一種建立高效表達人環氧合酶2的重組人腸癌細胞株的方法及應用的制作方法

專利名稱：一種建立高效表達人環氧合酶2的重組人腸癌細胞株的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬基因工程制藥技術及應用領域，涉及一種建立高效表達人環氧合酶 2(C0X-2)的重組人腸癌HCT-116細胞株HCT-116ωχ_2的方法及應用，具體地說，本發明涉及 建立穩定轉染含人環氧合酶2(C0X1)基因啟動子編碼序列和熒光素酶報告基因序列的永 生化哺乳動物細胞系，通過壓力篩選和基因擴增后，獲得穩定、靈敏、高效表達C0X-2的腫 瘤克隆細胞株，并將細胞株應用于以C0X-2基因為靶點的抗腫瘤藥物的篩選及評價。
背景技術：
研究表明，環氧化酶(CyClOOXygenaSe，C0X)是前列腺素(PGs)合成過程中一個重 要的限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產物，從而維持機體的各種病理生理過 程。目前發現哺乳動物的環氧化酶至少有C0X-1和C0X-2兩個同工酶，C0X-1在組織中的 表達相當穩定，對維持胃和腎功能的平衡發揮重要的作用，而C0X-2的表達在不同的組織、 不同的狀況下變動很大，它的主要產物是環前列腺素和PGE2。現有技術公開了 C0X-2基因全長8. 3kb,由10個外顯子和9個內含子組成，定位 于第1號染色體Icf 2 25_3，由5’端0. Skb的轉錄起始點上游區，61Λ的蛋白質編碼區以及 1.5kb 3，端非編碼區組成，其mRNA約4. 51Λ，基因編碼603或604個氨基酸，含有17個氨 基酸殘基構成的信號肽，與C0X-1有59%-61%的同源性。在其5’旁側區，含有幾個可能 的轉錄調節序列，包括轉錄起始位點上游25bp位處共同的TATA框序列。一個C/EBP基序， 兩個AP-2位點，三個SP1位點，兩個NF- κ B位點，一個CRE基序和一個EST-I位點。在蛋白 質編碼區，C0X-2基因的ORF起始于CTGCGATGC序列，由10個外顯子編碼。在3，旁側區， 整個3’UTR包含于外顯子10，其間無內含子存在，有三個富含腺嘌呤核苷酸的序列M TAAA， 相互之間相隔^Obp。C0X-2發現于某些細胞中，主要定位于核膜。因此，C0X-2產生的Pk產物可進入 核內，調節靶細胞基因的轉錄。研究表明C0X-2不僅是啟動炎癥反應的關鍵酶，而且其表達 和與腫瘤的發生、增殖、分化、浸潤、轉移及預后等方面有重要作用。研究提示，C0X-2主要通 過以下途徑導致胃癌的發生(1)C0X作為一種刺激因子在靜息狀態下不表達，只有在某些 惡性細胞中，可能由于癌基因的激活或抑癌基因的失活而被活化，C0X-2的轉錄后失控，使 C0X-2過度表達，C0X-2的過氧化酶活化可催化一系列異體氧化反應，參與氧化誘癌途徑， 從而形成致癌物；(2) C0X-2通過催化形成Pk促進腫瘤的發生，C0X-2通過催化反應可產生 PGG、PGH、PGE，其中PGE為其主要代謝產物，可誘導細胞增殖，促進細胞粘附，抑制具有免疫 調節功能的淋巴因子的產生，抑制T細胞和B細胞增殖，降低機體對腫瘤細胞的局部免疫反 應；(3)C0X-2過度表達可增加PGE2的合成，PGE2誘導細胞增殖并刺激Bcl_2蛋白表達，降 低介導凋亡的轉化生長因子- β (TGF-β )2型受體水平，降低介導細胞間粘附的E-鈣粘蛋 白(E-cadherin)活性，從而抵抗各種刺激誘導的細胞凋亡，促進細胞增殖，引起腫瘤的發 生；(4)C0X-2促進PG合成的增加如PGE1、PGE2和15d_PGJ等作用于EP2、EP4及PPARr等，
4通過EP/cAMP等途徑激活各種胞內激酶如PKA、Ras蛋白活性，誘導VEGFmRNA和蛋白表達 水平上調，參與腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤的轉移；( C0X-2可使細胞周期存在明顯G1 期推遲，而且Cyclin D1蛋白激酶、Rb1激酶和細胞周期依賴激酶(⑶K4)活性明顯下降，這 樣通過阻礙細胞周期，阻止延長細胞生存期，增強對胞外基質的粘附，而異常延長細胞生存 期使一系列基因突變，促進腫瘤形成。另外，C0X-2可促進腫瘤細胞相關血管的生成，增加 癌細胞的侵襲性，激活基質金居蛋白酶2降解細胞外基質，產生促血小板凝集的血栓烷等， 從而有利于腫瘤的侵襲和轉移。C0X-2在腫瘤發生、發展和轉移的整個過程中起著重要的作用，參與了腫瘤形成的 多個環節。