專利名稱：表現出纖維素水解活性的絲狀真菌培養產物的混合物或其干品以及使用其生產葡萄糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種糖化纖維素的方法，特別涉及使用表現出纖維素水解活性的絲狀 真菌培養產物的混合物糖化纖維素的方法。
背景技術：
近來，為了有效地利用纖維素資源，一直在尋找有效糖化纖維素的方法。在自然界 中，纖維素主要由微生物降解，并且已知多種微生物如細菌和絲狀真菌產生纖維素水解酶。這些微生物向真菌體外分泌多種纖維素水解酶，并且纖維素主要通過纖維_寡糖 和纖維二糖經由具有不同作用機制的多種纖維素水解酶的協同作用而降解為葡萄糖。纖維 素水解酶通常稱為纖維素酶，作為可以水解纖維素的酶類的總稱。木霉屬(Trichoderma)是纖維素酶最有希望的酶來源，并且在世界范圍內廣泛應 用。同時，白曲霉(Aspergillus kawachii)是一種白色曲霉，其是在日本用于制備清酒的 特有曲霉。白曲霉廣泛用于谷類原料的糖化。然而，白曲霉不具有特別好的纖維素酶分泌 能力，因此其很少用于纖維素的糖化。非專利文獻1記述了由于使用棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)培養物上清液 與商購的纖維素酶降解纖維素，在降解效率中鑒定到協同作用。非專利文獻2記述了通過使用來源于木霉屬真菌體的纖維素酶與來源于棘孢曲 霉的纖維素酶組合，鑒定到由纖維素純化單糖能力中的協同作用。然而，棘孢曲霉本質上不同于白曲霉，因為其固有地具有高的生產和分泌纖維素 酶的能力。在這些常規技術領域中，使用酶試劑，導致高成本和不方便的操作。此外，所報 道的降解和糖化效率非常低，低于可以在大規模操作上預測得到利潤的效率水平，因此，當 意欲進行實際應用時，所報道的效率仍然是不充分的。[非專利文獻1] J. Ferment. Technol.(發酵技術雜志)，卷 57，第 151-159 頁，1979[非專利文獻 2]Hakkokogaku，卷 60，第 333-341 頁，1982發明公開內容本發明要解決的問題本發明意欲解決上述傳統問題，并且本發明的目的是提供一種以非常有效、簡單 且廉價的方式酶促糖化纖維素質物質的方法。解決問題的方式本發明提供木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液和白曲霉培養產物的混合物、或其 干品，其表現出纖維素水解活性，由此實現上述目的。在實施方案中，白曲霉的培養產物是培養液或上清液。在實施方案中，白曲霉的培養產物是固體培養產物或其提取液。在實施方案中，所述木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液的纖維素酶活性不小于 50U/ml，并且白曲霉培養液、上清液或固體培養產物提取液的半纖維素酶活性不小于50U/ml ο在實施方案中，所述木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液與所述白曲霉培養液、上 清液或固體培養產物提取液的混合比例按體積比在10 90-90 10范圍內。在實施方案中，所述木霉屬絲狀真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木 霉(Trichoderma viride)。在實施方案中，所述木霉屬絲狀真菌是里氏木霉。本發明還提供一種生產葡萄糖的方法，所述方法包括使用所述混合物或其干品糖 化纖維素原料的步驟。在實施方案中，糖化在30_70°C和pH 3-7的條件下進行。發明效果本發明所述的絲狀真菌培養產物的混合物具有顯著高的纖維素降解和糖化能力。 因此，其可以原樣用于纖維素的糖化，并且因此不存在使用酶試劑的需要。因此，纖維素可 以通過簡單的操作被廉價地糖化。實施本發明的最佳實施方案已知木霉屬絲狀真菌是纖維素糖化必需的纖維素酶的酶來源。本發明中要用的木 霉屬絲狀真菌沒有特別限制，只要其可以產生纖維素酶即可。優選的木霉屬絲狀真菌是里 氏木霉或綠色木霉。特別優選的是里氏木霉。