專利名稱：甘藍型油菜BnGLABRA2啟動子及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和生物技術領域，具體涉及一種甘藍型油菜BnGLABRA2啟 動子，還涉及油菜BnGLABRA2啟動子的制備方法，同時還涉及油菜BnGLABRA2啟動子在油菜 基因工程中的應用。
背景技術：
植物基因啟動子在基因的表達調控中起著關鍵作用。基因的表達調控是多種因素 綜合作用的結果。一般按照一個事件的先后順序，基因的調控分為轉錄水平的調控、翻譯水 平的調控以及蛋白質加工水平的調控等。基因編碼的蛋白質和RNA及其次級代謝產物對于 維持生物體的整個生命活動極其重要。任何基因表達調控的錯誤都會對生命造成嚴重后 果。因此，對于基因表達調控的機理研究一直是分子生物學研究的熱點。轉錄水平的調控 最為重要。啟動子是轉錄水平調控的重要元件，也是基因工程表達載體的一個重要組成部 分。在某種程度上，啟動子決定了基因表達的時空順序以及表達強度。所以，研究啟動子的 功能序列對于基因表達調控機制以及日漸成熟的植物基因工程具有非常重要的意義。構建能夠高水平表達異源表達載體，啟動子起到關鍵作用。它決定了外源基因 的轉錄效率和基因的表達水平。植物轉基因育種所用的啟動子可分為組成型和特異型 兩類。組成型啟動子驅動的外源基因在轉基因的所有時期和組織中穩定的表達。對許 多雙子葉植物的轉化，通常都使用含花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子或胭脂氨酸 合成酶nos啟動子的質粒載體，而在單子葉植物轉化中最常用的是含有水稻肌動蛋白 Act啟動子，玉米泛素Ubi啟動子及35S啟動子的質粒載體(關麗英等，轉基因植物中外 源基因的有效表達及其安全評價首都師范大學學報2002，23(2) :52-56)。但是很多時 候外源基因在受體植物中的持續高效表達不僅造成生物體內能源的浪費，而且在所有組 織中的表達有可能對植株本身具有毒害作用，甚至引起轉基因安全問題(Jia S-R(賈士 榮)· Environment andfoodbiosafty assessment of transgenic plants. Advanced of Bioengineer. 1997,17(6) 37-42 ；Morris S H, Adley C.C. Irish public perceptions andattitudes to modern biotechnology :an overview with a focus on GM foods. Trends in Biotechnology, 2001,19 (2) :43_48)。因此，誘導型啟動子和組織特異性啟動子 的研究和應用日益受到育種工作者的重視。在轉基因植物中鑒定的誘導型啟動子包括熱激 啟動子，來源于菠菜硝酸還原酶的誘導型啟動子等等。(關麗英等，轉基因植物中外源基因 的有效表達及其安全評價.首都師范大學學報.2002，23 (2) :52-56)。誘導型啟動子的應 用也具有一定限制，對受體植物進行的外在條件處理，如熱激，激素處理等可能引起生物體 內一系列的生理生化反應而不利于植株的正常生長。而且化學調控系統中用作誘導物的甲 基脫氫皮質醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四環素(tetracycline)都對 生態環境有害，不宜用于生產實踐。而使用植物體內本身的組織特異性啟動子就可以避免 這種問題。顯然，轉基因的組織特異性表達必將有效提高轉基因作物的生物安全性。近年 來在這方面已經取得很大成就。在不同組織特異性表達的各類啟動子已不斷得到研究(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究生物技術通報2007，(4) :21-24)。油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計民生具有重要影響。 因此提高油菜的品質，一直是科研工作者追求的目的。隨著轉基因技術的成熟，油菜必然會 面臨轉基因安全風險的輿論。用不在油菜種子中表達的啟動子來啟動目的基因的表達是解 決這個問題的一個可行方法。既可以達到提高油菜各方面品質，又不引起食用油安全風險。因此，本實驗開發了一系列甘藍型油菜的內源啟動子。通過檢測報告基因⑶S的 表達特征證明各啟動子的時空表達模式。我們的結果預示著這些啟動子在轉基因油菜中具 有相當的應用前景。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種甘藍型油菜BnGLABRA2(簡稱BnGL2)啟動子GP2。 該啟動子的時空表達模式可用于研究基因的表達形式，優點在于，來源于植物內源的組織 特異性啟動子能夠精確定位所調控的基因，可應用于植物基因工程研究及籽用油菜安全轉 基因研究。本發明的另一個目的是在于提供了一種甘藍型油菜GL2啟動子GP2的制備方法。 該方法通過對功能區進行適當的缺失以及檢測所調控的GUS基因活性部位來驗證啟動子 的功能元件。