因此，對腫瘤組織或腫瘤細胞中C0X-2活性檢測可以作為監測腫瘤的發生發展 的一個重要手段，同時C0X-2在細胞中的基因表達水平也可以作為抗腫瘤藥物篩選的一個 重要指標。熒光素酶報告基因(Iuc)根據來源不同主要分為細菌熒光素酶 (bacterialluciferase，BL)、螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase, FL)以及以海星、發 光魚、發光甲蟲等為來源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。BL是 由2個多肽亞基組成的異源二聚體，相對分子質量約為79X 103。在還原性黃素(FMNH)、 八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在時，發射出藍綠光G50-490nm)。FL由單 一的多肽鏈組成，相對分子質量為(60 64) X IO3,在Mg2+、ATP、O2存在時催化D-熒光素 (D-Luciferin)氧化脫羧發光(550 580nm)。由于Iuc的檢測方法簡便，靈敏度高，因而成 為目前應用最廣泛的報告基因之一，其主要應該于基因表達研究、蛋白質間相互作用研究、 毒性物質檢測研究、RNAi研究等。熒光素酶基因已被廣泛應用于不同啟動子下外源基因表達強度和轉錄調控的研 究的報告基因。該報告基因的靈敏度高，對于研究低水平表達如弱啟動子的調控方式有較 大的意義。實踐表明，熒光素酶檢測的最大優點是不損害監測對象，便于在整體水平或離體 器官內測定基因產物是否表達。可見光的形成使觀察基因的空間表達成為可能，為研究細 胞分化、細胞問聯絡、基因的空間表達和生物(或細胞)間的相互作用提供了新的途徑。

發明內容
本發明的目的是為研究腫瘤相關基因的表達提供一種更為直接、便捷、敏感的 技術手段。涉及一種建立高效表達人環氧合酶2 (C0X-2)的重組人腸癌HCT-116細胞株 HCT-116cox-2的方法，具體地說，本發明涉及建立穩定轉染含人環氧合酶2 (COX-幻基因啟動 子編碼序列和熒光素酶報告基因序列的永生化哺乳動物細胞系，通過壓力篩選和基因擴增 后，獲得穩定、靈敏、高效表達C0X-2的腫瘤克隆細胞株。本發明在前期構建的pGL3-BasiC-C0X-2重組質粒的基礎上，采用含熒光素酶基 因(lUC2/I hlUC)和藥物篩選基因抗性位點的新型載體質粒pGL4系列載體，構建新的重組 質粒pGL4-C0X-2，使該重組質粒在原來pGL3-BasiC-C0X-2重組質粒只具備螢火蟲熒光素 酶基因的基礎上，同時含有一個可以進行穩定轉染的抗性基因；通過將重組質粒穩定轉染 哺乳動物細胞，用藥物對細胞進行篩選，建立一種穩定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基 因的重組細胞極株。具體而言，本發明運用基因重組和分子克隆技術，擴增人C0X-2基因啟動子序列，將擴增出的C0X-2基因基因子序列和pGL4系列載體質粒運用酶切、酶連、基因篩選等基因 重組技術進行克隆，得到連接產物然并轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，制備出的含C0X-2 基因啟動子和熒光素酶報告基因的重組質粒。將構建好的重組質粒與含海腎熒光素酶報告 基因內參質粒瞬時共轉染腫瘤細胞，通過檢測細胞的雙熒光素酶活性證實重組質粒能在細 胞內穩定表達。再將重組質粒進行穩定轉染，通過藥物進行加壓篩選，將質粒序列完全整合 到細胞內，使其能夠在腫瘤細胞內穩定表達C0X-2基因啟動子的活性，建立穩定表達C0X-2 基因和熒光素酶報告基因的重組腫瘤細胞株。分別通過在體外細胞和體內動物實驗檢測抗 腫瘤藥物對重組腫瘤細胞的抑制作用，來反映抗腫瘤藥物對C0X-2基因啟動子轉錄活性的 影響，評價藥物的抗癌效能，從而廣泛的應用于以C0X-2為靶點抗腫瘤藥物的篩選。本發明建立高效表達人環氧合酶2的重組人腸癌細胞株的方法包括如下步驟1，構建穩定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基因的重組質粒pGL4-C0X-2，通過提取人C0X-2基因啟動子，以含熒光素酶報告基因的PGL4系列質粒為載體， 插入C0X-2基因啟動子，構建含C0X-2基因啟動子和熒光素酶報告基因的pGL4-C0X-2重組 質粒；本發明中，可采用的載體質粒主要有pGL4. 