當木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液與白曲霉培養產物組合使用時，在纖維素水 解活性中鑒定到協同作用。通過利用該協同作用，可以顯著提高絲狀真菌培養液或上清液 的纖維素降解和糖化能力。絲狀真菌里氏木霉和綠色木霉的真菌特性記述在，例如，E. G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress (第二屆國際真菌學會議)，Tampa, FL,美國，1977 年8月，第618頁中。木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液可以通過常規進行的方法制備。即，將通過預 先培養獲得的真菌菌株的孢子、菌絲、或預培養液接種到液體培養基中并進行培養。例如， 當培養孢子時，優選將親本菌株培養在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，以允許孢子提前完全 形成。在上述情形中，培養溫度為20-33°C，并且培養時間為4-10天。粉末纖維素、纖維二糖、濾紙、一般的紙材料、鋸屑、麩、谷殼、蔗渣、大豆粗粉、咖 啡研磨物、淀粉、乳糖等用作培養基的碳源。無機銨鹽如硫酸銨和硝酸銨、有機含氮物 質如尿素、氨基酸、肉提取物、酵母提取物、聚蛋白胨和蛋白降解產物用作氮源。KH2PO4, MgSO4 · 7H20, CaCl2 · 2H20, Fe2Cl3 · 6H20, MnCl2 · 4H20, ZnSO4 · 7H20 等用作無機鹽。如果需 要，使用包含有機微量營養素的培養基。使用上述培養基，使用正常的通風-攪拌型培養裝置，在20_33°C，優選28_30°C的 培養溫度下，在4-6的培養pH下進行液體培養4-10天。如上文所述，獲得木霉屬絲狀真菌 的培養液。然后，通過公知方法如離心或過濾從該培養液中去除真菌體，獲得木霉屬絲狀真 菌的培養物上清液。在木霉屬種屬絲狀真菌的培養液或培養上清液中包含的酶的實例包括纖維素酶、 半纖維素酶、和甘露聚糖酶(marmanase)。這樣獲得的培養液或培養物上清液的纖維素酶活性不小于10U/ml，優選不小于50U/ml，例如，50-150U/ml，80-120U/ml，更優選約100U/ml。當培養液或培養物上清液的纖 維素酶活性小于10U/ml時，降解纖維素所需要的時間將延長。應該注意到，上述纖維素酶活性可以通過二硝基水楊酸(DNS)法定量由底物水解 產生的還原糖的量而獲得，所述底物為羧甲基纖維素(CMC)。更具體地，向Iml 1% CMC底物溶液(通過將Sigma-Aldrich，Inc.(西格瑪-奧 德里奇公司)制備的“低粘度”溶解在IOOmM乙酸緩沖液(pH 5)中制備)中加入Iml所述 培養液或培養物上清液，并且允許酶促反應在40°C下進行準確的10分鐘。隨后，向得到的 混合物中，加入4ml DNS試劑(包含0. 75%二硝基水楊酸，1. 2%氫氧化鈉，22. 5%酒石酸鉀 鈉四水合物，和0. 3%乳糖一水合物)，并且將混合物徹底混合以終止反應。為了定量在該 反應終止液中還原糖的量，將該反應終止液在沸水浴中準確加熱15分鐘。隨后，將混合物 冷卻至室溫，然后通過測量540nm處的吸光度而定量還原糖的量，所述還原糖對應于葡萄 糖。一單位的纖維素酶活性表示為每分鐘能夠產生與1 μ mol葡萄糖相當量的還原糖的酶 的量。白曲霉還稱為酒曲酶(koji mold)。其是一種從古代就用于釀造和生產發酵食品 的真菌，并且因此是一種安全的微生物。已知屬于曲霉種屬的微生物生產α-淀粉酶，并且 用于淀粉的糖化。絲狀真菌白曲霉的真菌特性記述在，例如，Koji_gaku，HideyaMURAKAMI編寫，1987 年3月25日，第78頁中。白曲霉的培養產物可以通過常規進行的方法制備。例如，白曲霉的培養產物可以 是通過固體培養獲得的固體培養產物，或可以是通過液體培養獲得的培養液或上清液。此 外，白曲霉的培養產物可以是固體培養產物提取液，其通過將固體培養產物浸沒在水、鹽水 等中以提取其成分，然后通過過濾等去除不溶成分如真菌體而獲得。應該注意到，考慮工業規模處理的便利性，白曲霉培養產物優選是培養液或上清 液。