其優點在于操作簡單，結果穩定可靠。本發明的再一個目的是在于提供了一種甘藍型油菜BnGL2基因全長啟動子SEQ ID NO :1在葉片表皮毛以及種子中的應用；一種甘藍型油菜BnGL2基因部分缺失啟動子SEQ ID NO: 1 (1555 2882)在根部以及整個葉脈中的應用；一種甘藍型油菜BnGL2基因全長啟動 子SEQ ID NO: 1(2098 2882)在葉片表皮毛以及中柱葉脈中的應用。全長啟動子GP2的 表達模式能夠反映油菜GL2基因的功能，即在發育過程中具有重要功能；缺失啟動子GP2C 和GP2D因所調控的GUS基因表達組織各有特點，而且均不在種子中表達，可以用于籽用油 菜轉基因研究和育種應用，優點是具有生物安全性和開發應用價值。為了完成上述目的，本發明采用如下技術方案一種甘藍型油菜GL2啟動子GP2的制備方法，其步驟是1、基因組步移克隆啟動子序列利用SDS裂解法提取基因組DNA，按照基因組步移試劑盒(購自Clontech公司) 操作程序，進行基因組步移，每次步移擴增兩輪PCR克隆油菜。具體步驟為提取基因組DNA 25口1^(0.148/^0，分別用核酸內切酶0儀I.EcoR I.Pvu II和Stu I酶切，純化后加入接 頭形成四個不同的基因組DNA庫，用作首次基因組步移第一輪PCR模板，根據目的基因保守 序列設計特異性引物GSPl (表1)與試劑盒內上游接頭引物APl (表1)進行擴增。第二輪PCR 以第一輪PCR產物的50倍稀釋液(水稀釋液)為模板，同樣方法設計的特異性引物GSP2和 接頭引物AP2(表1)進行擴增，隨后進行第二輪基因組步移。所有PCR反應均為50μ L擴 增體系模板 lyL，dNTPs 0. 2mM，引物 0. 5mM，LA Taq 酶 1· 25 單位，10 X LA-PCR buffer (含 MgCl2) 5 μ L，補水至50 μ L。反應條件均為94°C預變性Imin ；98°C 10s，72°C 6min7個循環； 980C 10s，67°C6min 33個循環；72延伸lOmin。PCR產物經1. 0% (質量體積比，以下相同) 瓊脂糖凝膠電泳檢測，Gel Extraction Kit (購自天根生化科技北京有限公司)純化回收 后，連接到PMD18-T載體(購自TaKaRa公司)，轉化gold(購自大連寶生物生物制品公司)感受態細胞，挑取陽性克隆，酶切驗證后測序，得到目的基因上游的側翼序列。2、啟動子序列生物信息學分析將所克隆序列用BLASTN(http://www. . ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)進行同源比 對。啟動子核心元件和上游順式作用元件用啟動子預測軟件http://WWW. fruitfly. org/ seq—tools/promoter. btml 禾口 PIJVCE(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE)database (J). NucleicAcids Research. 1999,27 297 300)http:// www. dna. affrc. go. jp/PLACE/進行預測。得到可能的核心啟動子序列和上游啟動子元件。3、全長啟動子、缺失啟動子的擴增以及pMDIS-T-GP載體的構建以基因組DNA為模板，根據前期得到的啟動子序列，設計擴增各缺失片段的引物 進行PCR擴增。所有引物的5'端含有Hind III酶切位點，3'端含有Xba I酶切位點。反 應體系為 25 μ L 內含1 XPCR buffer. , MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L(毫摩爾每升)、 引物濃度為0. 5mol/L, Pfu酶1. 5單位，模板約lOOng，根據具體情況設置循環參數。PCR 產物1.0% (質量體積比，以下相同))瓊脂糖凝膠檢測，回收試劑盒回收各目的缺失片段。 按各回收的缺失片段載體(0. 3pmol缺失片段0. Ipmol載體片段)=3 1的比例混 合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，IX反應緩沖液，無菌水補充體積至25ml，16°C過夜連 接反應。凍融法轉化大腸桿菌gold菌(前面已述)感受態細胞(J.薩姆布魯克.D. W.拉 塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，96-99頁)。涂布于含有 Amp的LB固體平板上，37°C培養過夜，各挑選白斑三個，做菌落PCR檢測，將陽性重組子接 種于含Amp 50 μ g/mL的液體LB培養基，37°C 200r/min振蕩培養過夜，小量堿法提取質粒 (J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社)， Hind ΙΙΙ/Xba I酶切質粒1 μ g，0. 8% (質量體積比)瓊脂糖凝膠檢測。