14-22和pGL4. 76-84、其中最常用的是 pGL4. 17[luc2/Neo] (5599bp)和 pGL4. 79[hRluc/Neo] (4879bp)，本發明以 pGL4. 17[luc2/ Neo]為例構建重組質粒，并將重組質粒命名為pGL4. 17-C0X-2 ；所述的報告基因選自螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶基因，主要包括luc2、 luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP、hRlucCP，其中 luc2 和 luc2P 為最常用的報告基因；構建上述重組質粒PGL4-C0X-2，通過以下步驟1)制備含有C0X-2基因啟動子目的序列(1)提取含有C0X-2基因啟動子人基因組DNA ；(2) PCR擴增、純化C0X-2基因啟動子目的序列；2)大量制備pGL4. 17載體質粒3)構建穩定表達C0X-2基因啟動子的重組質粒(1) C0X-2基因啟動子目的序列和pGL4. 17載體質粒的雙酶切；(2) C0X-2基因啟動子目的序列和pGL4. 17載體質粒連接；(3)連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，含Amf的瓊脂平板篩選陽性克隆；(4)陽性克隆單菌落的PCR鑒定，剔除假陽性菌落；(5)挑取陽性克隆單菌落搖菌，大量擴增提取制備重組質粒；(6) PCR、雙酶切及測序鑒定重組質粒。本發明中，所述的重組質粒中所含的載體質粒為含穩定轉染抗生素篩選基因的質 粒，其包括HygrcANec/和Pure/。其中最常用的是Nec/基因。本發明中，所述的重組質粒中包含多酶切位點和β -內酰胺酶基因。本發明中，所述的重組質粒中所包含的載體質粒和人環氧合酶2基因啟動子均含 有Bgl II和Hind III雙酶切位點 本發明中，所述的熒光素酶報告基因選自螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶基因。
本發明中，所述的人環氧合酶2基因啟動子序列，其長度為250_700bp，優選長度 為 562bp，序列中包含 NF- κ B、NF-IL6、SP-1、AP-2、CRE、E-Box 轉錄位點和 TATA 框。
本發明中，所述的螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶基因包括luc2、luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP、hRlucC。2，建立高效表達人環氧合酶2 (C0X-2)的重組細胞株HCT_116G°X_2穩定轉染含C0X-2基因啟動子和熒光素酶報告基因的PGL4-C0X-2重組質粒到人 腸癌HCT-116細胞株(市購)，通過藥物加壓篩選、基因擴增后，獲得穩定、靈敏、高效表達 C0X-2基因的克隆細胞株，該細胞株在高效表達C0X-2的同時能穩定表達螢火蟲熒光素酶 或海腎熒光素酶活性；建立上述高效表達人環氧合酶2(C0X_2)的重組細胞株HCT_116G°X_2通過以下步 驟1)確定G418的篩選HCT-116細胞的最低篩選濃度；2)pGL4. 17-C0X-2重組質粒穩定轉染HCT-116細胞；3)G418篩選穩定轉染后的HCT-116細胞；(1)重組質粒轉染HCT-116細胞24h后加入G418篩選；(2)陽性單克隆細胞簇接種及傳代培養；(3) RT-PCR或flfestern Blot鑒定單克隆細胞株的真陽性；4)穩定傳代培養的細胞進行熒光素酶活性檢測。本發明的進一步目的是提供上述穩定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基因的重 組人腸癌HCT-116 x_2細胞株的應用。本發明通過體外實驗和體內實驗，驗證抗腫瘤藥物對C0X-2基因啟動子轉錄活性 的影響，評價藥物的抗癌效能，結果證實，所述的細胞株可應用于以C0X-2基因為靶點的抗 腫瘤藥物的篩選和評價。