當進行白曲霉液體培養時，將通過預先培養獲得的真菌菌株的孢子、菌絲、或預培 養液接種到液體培養基中并進行培養。例如，當培養孢子時，優選將親本菌株培養在馬鈴薯 葡萄糖瓊脂培養基上，以允許孢子提前完全形成。在上述情形中，培養溫度為30-40°C，并且 培養時間為3-7天。可用的碳源優選為麥芽糖或淀粉，并且其適當的濃度為約2%。蛋白胨優選作為氮 源，并且其適當的濃度為約0.5%。此外，需要酵母提取物、玉米浸漬液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂 等。盡管上述碳源優選為麥芽糖或淀粉，除上述外，任何正常用于真菌的培養基是適用的。使用上述培養基，使用正常的通風_攪拌型培養裝置，在30_40°C，優選35-38°C的 培養溫度下，在4-6的培養pH下進行液體培養2-4天。如上所述，可以獲得白曲霉的培養 液。然后，通過公知方法如離心或過濾從該培養液中去除真菌體，而獲得白曲霉的培養物上 清液。當進行白曲霉固體培養時，將真菌菌株的孢子或菌絲接種到固體培養基上并且進 行培養。例如，當培養孢子時，優選將親本菌株培養在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，以允許 孢子提前完全形成。在上述情形中，培養溫度為30-40°C，并且培養時間為3-7天。除麩之外，可用的固體培養基優選為淀粉原料，其是谷類如大米、大麥、谷子(foxtail millet)和日本谷倉稷(Japanese barnyard millet)和豆類等。特別優選地，使用麩。對于固體培養，與生產用于清酒的酒曲的方法相似，使用在生產酒曲過程中利用 酒曲盤(tray)的方法和機械生產酒曲的裝置。將上述培養基蒸過，向其中接種真菌菌株， 并且在30-40°C，優選35-38°C的培養溫度下在4_6的培養pH下培養2_4天。如上所述，可 以獲得白曲霉的固體培養產物。隨后，將該培養產物浸沒在水中，以提取其成分，并且通過 過濾去除真菌體，由此獲得白曲霉的固體培養物濾過液。在白曲霉培養液、培養物上清液、固體培養產物或其提取液中包含的酶的實例包 括纖維素酶、半纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶、和蛋白酶。這樣獲得的培養液、培養物上清液或固體培養物提取液的半纖維素酶活性不小于 10U/ml，優選不小于 50U/ml，例如，50-150U/ml，80-120U/ml，更優選約 100U/ml。當培養液、 培養物上清液或固體培養物提取液的半纖維素酶活性小于10U/ml時，降解纖維素所需要 的時間將延長。應該注意到，上述半纖維素酶活性可以通過用DNS定量由底物的酶促水解產生 的還原糖的量并且觀察在540nm處光吸收的增加而獲得，所述底物為來源于燕麥(oat spelts)的木聚糖。更具體地，向1.9ml 木聚糖底物溶液(通過將Sigma-Aldrich，Inc.(西格 瑪_奧德里奇公司)供應的“來自燕麥的木聚糖”溶解在200mM乙酸緩沖液(pH 4. 5)中制 備)加入0. Iml所述培養液或培養物上清液，并且允許酶促反應在40°C下進行準確的10分 鐘。隨后，向得到的混合物中，加入4ml DNS試劑(包含0. 75%二硝基水楊酸，1. 2%氫氧化 鈉，22. 5%酒石酸鉀鈉四水合物，和0. 3%乳糖一水合物)，并且將混合物徹底混合以終止 反應。為了定量在該反應終止液中還原糖的量，將該反應終止液在沸水浴中準確加熱15分 鐘。隨后，將混合物冷卻至室溫，然后通過測量540nm處的吸光度而定量還原糖的量，所述 還原糖對應于木糖。一單位的半纖維素酶活性表示為在40°C 10分鐘的條件下每分鐘能夠 產生與1 μ mol木糖相當量的還原糖的酶的量。本發明表現出纖維素水解活性的混合物通過將木霉屬絲狀真菌的培養液或培養 物上清液與白曲霉培養產物混合獲得。培養液和培養物上清液均可以相似地用于制備本發 明的混合物。應該注意，制備培養液不需要去除真菌體的操作；因此，其制備方法簡單。同 時，在培養物上清液中基本上不存在真菌體；因此，上清液具有極好的儲存穩定性。