檢測正確的陽性 重組克隆，分別命名為PMD18-X (將目的片段連入pMDIS-T載體構建而成，以下相同)(X可 為1、2、3、4、5等)，為了確保載體中各啟動子的序列信息，分別以M13F/M13R為引物(M13 R5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，；M13R5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，)，將 pMD18_X(前面 已述)進行序列測定，分析結果，一種分離的啟動子，得到了一種甘藍型油菜BnGL2基因全 長啟動子SEQ ID NO :1。4、植物表達載體的構建和根癌農桿菌菌株EHA105(購于上海滬尚生物科技有限 公司以下相同)的轉化構建的重組載體是將質粒pBI121 (購于大連寶生物工程有限公司以下相同)上的 35S啟動子用前期克隆得到的目的基因的啟動子片段替換而來。為完成此目的，首先用Xba I/Hind III雙酶切克隆載體pMD18-X(前面已述)的啟動子片段，同時用Xba I/Hind III 酶切pBI121(前面已述)質粒。酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之后，用 瓊脂糖膠電泳檢測。將克隆載體上切下的小片段和PBI121(前面已述)上切下的大片段用 DNA凝膠回收試劑盒回收。按各pMD18-X(前面已述)上的啟動子片段片段pBI121(前 面已述)載體(150ng缺失片段、50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣 品，加入T4 DNA連接酶5單位，10 X反應緩沖液，無菌水補充體積至20 μ L，16°C連接過夜。 轉化后，在Kan平板上篩選，挑斑做菌落PCR，以及提質粒，酶切驗證正確的重組質粒命名為 PBI121-X.然后利用凍融法將pBI121-X(前面已述)和pBI121 (陽性對照)轉入根癌農桿 菌EHA105 (前面已述)，Km+Rif抗性平板篩選，挑斑，菌落PCR檢測驗證。
5、擬南芥的遺傳轉化及轉基因植株篩選參照文獻中的方法進行擬南芥轉化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using thefloral dip method. Nature,2006, 1 :1-6)。制備含有構建好的載體的根癌農桿菌EHA105(購自大連寶生物生物制品公司)菌 液，在轉化前一天轉入含有卡那霉素50μ g/ml、利福平50μ g/ml的LB大瓶培養基中，28 °C 過夜培養。第二天，當菌液濃度為1.6-2.0之間時取出。4000g室溫(20-25°C以下相同) 離心lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5% (質量體積比，以下相同)蔗糖中。將渾濁的 蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉化前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet 1-77。混 勻后把待轉化的擬南芥的整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15s，取出植株。同一個載體 用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑料袋揭開，放在光強的地方培養。隔 一周再做一次轉化。培養一個月左右收獲種子，在培養箱或者日光下干燥3-5天。將轉化 收獲的TO代種子用70% (體積比)酒精和0. 01% (體積比)的升汞表面消毒后用蒸餾水 洗滌數次(5 7次)，然后均勻地吹打到IAMSG^蔗糖，0. 8%瓊脂，pH 5. 8，大量元素減 半，其余營養成分與MS培養基相同)固體篩選培養基表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養 箱培養。根據表達載體上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時，取少 許綠苗葉片進行PCR陽性檢測。所用試劑配方如下(I)LB液體培養基分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉依次溶解于蒸餾水中，定 容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高壓消毒15分鐘。4°C 冷藏備用。(2) LB固體培養基分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸 餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6.859X104Pa下高壓消毒15 分鐘。4°C冷藏備用。(3) 1/2MS固體篩選培養基硝酸銨(NH4NO3)硝酸鉀磷酸二氫鉀硫酸鎂氯化鈣蔗糖瓊脂加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5 分裝到500ml三角瓶(250ml/瓶)，封口滅菌。6、啟動子功能分析用GL2基因啟動子GP2替換pBI121(前面已述)質粒上的35S啟動子序列，形成 pBI121-GP2(前面已述)重組植物表達載體，其中的⑶S基因受BnGL2啟動子的調控。利用 根癌農桿菌EHA105(前面已述)介導的花序侵染法轉化擬南芥。Tl代利用卡那霉素抗性和