本發明中，體外實驗采用不同濃度的抗腫瘤藥物作用于正常人腸癌HCT-116細胞 株和高表達C0X-2基因的HCT_116g°x_2細胞株，作用不同時間后檢測抗腫瘤藥物對兩種細胞 的生長抑制作用及對HCT-116 x_2細胞株熒光素酶活性的影響；體內實驗包括將正常的人腸癌HCT-116細胞和高表達C0X-2基因的重組人腸癌 HCT-116ωχ_2細胞株接種于裸小鼠皮下，建立裸小鼠人腸癌皮下移植瘤，使用抗腫瘤藥物治 療裸小鼠，治療后檢測裸小鼠瘤體大小、C0X-2蛋白和mRNA的表達；通過以下步驟1) HCT-116ωχ_2細胞株篩選抗腫瘤藥物(1)正常培養HCT-116ωχ_2細胞并穩定傳代；(2)抗腫瘤藥物對HCT-I 16g°x_2細胞生長抑制作用的檢測；(3)抗腫瘤藥物對HCT-116 X_2細胞熒光素酶活性的影響；2)建立人腸癌HCT-I 16g°x_2細胞裸小鼠移植瘤模型(1)重組人腸癌HCT_116g°x_2細胞株皮下接種裸小鼠，連續傳代；(2)取生長旺盛的瘤組織接種裸小鼠右側腋窩，建立裸小鼠人腸癌移植瘤模型；3)抗腫瘤藥物對人腸癌HCT-116 x_2細胞裸小鼠移植瘤模型C0X-2表達的影響(1)不同濃度抗腫瘤藥物給藥裸小鼠移植瘤模型；(2)檢測裸小鼠瘤體大小、C0X-2蛋白和mRNA的表達。本發明中，所述的抗腫瘤藥物，包括抗腫瘤的化學、生物類藥物，中藥復方、中藥單體和單味中藥提取物。本發明通過建立重組人腸癌HCT_116G°X_2細胞株的方法，可進一步建立一個可廣泛 應用于表達其它相關基因(如HIF-1、NF-KB等)的技術平臺，進而將此方法廣泛應用于現 代基因工程制藥領域。本發明方法建立的重組人腸癌HCT_116G°X_2細胞株具有以下優點能穩定表達人環氧合酶2(C0X1)基因啟動子，可以快速、高效的合成環氧合酶2 蛋白，廣泛的應用于篩選以C0X-2基因為靶點的抗腫瘤藥物；含有熒光素酶報告基因(luc2或hRluc)，能穩定表達螢火蟲熒光素酶或海腎熒光 素酶活性，在各種細胞實驗中，可以通過檢測熒光活性來間接反映細胞內C0X-2基因的表 達水平，克服其他通過mRNA或蛋白的檢測來反映C0X-2基因的表達水平；建立的重組人腸癌HCT-116ωχ_2細胞株能夠穩定傳代培養，傳代后細胞內C0X-2基 因啟動子和熒光素酶報告基因的生物學性狀不會發生改變。


圖1. C0X-2基因啟動子序列的克隆，其中，Marker 為 DL2000，1、2、3、4 為 C0X-2 基因啟動子片段(562bp)。圖2. pGL4. 17-C0X-2重組質粒的Bgl II和Hind III雙酶切及PCR結果，其中，Marker 為 DL2000,1 為 pLG4. 17-C0X-2 重組質粒 PCR 擴增結果(562bp)，2 為 pLG4. 17-C0X-2 重組質粒雙酶切結果(5599+562bp)，3 為 pLG4. 17-C0X-2 重組質粒(6161bp)，4 為 pLG4. 17 載體質粒(5599bp)。圖3. pGL4. 17_C0X_2重組質粒測序比對結果。圖4. pGL4. 17-C0X-2重組質粒構建概要圖。圖5. pGL4. 17_C0X_2重組質粒與內參質粒共轉染人腸癌HCT-116細胞的雙熒光素 酶活性。圖6.抗腫瘤藥物對重組的人腸癌HCT_116g°x_2細胞株生長抑制作用的比較。圖7.不同濃度抗腫瘤藥物對重組的人腸癌HCT-116 X-2細胞株熒光素酶活性的影 響。圖8. Tan IIA對裸小鼠人腸癌HCT-116ωχ_2細胞移植瘤模型瘤體作用比較。圖9. Tan IIA對裸小鼠人腸癌HCT-116G°X_2細胞移植瘤模型C0X_2mRNA表達的影 響。
具體實施例方式下面通過實施例和說明書附圖對本發明的方案做進一步的說明，但實施例和說明 書附圖僅對本發明作必要性的解釋，其中的實例決不意味著對本發明內容的限制。實施例lpGL4. 17-C0X-2重組質粒的構建根據已知人的C0X-2基因啟動子序列[GenBank (gi | 4506264)]設計并合成兩端引 物
上游(5’端)引物包含C0X-2基因啟動子互補堿基，一個Hind III識別位點，三 個保護堿基，5’ -CCCAAGCTTCCTGGACGTGCTCCTGAC-3’。下游(3’端)引物包含C0X-2基因啟動子互補堿基，一個Bgl II識別位點，二個 保護堿基，5，-GAAGATCTTCCTCGACCCTCTAAAGACG-3，。以人基因組DNA為模板，利用常規PCR反應進行擴增，擴增體系為基因組 DNA2y L、2. 5mM 的 dNTP 4 μ LUOXbuffer 5 μ L、10 μ M 的上下游引物各 1 μ L、高保真 Taq 酶1 μ L，加水至50 μ L，反應條件為95°C預變性!Min ；94°C變性30s、65°C退火45s、72°C 延伸lmin，共35個循環；72°C終末延伸5min，最后4°C保溫。