa240caacatgacttttttaaaagcgcaatgccagaaggatatgtacaagaaag300tttaaagacgacggaaattataaaacaagagcagaagtaaaatttgaaggagacacatta360gtaaatagaatagaattaaaaggaatagactttaaagaggacggaaatatattaggacat420aaattagaat3. 3.3. 3. 3.3.tagccataatgtatatataatggcagacaa3. C 3.3.3.3.3.3.3. 480ggaataaaag 3.3.3.3.3.aataagacataatatagaggacggaagcgtacaattagca540gaccattatc3.3. C 3.3.3.3. 3. Caccaataggtgacggaccagtattattaccagacaatcat600tatttaagcacacaaagcgcattaagcaaagacccaaatgaaaaaagagaccatatggta660ttattagaatttgtaacagcagcaggaataacattaggaatggacgaatt3. 3. 3.3.3. 3.3.720<212>DNA <213>人工序列 <400>1<210>2 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <400>2atcgaattcc gacgcaggac tcggcttgc29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3gatcccatgg ctctctcctt cagcctccg29<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>4gatcggatcc gagatcttca gacctggagg ag32<210>5<211>7034<212>DNA<213>人工序列<400>權利要求
1.一種真核表達載體，其具有報告基因，在所述報告基因的上游和下游分別具有SD序 列的UTR片段和RRE片段。
2.如權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述報告基因為熒光蛋白。
3.如權利要求2所述的表達載體，其特征礙于，所述熒光蛋白為GFP、RFP、YFP。
4.如權利要求1或2所述的表達載體，其特征在于所述報告基因基因的密碼子為 HIV-I病毒偏愛性的密碼子。
5.如權利要求1所述的所述的表達載體，其特征在于該表達載體為pUTR-hivGFP-RRE。
6.權利要求1 5任一項所述表達載體與表達Rev的表達載體共轉染的細胞。
7.一種篩選抗HIV-I藥物的方法，其特征在于，將權利要求1 5任一項所述的表達載 體與表達Rev的表達載體共轉染宿主細胞，添加待檢樣品至共轉染后的宿主細胞，檢測細 胞中報告基因編碼產物的表達量，判斷樣品是否對Rev蛋白具有抑制作用。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，在檢測時還包括以LMB作為陽性藥物對照。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述表達Rev的表達載體為 pCDNA3-Rev0
10.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為細胞。
全文摘要
本發明提供了一種篩選抗HIV-1藥物的方法，該方法以病毒mRNA核轉運為靶點，通過構建帶有報告基因的表達載體，在所述報告基因的上游和下游分別具有SD序列的UTR片段和RRE片段，將該表達載體與表達Rev蛋白的質粒共轉染宿主細胞，添加待檢樣品至共轉染后的宿主細胞，檢測細胞中報告基因表達量，判斷樣品是否對Rev蛋白具有抑制作用。利用該方法能夠方便、快速地篩選抗HIV-1的藥物，為抗HIV藥物的篩選提供了新途徑。
文檔編號C12N5/10GK102051378SQ200910237159
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月9日 優先權日2009年11月9日
發明者劉振龍, 岑山, 張全, 李曉宇, 楊亮, 賈平平, 魏曉露 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所