8
1. 65g 1.9g 0. 17g 0. 37g 0. 44g 30g 8g
，煮沸(100°C)并定容至1000ml，PCR檢測篩選得到陽性植株。將PCR驗證是陽性的Tl代轉基因植株種子在1/2MS (前面已述)培養基上播種， 4°C春化后在生長箱中萌發，出苗后5-7天開始取樣染色。染色過程如下將樣品浸泡在GUS 染液(X-gluc 0. 5mg/mL，磷酸緩沖液50mmol/L，鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀各0. 5mmol/L，EDTA 10mmol/L, Triton-χ-ΙΟΟ 0. 001% (體積比)，甲醇20% (體積比)真空抽氣5分鐘，37°C 過夜。第二天用酒精-乙酸(體積比為1 1)進行脫色，直至葉片變白，之后用蒸餾水漂 洗數次(5 7次)，體式顯微鏡(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同時間段的整個植株； 生殖生長期，葉片取嫩葉和成熟葉片；花取開過的花朵和未開的花蕾的花序；角果取不同 時期的角果；種子去開花后10天左右的種子。植株被染成藍色的部位就是GUS基因表達的 部位。通過檢測不同時空下GUS基因的表達部位和表達強度來探索各目的啟動子的時空表 達模式，從而分析調空基因在特定部位表達的功能作用元件。T2代轉基因植株GUS組織化學染色結果表明，油菜BnGL2啟動子具有如下生物學 功能全長啟動子GP2在不同組織中均有表達，在葉片表皮毛和開花后10天左右的種子中 表達量最高(圖5，GP2)。這就預示著在BnGL2全長啟動子的啟動下，基因主要在毛狀體 發育和種子成熟過程中發揮作用。缺失啟動子GP2C(1555 2882)能調控⑶S基因主要 在苗期根部和葉脈中活躍表達，而在種子中沒有表達(圖5GP2C)，因此推斷該啟動子主要 參與根的發育和營養輸送的功能。缺失啟動子GP2D能調控GUS基因在中柱葉脈和幼嫩的 葉片表皮毛中表達(圖5GP2D)，但在種子中沒有檢測到⑶基因的活性(圖5GP2D)，因此 GP2D(2098 2882)啟動的基因主要在輸送營養和表皮毛發育中扮演角色。也就是說GP2 D啟動的基因的功能在輸送營養和表皮毛發育中扮演主要角色。一種甘藍型油菜BnGL2基因全長啟動子SEQ ID NO :1在葉片表皮毛以及種子中 功能性表達的應用過程是利用基因組步移法克隆得到甘藍型油菜GL2基因的5'上游序 列，經啟動子核心元件和上游順式作用元件用啟動子預測軟件http://WWW. fruitfly. org/ seq—tools/promoter. html 禾口 PIJVCE(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE)database (J). NucleicAcids Research. 1999,27 297 300)http:// www. dna. affrc. go. jp/PLACE/進行預測。得到可能的核心啟動子序列和上游啟動子元件。 根據分析預測結果，確定BnGL2啟動子序列長度。構建由該啟動子調控的報告基因GUS的 植物表達載體PBI121-GP2 (前面已述)。采用農桿菌EHA105介導的花期侵染法轉化擬南芥 (前面已述)Tl代在加有卡那霉素的1/2MS(前面已述)培養基上初步篩選轉基因植株，待 生長到一定階段(播種后一個月)進行PCR檢測，利用分子手段鑒定陽性株。T2代選擇多 個轉基因株系進行GUS染色。GUS組織化學法染色表明，BnGL2調控下的GUS基因具有一定 時空表達特性，主要在擬南芥的幼嫩組織中表達，如幼嫩葉片的早期表皮毛以及開花后10 天左右的種子。這說明GL2全長啟動子具有驅動下游報告基因GUS在受體植物中表達(圖 5)的功能。在該啟動子的調控下，GUS基因能夠主要在轉基因植株的幼嫩組織如根尖、葉原 基、發育早期的表皮毛以及開花后10天左右的種子中精細表達。一種甘藍型油菜BnGL2基因部分缺失啟動子SEQ ID NO 1 (2098 2882)在根 部以及整個葉脈中的應用過程是BnGL2啟動子的缺失序列(2098 2882)片段是以連有 GLABRA2全長啟動子的pMD18_T_GP2 (前面已述)載體為模板，依據BnGL2啟動子序列設計 特異性引物進行PCR擴增獲得，命名為GP2C。將GP2C與報告基因GUS相連構建植物表達載體PBI121-GP2C。用同樣方法轉化擬南芥，篩選轉基因植株。T2代取不同發育時期不同組 織進行GUS組織化學染色。