對用于混合木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液和白曲霉培養產物的方法沒有特 別限制。例如，當白曲霉培養產物為固體培養產物時，所述固體培養產物可以按原樣添加到 木霉屬種屬絲狀真菌的培養液等中并且混合。備選地，所述固體培養產物提取液可以與木 霉屬絲狀真菌的培養液等混合。此外，例如，當白曲霉的培養產物為液體培養產物或上清液 時，白曲霉的培養產物可以直接和木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液混合。木霉屬絲狀真 菌的培養液和白曲霉培養產物可以分別在混合之前過濾，或者可以在混合之后過濾。木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液與白曲霉培養液、上清液、或固體培養物提 取液的混合比例按體積為，例如，10 90-90 10，優選為20 80-80 20，更優選為 30 70-70 30,40 60-60 40，甚至更優選為50 50。當混合比例小于10 90或 大于90 10時，纖維素的糖化效率將降低。此外，這樣獲得的混合物還可以作為干品提供，所述干品可以通過通常所用的方法如凍干制備。可以使用上述混合物降解和糖化纖維素原料。纖維素是指其中葡萄糖通過β_1， 4_糖苷鍵聚合的分子鏈或其衍生物(例如，進行衍生化諸如羧甲基化、醛修飾、或酯化的那 些，諸如羧甲基纖維素)，或其中多個上述分子鏈或其衍生物結合在一起的物質(諸如纖維 素纖維)。纖維素原料優選是包含纖維素的水不溶性纖維物質。纖維素原料可以來源于 植物或動物，產生纖維素原料的植物和動物的實例包括蔗渣(bagasse)、啤酒殘渣(beer residue)、木材、竹子、麥禾干(wheat straw)、禾S 草(rice straw)、玉米棒(corn cobs)、棉花 (cotton)、苧麻(ramie)、洋麻(kenaf)、甜菜(beet)、球蘭(hoya)、和細菌纖維素等。此外， 在本發明中，除了由上述植物和動物產生的天然纖維素物質之外，還可以使用再生的纖維 素物質和纖維素衍生物物質，再生的纖維素物質通過一次性化學或物理溶解或溶脹天然纖 維素物質，然后使其再生獲得，纖維素衍生物物質通過化學修飾纖維素原料獲得。對于工業應用，上述纖維素物質可以是任何天然的纖維素原料，諸如漿液、粉末纖 維素，和結晶纖維素，再生纖維素如人造纖維，各種再生的纖維素原料如堿性纖維素和磷酸 溶脹纖維素，和各種類型的纖維素衍生物物質如羧甲基纖維素鈉。然而，為了將所獲得的葡 萄糖用于藥物產品、食品、和化妝品，更優選地使用天然纖維素原料。在上述纖維素原料中， 其一種類型或其兩種或多種類型的混合物可以用作原料。可以利用公知的方法作為糖化纖維素的方法。盡管對方法沒有特別限制，但是其 一個實例是這樣的方法，所述方法包括將作為底物的纖維素原料混懸在水性介質中；向 其中加入上述混合物；并且在攪拌或搖動的條件下加熱所得到的混合物，以允許糖化反應 進行。除了上述表現出纖維素水解活性的混合物之外，可以使用其干品或包含分散或溶解 在其中的干品的溶液。纖維素原料優選地預先進行去木質作用。適當調整反應條件，如混懸方法、攪拌方 法、添加上述混合物的方法、添加的順序、和進行上述操作的濃度，從而以更高產率獲得葡 萄糖。在纖維素糖化中，反應液的pH和溫度可以設定在酶不失活這樣的范圍內。通常， 當在正常的壓力下進行反應時，溫度可以在30-70°C范圍內，pH可以在3-7的范圍內。此 外，與上述相似，壓力、溫度和PH也可以適當調整，從而以更高產率獲得葡萄糖。在乙酸或 磷酸緩沖液中在正常壓力下，糖化優選在50-60°C的溫度下和pH 4-6進行。反應時間通常 為6-147小時，優選為24-72小時。含葡萄糖的水溶液通過糖化葡萄糖獲得。需要時，這樣獲得的水溶液可以進行純 化處理，諸如脫色、脫鹽、和酶去除。盡管對純化方法沒有特別限制，只要其是公知的方法， 例如，可以使用過濾處理，諸如活性炭處理，離子交換樹脂處理，色譜處理，顯微過濾，超濾， 或反滲透性過濾，和結晶處理。上述處理可以單獨使用，或者其兩種以上可以組合使用。主要由通過上述方法純化的葡萄糖組成的水溶液可以按原樣使用，或者需要時， 通過干燥固化。盡管對干燥方法沒有特別限制，只要其是公知的方法，例如，可以使用噴霧 干燥、冷凍干燥、轉鼓式干燥、薄膜干燥、盤式干燥、氣流干燥(flash drying)、和真空干燥。 上述方法可以單獨使用，或者其兩種以上可以組合使用。實施例
