專利名稱：Hiv-1前體蛋白早成熟化誘導劑的篩選方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種篩選Hiv-I前體蛋白早成熟化誘導劑的 篩選方法。
背景技術：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)感染導致人體免疫機能缺陷，而易于發生機會性感 染和腫瘤的臨床綜合征。在過去的20多年里造成2000多萬人死亡，目前全世界艾滋病病 毒感染者已達4000萬左右。艾滋病不僅成為我國嚴重的衛生健康問題，同時每年造成了上 千億的直接經濟損失。據中國衛生部2008年通報，全國累計報告HIV感染者達25萬多人， 預計則高達約70萬人。目前臨床使用的傳統的抗艾滋病藥物雖在抗HIV-I方面起到了很大的作用，但仍 存在一些問題，如在人體內活性不高、口服生物利用度低、易產生耐藥性或交叉耐藥性及生 產成本高等。耐藥是病毒的藥物作用靶位蛋白變異的結果。因為耐藥株經常對一組抗病毒 藥物耐藥，并且同一類藥物之間交叉耐藥非常常見。因此，急需尋找作用于新靶點的高效低 毒的抗艾滋病藥物。21世紀以來，研究人員的視線已集中到很多的新的靶點上。HIV-I基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個基因組約為9. 71Λ。結構上包括 LTR，結構蛋白編碼區(gag)，多種酶活性的蛋白編碼區(pol)，外膜蛋白(erw)編碼區以 及6個調節基因。gag基因編碼病毒的核心蛋白，翻譯時先形成一個分子量大約是55kD 的前體蛋白(P55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成matrix(MA)、Capsid(CA)、p2、 nucleocapsid(NC)、pl和p6g#。pol基因產物與各種酶的功能相關，如HIV-1蛋白酶(PR)， 逆轉錄酶(RT)、整合酶(IN)等。Pol基因不能單獨翻譯，gag基因翻譯過程中，會有5% 10%的幾率發生特定的移碼，使翻譯繼續下去，得到160kD的feig-Pol。Gag-Pol在HIV蛋 白酶的作用下裂解成MA、CA、p2、NC、移碼蛋白(TF)、PR、RT、IN。HIV-I蛋白酶(protease，PR)是由HIV-lpol基因5，端所編碼。該酶含99個氨 基酸，屬天冬氨酸蛋白酶。全酶為旋光對稱的同源二聚體，而二者界面形成酶活性中心。 HIV-II3R作為前體蛋白(precursor)Gag-Pol的一部分被翻譯出來，前體蛋白形式的I3R處于 無活性狀態。Gag-Pol通過與HIV-I另一前體蛋白Gag相互結合，形成未成熟的病毒顆粒。 病毒顆粒裝配完成后，在病毒出芽或者出芽后的瞬間，Gag-Pol中的I3R被激活，將feg-Pol 和(iag剪切成為較小的成熟結構蛋白和酶(包括逆轉錄酶和整合酶)，這個過程稱為病毒的 成熟化。只有經過PR酶切加工形成的成熟病毒顆粒才具有感染性。目前，針對HIV-IPR的藥物研究集中在抑制其活性上，使前體蛋白Gag和(iag-Pol 不能被酶切成為結構蛋白和酶，不能形成成熟的病毒顆粒，從而可達到抗病毒的效果。HIV 蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor，PI)自1995年應用于臨床以來已取得了顯著成果，但 易產生耐藥及交叉耐藥，且不能徹底治愈艾滋病。HIV-II3R活性的嚴格調控對于病毒的生存至關重要。研究表明，如果feig-Pol中的3I3R在裝配完成前被激活，會導致前體蛋白(iag-Pol和Gag被提前酶切加工，這一過程被統稱 為前體蛋白早成熟化(premature)。一旦發生前體蛋白早成熟化，病毒顆粒便無法裝配，因 此病毒顆粒的產量將顯著減少，甚至無病毒顆粒產生。目前，HIV-I病毒裝配完成前，細胞 內Gag-Pol中I3R活性的抑制機制，以及裝配完成后，I3R被迅速激活的機制尚不清除。盡管 如此，如果能干擾HIV-PR活性的調控機制，特異性的激活前體蛋白中的PR，誘導前體蛋白 早成熟化，就可以直接抑制病毒的復制。然而，到目前還沒有一種能夠用于篩選這種誘導劑 的方法。
發明內容
針對上述不足，本發明提供一種HIV-I前體蛋白早成熟化誘導劑的篩選方法。本發明提供的HIV-I前體蛋白早成熟化誘導劑的篩選方法，包括步驟將表達 Gag/Gag-Pol的質粒與表達融合蛋白A的質粒共轉染宿主細胞，添加待檢樣品至共轉染后 的宿主細胞，檢測細胞BRETl ratio的變化，BRETl ratio下降，則待檢樣品為早成熟化誘 導劑。所述融合蛋白A為由p2/p7連接的，一端為熒光素酶，另一端為熒光素酶激發受體的 融合蛋白。上述熒光素酶與熒光素酶激發受體之間能夠產生生物發光共振能量轉移 1 (Bioluminescence resonance energy transferl，BRET1)0上述熒光酶可選自海腎熒光素酶。相應的熒光酶激發受體可選自EYFP、EGFP、YFP、GFP。在發明實例中，一種優選的融合蛋白為EYFP-p2/p7-Rluc。所述表達feig/feig-Pol 的質粒為PVRC4200質粒。所述表達融合蛋白A的質粒為pEYFP-p2/p7-Rluc。所述宿主細 胞為細胞。具體地首先構建表達融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc的質粒pEYFP-p2/p7-Rluc，將其 與表達feig/feig-Pol的質粒pVRC4200質粒共轉染細胞，轉染24h后，添加樣品至轉染 后的細胞，再培養16h，檢測細胞BRETl ratio的變化。