GUS染色結果表明，BnGP2C啟動子調控制下的GUS基因在根部 的整個細胞高水平表達；在早期的所有葉脈中表達也較為強烈；但是在種子的整個成熟時 期都沒有表達。這說明BnGP2C啟動子具有啟動下游基因在根和早期葉脈等非種子組織中 表達的功能(圖5)，可以運用于轉基因安全(食用性安全)。一種甘藍型油菜BnGL2基因部分缺失啟動子SEQ ID NO :1 (1555 2882)在葉片 表皮毛以及中柱葉脈中的應用過程是BnGL2啟動子的缺失序列(1555 2882)片段是以 連有GLABRA2全長啟動子的(前面已述)18-T-GP2載體為模板，依據BnGLABRA2啟動子序 列設計特異性引物進行PCR擴增獲得，命名為GP2D。將GP2D與報告基因GUS相連構建植物 表達載體PBI121-GP2D (前面已述)。用同樣方法轉化擬南芥，篩選轉基因植株。T2代取不 同發育時期不同組織進行GUS組織化學染色。結果顯示，BnGP2D調控下的GUS基因的表達 部位以及強度又表現出它特有的形式主要在幼嫩的葉片表皮毛以及中柱葉脈中表達，這 說明BnGP2D啟動子具有啟動下游基因在幼嫩的葉片表皮毛以及中柱葉脈等中非種子組織 中表達的功能(圖5)，可以運用于轉基因安全(食用性安全)。本發明的優點1所提供的啟動子克隆方法能夠通過對GUS基因的調控和組化分析，獲得具有組 織特異性表達功能的油菜啟動子。2克隆到油菜來源的GL2基因的啟動子GP2，并人工構建了兩個組織特異性啟動 子GP2C和GP2D。從油菜食用油安全性來考慮，這三種啟動子具有應用潛力。GP2C在根部 的表達強度啟示申請人可以用此啟動子來代替CaMV35S強啟動子來啟動與根發育相關的 基因的表達，而不引起油菜轉基因食用安全問題。而GP2D和GP2啟動子在葉脈中的表達也 就預示著它們可調控與營養輸送相關的基因的功能分析，從而達到改良油菜品質目的，而 又不存在食用油安全風險。3克隆得到的甘藍型油菜GL2基因的啟動子能調控基因在油菜的毛狀體發育中 起作用。4人工構建得到油菜GL2缺失型啟動子，帶有2098 2882區段的啟動子GP2C包 含多個在根部和葉脈強烈表達的順式作用元件；帶有1555 2071區段的啟動子GP2D有調 控基因在葉片表皮毛中表達的應答元件。
圖1為一種基因組步移擴增BnGL2啟動子GP2片段電泳圖GL2A和GL2B是步移得到的兩個不同的BnGLABRA2基因上游序列圖2為一種油菜BnGL2啟動子的PCR擴增及重組載體pBI121_GP的酶切鑒定圖A圖PCR擴增GP2C、GP2D、GP2片段電泳圖B圖用Apa I/Hind III雙酶切重組載體鑒定3為一種轉基因植株PCR陽性鑒定圖M :DL2000 marker ；1 :pBI121_GP2D 陽性質粒；2、7、12 野生型擬南芥；3-5 PBI121-GP2D 陽性株；6 :pBI121_GP2 陽性質粒；8-10 :pBI121_GP2 陽性株；11 :pBI121_GP2C 陽性質粒；13-14 :pBI121-GP2C陽性株。
圖4為一種BnGL2啟動子序列生物信息學分析結果雙實線TATA-boX ；單實線CAAT-boX ；黑三角可能的TSS位點；黑箭頭翻譯起 始位點；黑框G-box ；灰框葉肉細胞組織特異性基因表達的順式作用元件.雙波浪線種 子中受赤霉素調控的蛋白激酶表達的應答元件。單波浪線遠距離調控啟動子活性的應答 元件。虛框在根特異性表達的應答元件。此外，用PLACE軟件分析發現在正負鏈上有1份 生長素應答元件，20多份MYB結合位點，1份茉莉酸(SA)誘導的應答元件，13份光誘導和組 織特異性表達的應答元件，26份MYB、BZIP、BHLH轉錄因子的結合位點。所有編號參照翻譯 起始位點。圖5為一種⑶S組織化學染色結果⑶S組織化學染色結果A 子葉期；B 真葉萌發期C 第一對真葉生長期；D 第二 對真葉生長期；E 輪座期；F 開花后10天左右的種子。
具體實施例方式實施例1.一種油菜BnGL2啟動子的制備步驟是1、油菜BnGL2基因啟動子GL2B的克隆利用SDS裂解法提取甘藍型油菜DNA(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等 譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社)，按照基因組步移試劑盒(購于Clontech 公司)操作程序，進行兩次基因組步移，每次步移擴增兩輪PCR克隆油菜GL2基因啟動子 GL2B(2882bp)。兩次步移所用引物如下表。表1基因組步移克隆甘藍型油菜GL2基因啟動子GP2所用引物
步移步驟引物名稱引物序列
一次步移 第一輪 PCR APl5-GTMTACGACTCACTATAGGGC-3
GSPl (1) 5-CTGCCGGAGGATGCATTCCGMATATC-3 第二輪 PCR AP25-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3
GSP2⑴ 5-GAGGGAGAGGGCTGGAGAGGAGAAGAAGTC-3 二次步移 第一輪 PCR APl5-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3