7
本發明將參考下述實施例進行更具體地描述；然而，本發明并不限于這些實施例。實施例1里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在28°C培養7天， 以允許孢子完全形成。將1接種環的孢子接種在帶有擋板的500ml-ErIenmeyer培養 M Φ, ^ Φ # W π HH ^ ( S AsahikaseiChemicals Corporation (Asahikasei it ψ 公司)制備，商業名:Ceolus) :lg, KH2PO4 :0· 2g，(NH4)2SO4 :0· 14g，CaCl2 · 2H20 :0· 03g， MgSO4 · 7H20 :0. 03g，聚蛋白胨:0. 2g，酵母提取物:0· 05g,吐溫80 :0· 1ml，痕量的基本液體 (trace element liquid)(通過將 6mg H3BO4, 26mg (NH4) 6Mo7024 · 4H20，IOOmg FeCl3 · 6H20， 40mg CuSO4 · 5H20，8mg MnCl2 · 4H20，禾口 200mgZnS04 · 7H20 溶解并混懸在 100ml 水中獲得的 液體)0. Iml和水100ml，然后通過在28°C搖動培養7天。在第7天，過濾培養液，以獲得 上清液。這樣獲得的上清液的纖維素酶活性為50U/ml，其是通過上述方法測量的。同時，白曲霉(NBRC4308)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在37°C培養4天，以允許 孢子完全形成。將1接種環的孢子接種在帶有擋板的500ml-Erlenmeyer培養瓶中，其中包 含麥麩3g，K2HPO4 0. 5g，和水100ml，然后在37°C搖動培養3天。在第3天，過濾培養液， 以獲得上清液。這樣獲得的上清液的半纖維素酶活性為50U/ml，其是通過上述方法測量的。將要進行糖化的纖維素原料按照下述方法進行去木質作用。將啤酒殘渣、稻草、麥 稈、和蔗渣分別精細地研磨成粉，并且混懸在0. 3N NaOH中，在120°C處理15分鐘。然后，將 這樣得到的產物用水徹底洗滌，并且干燥。粉狀纖維素(由Nippon Paper Chemicals Co., Ltd.(日本造紙化學有限公司)制備，商品名KC flock ff-50)按原樣進行糖化。通過在50°C pH 4. 8搖動液體(3 %的纖維素原料液)24_48小時糖化纖維素原 料，所述液體由下列各項組成纖維素原料0. 3g，里氏木霉培養物上清液4. 75ml，白曲霉 培養物上清液4. 75ml，和IM乙酸緩沖液(pH 4. 8) 0. 2ml。然后，通過葡萄糖CII-檢測 Wako (ffako Pure Chemicalslndustries, Ltd. (Wako純化學工業有限公司))測量這樣生產 的葡萄糖。分別單獨使用里氏木霉培養物上清液9. 5ml和白曲霉培養物上清液9. 5ml替 換培養物上清液混合物作為對照。這樣得到的結果分別顯示在
圖1-5中。實施例2隨著改變里氏木霉培養物上清液與白曲霉培養物上清液的混合比例，比較糖化效 率。對于這些培養物上清液，使用以與實施例1相似的方式制備的那些。糖化通過在50°C pH 4. 8搖動這樣的液體(10%的蔗渣液)24小時進行，所述液 體由下列各項組成蔗渣lg，培養物上清液混合物8. 8ml，和IM乙酸緩沖液(pH 4.8) 0.2ml。然后，測量這樣生產的葡萄糖。這樣得到的結果顯示在圖6中。圖中水平軸顯示的 混合比例為體積比例。實施例3里氏木霉培養液和白曲霉培養液以與實施例1相似的方式獲得，不同的是不進行 過濾。然后，制備具有不同的培養液混合比例的各種混合物，并且比較糖化效率。