如樣品對該模型有效，即能夠 提前激活Gag-Pol中的PR,則BRETl ratio下降。本發明運用生物發光共振能量轉移l(Bioluminescence resonanceenergy transferl,BRETl)技術，建立了細胞水平的HIV-I前體蛋白早成熟化激活劑篩選模型。這 一模型的原理為在增強的黃色熒光蛋白(EYFP)和海腎熒光素酶(Renilla luciferase, Rluc)之間插入HIV-I PR的識別序列p2/p7 (ATI匪QRG)，表達為融合蛋白EYFP_p2/ p7-Rluc,力口 入 Rluc 底物 coelenterazine h ( λ em 475nm)，在 Rluc 與 EYFP 距離小于 IOOA時，催化產生的光波能量轉移，激發受體EYFP (λ em 535nm)。生物發光共振能量轉 移比例(BRET1 ratio) = 535nm發射光強度/475nm發射光強度(表達融合蛋白EYFP_p2/ p7-RluC)-535nm發射光強度/475nm發射光強度(只表達蛋白IUuc)。同HIV-1基因組 相似，PVRC4200表達Gag和feig-Pol，兩者比例20 1，可形成病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)。將 pEYFP-p2/p7_Rluc 質粒與 pVRC4200 質粒共轉染 細胞，如加入 的化合物能夠提前激活feig-Pol中的PR，細胞內的HIV-II3R活性升高，HIV-IPR識別EYFP 和Rluc之間的p2/p7序列，酶切融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc，使得EYFP和Rluc分開，距離 大于100A,將無生物發光共振能量轉移現象，BRETl ratio將下降。4
本發明方法提供了一種用于HIV-I前體蛋白早成熟化誘導劑篩選的方法，利用該 方法能夠方便、快速地篩選早成熟化誘導劑，對HIV的治療藥物的篩選提供了新途徑。
圖1 是 pEYFP-p2/p7_Rluc 的質粒圖譜；圖2是pVRC4200的質粒圖譜。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例11構建表達載體應用PCR擴增pEYFP-Nl (Clontech公司)質粒中的EYFP基因片段。所用引物 上游引物 5' -TAG TAC AAG CTT C GCC ACCATG GTG AGC AAG-3 ‘，下游引物 5' -TGA TTA GGA TCC CTTGTA CAG CTC GTC CAT GC-3'。反應體系
權利要求
1.HIV-I前體蛋白早成熟化誘導劑的篩選方法，其特征在于將表達feig/feig-Pol的質 粒與表達融合蛋白A的質粒共轉染宿主細胞，添加待檢樣品至共轉染后的宿主細胞，檢測 細胞BRETl ratio的變化，BRETl ratio下降，則待檢樣品為早成熟化誘導劑，所述融合蛋白A為由p2/p7連接的，一端為熒光素酶，另一端為熒光素酶激發受體的融 合蛋白，該熒光素酶與熒光素酶激發受體之間能夠產生生物發光共振能量轉移1。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光酶選自海腎熒光素酶。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述熒光酶激發受體選自EYFP、EGFP、 YFP, GFP0
4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白為EYFP-p2/p7-RluC。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表達(iag/feig-Pol的質粒為 PVRC4200 質粒。
6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表達融合蛋白A的質粒為 pEYFP-p2/p7-Rluc。
7.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為細胞。
8.如權利要求4所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟構建表達融合蛋白 EYFP-p2/p7-Rluc 的質粒 pEYFP_p2/p7_Rluc，將其與表達 Gag/Gag-Pol 的質粒 pVRC4200 質粒共轉染細胞，轉染24h后，添加樣品至轉染后的細胞，再培養16h，檢測細胞 BRETl ratio 的變化。
全文摘要
本發明提供了一種用于HIV-1前體蛋白早成熟化誘導劑的篩選方法，其將表達Gag/Gag-Pol的質粒與表達融合蛋白A的質粒共轉染宿主細胞，添加待檢樣品至共轉染后的宿主細胞，檢測細胞BRET1ratio的變化，BRET1 ratio下降，則待檢樣品為早成熟化誘導劑，所述融合蛋白A為由p2/p7連接的，一端為熒光素酶，另一端為熒光素酶激發受體的融合蛋白，該熒光素酶與熒光素酶激發受體之間能夠產生生物發光共振能量轉移1。利用本發明方法能夠方便、快速地篩選早成熟化誘導劑，對HIV的治療藥物的篩選提供了新途徑。
文檔編號C12Q1/66GK102051407SQ200910237160
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月9日 優先權日2009年11月9日
發明者劉振龍, 岑山, 張全, 李曉宇, 楊亮, 賈平平, 魏曉露 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所