GSPl (2) 5-TTCAAACAAC ATCCAAGAAT CTTGCGTATA-3 第二輪 PCR AP25-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3
GSP2(2) 5-ATTGTGAAGGCCGGAGAAGA GTTGTTG-32、油菜GL2啟動子GL2B序列的生物信息學分析利用BLASTN比對擬南芥GL2基因啟動子序列(約2Kb) (GenBank登錄號 NM_106633)和油菜GL2基因的啟動子GL2B序列，發現二者同源性很低，只有四個片段一致 性在90%左右。通過在線軟件
http//www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html 預測發現其中起始密碼 子上游2. 2Kb的序列已具有啟動子的基本特征。包含有預測到的可能的轉錄起始位點，通 過PLACE軟件預測分析的可能的核心啟動子元件和順式作用元件。預測結果還發現其正 負鏈上有多處光、茉莉酸(SA)誘導和組織特異性表達的應答元件，存在26個MYB、BZIP、 BHLH(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNAelements(PLACE)database (J). Nucleic Acids Research. 1999，27 :297 300)轉錄因子的結合位點。因此本發明以此 2. 2Kb的序列，將其命名為GP2，作為GL2基因全長啟動子GP2進行功能和應用研究。3、油菜GL2基因啟動子全長和缺失片段(GP2和GP2C、GP2D)的擴增和 pMD18-T-GP2(前面已述)和pMD18_T_GP2C (前面已述)、pMD18_T_GP2D (前面已述)載體 的構建根據前期克隆得到的序列信息，設計擴增全長和缺失的引物(加入Xba I和Hind III酶切位點)，以油菜基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應為25 μ L體系1 XPCR buffer, MgCI 2. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L、引物濃度為 0. 5mol/L, Pfu 酶 1. 5 單位，模板約 lOOng，補 ddH20 至 25uL。反應條件95°C預變性 5min，94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 3min 擴增 33個循環，72°C延伸IOmin0表2全長啟動子和缺失啟動子片段模式和引物設計
啟動子片段名稱各片段模式圖引物序列
GP2C(0.9 Kb) bbhh^^5-GACA tc iag-aACGCTCCGAAATCTTAATTTG-3
5-ChGaagc tiTGAGTCTATCCCAGTATCTAACAGTCA-3 GP2D (1. 4 Kb) ββββ·^^ 5-GACA tc ia卵ACGCTCCGAMTCTTAATTTG-3
b-CkQaagc t iTCTTCTCCGGCCTTCACM-3 GP2(2. 2Kb) ββΒβββ^β^^ 5-GACA tcia^aACGCTCCGAAATCTTAATTTG-3
5-CAGaa^ciiTTCCTTCCCTACACCTTCCTCTA-3按照操作程序中的方法用將回收的各啟動子片段與pMDIS-T(前面已述)載體按 照(0.3pmol缺失片段0. Ipmol載體片段)=3 1的比例進行連接反應。凍融法轉 化大腸桿菌(前面已述)gold (前面已述)感受態細胞中。涂布于含有氨芐青霉素50mg/ L(質量體積比，下面相同)的LB固體平板上，37 °C培養過夜。小量堿法提取質粒(前面已 述)，Hind ΙΙΙ/Xba I酶切質粒1 μ g，瓊脂糖凝膠檢測。檢測正確的陽性重組克隆，將 pMD18-GP2(前面已述)和pMD18-GP2X(前面已述)進行序列測定，分析結果。一種分離的 啟動子，其序列為SEQ ID NO :1所示的基因啟動子。4、油菜GL2基因啟動子GP2各片段重組表達載體的構建及根癌農桿菌轉化用Xba I/Hind III雙酶切連接有GL2啟動子GP2的pMD18_GP2 (前面已述)和 pBI121(前面已述)質粒。凝膠回收酶切下來的各個啟動子片段和pBI121(前面已述) 片段，T4DNA連接酶16°C過夜連接這兩個片段，構建成植物表達載體pBI121-GP2(前面已 述)和pBI121-GP2X(X代表A-D)(前面已述)。最后用凍融法將該載體轉入根癌農桿菌EHA105(前面已述)，卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L，質量體積比，下面相同)抗性平 板上挑選陽性克隆后，酶切驗證。5、擬南芥轉化及PCR檢測按照上述文獻(Zhang X R. et al. Agrobacterium-mediated trans format ionof Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1 :1-6)中轉化方 法轉化擬南芥。