擴增得到約562bp的目的 片段(圖1)，將目的片段純化回收后與載體質粒PGL4. 17均進行Bgl II和Hind III雙 酶切，酶切體系為pGL4. 17/C0X-2 目的片段(10 μ L/30 μ L)、IOU/μ L 的 Bgl II 和 Hind III 各 2. 5 μ LUOXTango Buffer 5 μ L，加水至 50 μ L，37°C 酶切過夜(8_12h)。將回收 純化后得到的兩個線性片段用T4DNA連接酶進行酶連，體系為C0X-2啟動子片段回收產 物(50ng/y L)5y L、pGL4. 17-C0X-2 回收產物(200ng/ μ L) 1 μ LUO X Buffer 2 μ L、T4DNA ligase (5U/μ L，Fermentas) 1 μ L，加水至20 μ L，16°C酶連5_8h，也可酶連過夜。將酶連產 物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經過含氨芐青霉素的LB固體培養基篩選，在得到轉化子 的平板上隨機挑取單菌落進行PCR擴增，得到的陽性菌落進行搖菌擴增質粒，提取質粒后 進行PCR、Hind III和Bgl II雙酶切(圖2)及測序(圖3)鑒定，證實與目的序列一致。實施例2重組質粒pGL4. 17_C0X_2轉染腫瘤細胞及雙熒光素酶活性檢測將培養于含有10%新生牛血清、100U/ml青霉素、100μ g/ml鏈霉素RPMI-1640完 全培養基中人腸癌HCT-116細胞株，按0. 5 X IO5/孔的量在M孔板中接種對數生長期的細 胞，在37°C 5% CO2培養箱中過夜培養，直到細胞密度達到80%以上。將上述常規培養的人腸癌HCT-116細胞隨機分為陰性對照組、重組質粒組和陽性 對照組，分別按如下劑量加入不同質粒進行共轉染(1)陰性對照組:pGL4. 17 (0. 25 μ g) +pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3(2)重組質粒組:pGL4. 17-C0X-2 (0· 25 μ g) +pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3(3)陽性對照組:pGL3-Basic-C0X-2 (0. 25 μ g)+pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3在滅菌后的1.5ml離心管中配制待轉染質粒和內參質粒pRL_TK、轉染脂質體 Transfectam Reagent 復合物如下將待轉染質粒、內參質粒pRL-TK各0. 25 μ g/孔稀釋至50 μ L/孔不含血清和抗生 素的RPMI-1640中，輕柔混均后靜置5min。然后將轉染脂質體懸液(1 μ L/孔)加入50 μ L/ 孔不含血清和抗生素的RPMI-1640中，輕柔混均后靜置5min。最后將兩者混合在一起，充分 混勻靜置20min，使質粒DNA與轉染脂質體充分結合，形成DNA/脂質體復合物。吸除M孔板中的培養液，用不含血清和抗生素的RPMI-1640培養液潤洗一遍，然 后在每個孔中加入100 μ L對應的DNA/脂質體復合物。在37°C、5% CO2培養箱中培養3- 后，向各孔加入1000 μ 1含RPMI-1640完全培養基。繼續培養后收集樣品，進行雙 熒光素酶檢測。按照 Progega 公司的 Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒說明書指導 配制工作液IXPLB(細胞裂解液)、LAR II (螢火蟲熒光素酶檢測液)、1ΧΜορ & Glo Reagent (海腎熒光素酶檢測液)。將上述各組共轉染后的HCT-116細胞培養對-4他后收
9集樣品。用PBS潤洗一遍，加入100 μ L/孔的1 XPLB裂解液(M孔)，搖床室溫下200rpm 搖動 15min。取 100 μ L 的 LAR II 于 1. 5mL 的離心管內，放入 GloMax 20/20 Iuminometer 化學發光檢測儀，加入20 μ L的細胞裂解液于離心管中，發光儀測讀10s。檢測完成后，再加 入100 μ L的IXMop & Glo Reagent，發光儀測讀IOsec。記錄檢測數據。表1是不同質粒轉染MKN45細胞后的螢火蟲熒光素酶活性的比較結果。表 1.
_Group_Firefly_Renilla_Fire/ren
6895647 3.69799E-05 7889634 4.3855E-05 6564728 3.01612E-05 7564325 0.029699544 8232194 0.028787465 8896532 0.029857927 7648734 0.030823009 9003772 0.032791368 8230694 0.032639653實施例3穩定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基因的重組人腸癌HCT-116ωχ_2細 胞株的建立采用脂質體轉染法穩定轉染pGL4. 17-C0X-2重組質粒進人腸癌HCT-116細胞，通 過G418藥物加壓篩選，建立穩定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基因的重組人腸癌細胞株 HCT-116g°x_2。具體方法如下細胞轉染前先進行G418藥物濃度的篩選，將培養于含有10%新生牛血清、100U/ mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素RPMI-1640完全培養基中人腸癌HCT-116細胞株，按1 X IO4/ 孔的量在M孔板中接種對數生長期的細胞，在37°C 5% CO2培養箱中過夜培養。第二天吸 除培養板中的舊培養液，分別加入500 μ L的0、100、200、300、400、500、600、700 μ g/mL的含 G418的RPMI-1640完全培養基，復3孔，每天觀察細胞的生長狀態，3-5天換液一次。14天 時，觀察細胞全部死亡的最低濃度孔，在300 μ g/mL，做穩定轉染時選用的400 μ g/mL。轉染前，在60mm的培養皿中接種8 X IO5個細胞，加入5ml完全培養基，37°C，5 % CO2培養，至轉染時要求細胞40% -80%匯合。通過分光光度計測定pGL4. 17-C0X-2重組質 粒的濃度，用不含血清、抗生素的培養基稀釋5 μ g的pGL4. 17-C0X-2至總體積500 μ L，稀 釋后應顛倒幾次離心管以混勻混合物，靜置5min。另取一新的1. 5mL的離心管，用不含血 清、抗生素的培養基500 μ L稀釋10 μ L轉染脂質體(Transfectamine Reagent)，稀釋后應 顛倒幾次離心管以混勻混合物，靜置5min將兩者混合在一起，在室溫下Q0-25°C)孵育混 合物20分鐘，使其充分形成質粒DNA/脂質體復合物。在孵育的同時，吸出培養皿中的培養 基，用PBS液洗滌一次，加入3ml的無血無抗生素培養基。孵育完成后吸除培養基，將DNA/ 脂質體復合物全部加入60mm的培養皿中，輕輕搖動培養皿以混勻。37°C、5%C02培養，在細胞匯合度不超過50%時加入400μ g/mL的G418進行篩選。 注意，轉染時轉染兩組細胞，組一在轉染后細胞匯合度不超過50%時(一般是Mh)加入 G418進行篩選；組二 在轉染后待細胞匯合度達到80%時1/4000、1/1000、1/300分別接種
pGL4.1權利要求
1.一種建立高效表達人環氧合酶2的重組人腸癌細胞株的方法，其特征在于，包括如 下步驟1)構建穩定表達人環氧合酶2基因和熒光素酶報告基因的重組質粒PGL4-C0X-2，通過提取人環氧合酶2基因啟動子，以含熒光素酶報告基因的PGL4系列質粒為載體，插入人環氧合酶2基因啟動子，構建含人環氧合酶2基因啟動子和熒光素酶報告基因的 PGL4-C0X-2重組質粒；2)建立高效表達人環氧合酶2的重組人腸癌細胞株HCT-116ωχ_2穩定轉染含人環氧合酶2基因啟動子和熒光素酶報告基因的PGL4-C0X-2重組質粒到 人腸癌HCT-116細胞株，通過藥物加壓篩選、基因擴增后，獲得高效表達人環氧合酶2基因 的克隆細胞株HCT-I 16g°x_2 ；所述的細胞株同時高效表達人環氧合酶2和熒光素酶活性。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質粒中所含的載體質粒為含穩 定轉染抗生素篩選基因的質粒，其包括Hygrc/、Neor和Pure/。