根據轉基因植株所特有的卡那霉素抗性在1/2MS(前面已述)培養基上為 綠苗的初步認為是陽性苗。待葉片長到足夠大時取少許做PCR陽性鑒定。結果表明在三 個表達載體已經成功轉入擬南芥。pBI121-GP2(前面已述)、pBI121-GP2C(前面已述)、 PBI121-GP2D (前面已述)分別得到6、5、10株陽性苗。所用試劑配方如下(I)LB液體培養基分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉依次溶解于蒸餾水中，定 容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高壓消毒15分鐘。4°C 冷藏備用。(2) LB固體培養基分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸 餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6.859X104Pa下高壓消毒15 分鐘。4°C冷藏備用。(3) 1/2MS固體篩選培養基硝酸銨(NH4NO3)1. 65g硝酸鉀1. 9g磷酸二氫鉀0. 17g硫酸鎂0. 37g氯化鈣0. 44g蔗糖30g瓊脂8g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 8，煮沸(100°C )并定容至1000ml， 分裝到500ml三角瓶(250ml/瓶)，封口滅菌。6、油菜GL2基因啟動子功能分析本發明首次克隆得到甘藍型油菜GLABRA2基因的啟動子GP2序列，并對其進行一 系列缺失片段進行功能分析。從實施案例1. 5中篩選得到陽性苗Tl代，自交收獲種子(即T2代)。T2代取 多個株系的不同時期組織進行GUS染色。染色過程如下將樣品浸泡在GUS染液(X-gluc 0. 5mg/mL,磷酸緩沖液50mmol/L，鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀各0. 5mmol/L, EDTA 10mmol/L, Triton-x-1000.001 %，甲醇20% (體積比)真空抽氣5分鐘，37 °C過夜。第二天用酒 精-乙酸(體積比為1 1)進行脫色，直至葉片變白，之后用蒸餾水漂洗數次，體式顯微鏡 (OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同時間段的整個植株；生殖生長期，葉片取嫩葉和成熟葉 片；花取開過的花朵和未開的花蕾的花序；角果取不同時期的角果；種子去開花后10天左 右的種子。植株被染成藍色的部位就是⑶S基因表達的部位。
染色結果發現，三個啟動子序列都可以啟動⑶S基因的表達，并呈現出不同的組 織偏好性。全長啟動子GP2在整個生長時期都具有⑶S活性。主要集中在擬南芥的幼嫩組 織中表達。如早期的子葉、葉原基、葉片、根尖、莖以及開花后10天左右的種子中都有不同 程度的⑶S活性(表三)。缺失啟動子GP2C中包含GL2基因5'上游序列近800bp的序列， GUS染色表明該序列也可以啟動GUS基因表達。表達的部位重要在苗期的整個根部組織， 其強度等同于陽性對照35S啟動子調控下的GUS基因的表達。另外在幼嫩的子葉、真葉的 葉脈中也有較強表達，但隨植株發育成熟，在成熟的葉片以及其他組織中中不再檢測到GUS 的活性(表四)。缺失啟動子GP2D中包含了 GL2基因5'上游序列近1. 4Kb的序列。在此 片段的調控下GUS基因在苗期的子葉、真葉、根部同樣有GUS表達，而且種子中也沒有檢測 到⑶S的活性(表五)。但是與GP2C的表達情況相比，GP2D在根部的表達更為精細，后者 主要集中在根尖表達，而且在葉脈中的表達也只集中在中柱葉脈。實驗結果表明，油菜BnGL2啟動子具有如下生物學功能全長啟動子GP2在不同組 織中均有表達，在葉片表皮毛和開花后10天左右的種子中表達量最高(圖5，GP2 ；表三)。 這就預示著在BnGL2全長啟動子的啟動下，基因主要在毛狀體發育和種子成熟過程中發揮 作用。而在缺失啟動子GP2C調控下GUS基因主要活躍在苗期根部和葉脈中，而在種子中沒 有表達(圖5 GP2C，表四)。因此推斷該啟動子的調控下的基因主要參與根的發育和營養 輸送的功能。GP2D啟動子調控下的⑶S基因主要在中柱葉脈和幼嫩的葉片表皮毛中表達， 但在種子中沒有檢測到GUS基因的活性(圖5 GP2D，表五)，因此GP2D啟動的基因的功能 主要在輸送營養和表皮毛發育中扮演角色。本發明首次克隆得到甘藍型油菜BnGL2基因的啟動子GP2序列，并對其進行一系 列缺失片段進行功能分析。申請人感興趣的是GP2、缺失片段GP2C、缺失片段GP2D這三個 啟動子的表達差異，尤其是缺失啟動子GP2C和GP2D的轉基因植株在種子的整個發育時期 都沒有檢測到活性。表三、GL2全產啟動子GP2轉基因T2代株系的⑶S染色統計表
權利要求
1.一種分離的啟動子，其序列為SEQ ID NO :1所示的基因啟動子。