3.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質粒中包含多酶切位點和內 酰胺酶基因。
4.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質粒中所包含的載體質粒和人 環氧合酶2基因啟動子均含有BglII和Hind III雙酶切位點。
5.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的熒光素酶報告基因選自螢火蟲熒光 素酶或海腎熒光素酶基因。
6.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人環氧合酶2基因啟動子序列，其長 度為 250-700 bp，序列中包含 NF-k B、NF-IL6、SP-l、AP-2、CRE、E-BoX 轉錄位點和 TATA 框。
7.按權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的人環氧合酶2基因啟動子序列，其長 度為56^p。
8.按權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶基 因包括 luc2、luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP 和 hRlucC。
9.按權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中構建重組質粒PGL4-C0X-2，通過以 下步驟1)制備含有C0X-2基因啟動子目的序列(1)提取含有C0X-2基因啟動子人基因組DNA；(2)PCR擴增、純化C0X-2基因啟動子目的序列；2)大量制備pGL4.17載體質粒3)構建穩定表達C0X-2基因啟動子的重組質粒(DC0X-2基因啟動子目的序列和pGL4. 17載體質粒的雙酶切；(2)C0X-2基因啟動子目的序列和pGL4. 17載體質粒連接；(3)連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，含Amf的瓊脂平板篩選陽性克隆；(4)陽性克隆單菌落的PCR鑒定，剔除假陽性菌落；(5)挑取陽性克隆單菌落搖菌，大量擴增提取制備重組質粒；(6)PCR、雙酶切及測序鑒定重組質粒。
10.按權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中建立高效表達人環氧合酶2的重組細胞株HCT-116 X_2通過以下步驟1)確定G418的篩選HCT-116細胞的最低篩選濃度；2)pGL4.17-C0X-2重組質粒穩定轉染HCT-116細胞；3)G418篩選穩定轉染后的HCT-116細胞；(1)重組質粒轉染HCT-116細胞24h后加入G418篩選；(2)陽性單克隆細胞簇接種及傳代培養；(3)RT-PCR或Wfestern Blot鑒定單克隆細胞株的真陽性；4)穩定傳代培養的細胞進行熒光素酶活性檢測。
11.權利要求1制得的人腸癌細胞株HCT-116 X-2在抗腫瘤藥物的篩選和評價中的應用。
12.按權利要求11的應用，其特征在于所述的抗腫瘤藥物以人環氧合酶2基因為靶點。
13.按權利要求11的應用，其特征在于所述的抗腫瘤藥物為抗腫瘤的化學藥物、生物 類藥物，中藥復方、中藥單體或單味中藥提取物。
全文摘要
本發明屬基因工程制藥技術及應用領域，涉及一種建立高效表達人環氧合酶2的重組人腸癌細胞株HCT-116COX-2的方法及應用。本發明方法通過建立穩定轉染含人環氧合酶2基因啟動子編碼序列和熒光素酶報告基因序列的永生化哺乳動物細胞系，經壓力篩選和基因擴增后，獲得穩定、靈敏、高效表達人環氧合酶2的腫瘤克隆細胞株，并將該細胞株應用于以人環氧合酶2基因為靶點的抗腫瘤藥物的篩選及評價。本發明建立的重組人腸癌細胞株具有靶向性強、高效快速、反應靈敏等優點，具有可觀的應用前景。
文檔編號C12N5/10GK102115762SQ20091024752
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者劉宣, 周利紅, 李琦, 王炎, 范忠澤 申請人:上海中醫藥大學附屬普陀醫院