2.權利要求1所述的一種甘藍型油菜GL2啟動子GP2的制備方法，其步驟是A、基因組步移克隆啟動子序列利用SDS裂解法提取基因組DNA，按照基因組步移試劑盒操作程序，進行基因組步移， 每次步移擴增兩輪PCR克隆油菜，具體步驟為提取基因組DNA 25 μ L，分別用核酸內切酶 Dra I.EcoR I.Pvu II和Stu I酶切，純化后加入接頭形成四個不同的基因組DNA庫，用作 首次基因組步移第一輪PCR模板，根據目的基因保守序列設計特異性引物GSPl與試劑盒 內上游接頭引物APl進行擴增，第二輪PCR以第一輪PCR產物的50倍稀釋液為模板，設計 引物GSP2和接頭引物ΑΡ2進行擴增，進行第二輪基因組步移，所有PCR反應均為50 μ L擴 增體系模板 1 μ L, dNTPs 0. 2mM，引物 0. 5mM, LA Taq 酶 1. 25U, 10 X LA-PCR buffer5 μ L, 補水至50 μ L，反應條件均為94°C預變性Imin ；98°C 10s，72°C 6min 7個循環；98°C 10s, 67°C 6min33個循環；72延伸lOmin，PCR產物經1. 0%質量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測， GelExtraction Kit純化回收后，連接到pMD18_T載體，轉化gold感受態細胞，挑取陽性克 隆，酶切驗證后測序，得到目的基因上游的側翼序列；B、啟動子序列生物信息學分析將所克隆序列用BLASTN進行同源比對，啟動子核心元件和上游順式作用元件用啟動 子預測軟件進行預測，得到核心啟動子序列和上游啟動子元件；C、全長啟動子、缺失啟動子的擴增以及pMDIS-T-GP載體的構建以基因組DNA為模板，根據得到的啟動子序列，設計擴增各缺失片段的引物進行PCR 擴增，所有引物的5'端含有Hind III酶切位點，3'端含有Xba I酶切位點，反應體系為 25 μ L 內含=IXPCR buffer.，MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L、引物濃度為 0. 5mol/L, Pfu酶1. 5單位，模板約lOOng，設置循環參數，PCR產物1. 0%質量體積比瓊脂糖凝膠檢測， 回收試劑盒回收各目的缺失片段，按各回收的缺失片段載體=3 1的比例混合樣品， 加入T4DNA連接酶5單位，IX反應緩沖液，無菌水補充體積至25ml，16°C過夜連接反應，凍 融法轉化大腸桿菌gold菌感受態細胞中，涂布于含有Amp的LB固體平板上，37°C培養過 夜，各挑選白斑三個，做菌落PCR檢測，將陽性重組子接種于含Amp 50 μ g/mL的液體LB培 養基，37°C 200r/min振蕩培養過夜，小量堿法提取質粒，Hind ΙΙΙ/Xba I酶切質粒1 μ g， 0. 8%質量體積比瓊脂糖凝膠檢測，檢測正確的陽性重組克隆，為pMDIS-X，以M13F/M13R為 引物M13 R5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，；M13R5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，，將 pMD18-X 進行序列測定，得到了一種甘藍型油菜BnGL2基因全長啟動子。
3.權利要求書1中所述一種甘藍型油菜BnGL2基因部分缺失啟動子SEQID NO :1在 根部中的應用。
4.權利要求書1中所述一種甘藍型油菜BnGL2基因部分缺失啟動子SEQID NO :1在 整個葉脈中的應用。
5.權利要求書1中所述甘藍型油菜BnGL2基因缺失啟動子SEQID NO=I在葉片表皮 毛中的應用。
6.權利要求書1中所述甘藍型油菜BnGL2基因缺失啟動子SEQID NO=I在中柱葉脈 中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種甘藍型油菜BnGLABRA2啟動子及制備方法和應用，其步驟是A、基因組步移克隆啟動子序列利用SDS裂解法提取基因組DNA，進行基因組步移，每次步移擴增兩輪PCR克隆油菜。B、啟動子序列生物信息學分析將所克隆序列用BLASTN進行同源比對。啟動子核心元件和上游順式作用元件用啟動子預測軟件，得到啟動子序列和上游啟動子元件；C、全長啟動子、缺失啟動子的擴增以及pMD18-T-GP載體的構建以基因組DNA為模板，根據前期得到的啟動子序列，設計擴增各缺失片段的引物進行PCR擴增。一種甘藍型油菜BnGL2基因全長啟動子SEQ ID NO1在葉片表皮毛、種子、根部、整個葉脈、中柱葉脈中的應用，操作簡單，結果穩定可靠。具有生物安全性和開發應用價值。
文檔編號C12N15/82GK102102099SQ20091027332
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月18日 優先權日2009年12月18日
發明者劉勝毅, 劉越英, 柴國華, 白澤濤, 董彩華, 黃軍艷 申請人:中國農業科學院油料作物研究所