糖化通過在50°CpH 4.8搖動這樣的液體(10%粉狀纖維素液體)24小時進行，所 述液體由粉狀纖維素(商品名KC flock) :lg，培養液混合物8.8ml，和IM乙酸緩沖液(pH4.8) :0.2ml組成。然后，測量這樣生產的葡萄糖。這樣得到的結果顯示在圖7中。圖中水 平軸顯示的混合比例為體積比例。實施例4隨著改變里氏木霉培養物上清液與白曲霉培養物上清液的混合比例，比較糖化效 率。對于這些培養物上清液，使用以與實施例1相似的方式制備的那些。糖化通過在50°C pH 4. 8搖動這樣的液體(3%的啤酒殘渣液體)24小時進行，所 述液體由啤酒殘渣0. 3g，培養物上清液混合物9. 5ml，和IM乙酸緩沖液(pH 4. 8) 0. 2ml 組成。然后，測量這樣生產的葡萄糖。這樣得到的結果顯示在圖8中。圖中水平軸顯示的 混合比例為體積比例。實施例5利用各種曲霉屬絲狀真菌的培養物上清液與里氏木霉培養物上清液組合，比較對 糖化效率的協同作用。對于里氏木霉培養物上清液，使用以與實施例1相似的方式制備的 那種。^^ (Aspergillus awamori), NBRC4388, M^M (Aspergillusniger), NBRC31125，佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)，ATCC11363，米曲霉(Aspergillus oryzae), RIB40，和棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，NBRC5330，分別在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養 基上在37°C培養4天，以允許孢子完全形成。將1接種環的每種孢子接種在帶有擋板的 500ml-Erlenmeyer培養瓶中，其中包含麥麩3g，K2HPO4 0. 5g，和水100ml，然后在37°C搖 動培養3天。在第3天，過濾每種培養液，以獲得上清液。通過在50°C pH 4. 8搖動液體(5%的粉狀纖維素液)24小時進行糖化，所述液體 由粉狀纖維素0. 5g，曲霉屬絲狀真菌的培養物上清液和里氏木霉培養物上清液的混合物 (混合比例為50 50) 9. 3ml，和IM乙酸緩沖液(pH 4.8) :0. 2ml組成。然后，測量這 樣生產的葡萄糖。分別單獨使用里氏木霉培養物上清液9. 3ml和曲霉屬的培養物上清液 9. 3ml替換培養物上清液混合物作為對照。這樣得到的結果顯示在圖9中。參照實施例1檢驗木霉屬來源的纖維素酶和白曲霉來源的纖維素酶的協同作用。分別將里氏木 霉來源的纖維素酶制劑(Sigma-Aldrich，Inc.(西格瑪-奧德里奇公司))和綠色木霉來源 的纖維素酶制劑(Sigma-Aldrich，Inc.(西格瑪-奧德里奇公司))溶解在水中，制成的 纖維素酶液體。通過在50°C pH 4. 8搖動由脫木素處理的蔗渣0. 5g，的纖維素酶液體 4. 65ml,白曲霉培養物上清液4. 65ml和IM乙酸緩沖液(pH 4. 8) 0. 2ml組成的液體(5% 的蔗渣液體)24小時進行糖化。然后，測量這樣生產的葡萄糖。對于白曲霉培養物上清液， 使用以與實施例1相似的方式制備的那種。分別單獨使用纖維素酶液體9. 3ml和白曲霉培養物上清液9. 3ml替換培養 物上清液混合物作為對照。這樣得到的結果顯示在圖10中。由上述獲得的實施例和參照實施例的結果可知，當木霉屬絲狀真菌的培養液或上 清液與白曲霉培養液或上清液組合使用時，鑒定到纖維素水解活性的協同作用，并且絲狀 真菌培養液或上清液的纖維素降解和糖化能力顯著提高。實施例6里氏木霉培養物上清液以與實施例1相似的方式獲得。
白曲霉(NBRC4308)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在37°C培養4天，以允許孢子 完全形成。將1接種環的孢子接種在培養基中，所述培養基通過將包含50g麩調整至含水 量為50%的培養皿在121°C高壓滅菌15分鐘獲得。然后，將孢子在36°C培養3天，以產生 固體培養產物。對于所述固體培養產物，以固體培養產物重量5倍的量加入0. 5%的鹽水。 在將所述固體培養產物靜置過夜后，過濾去除真菌體，由此獲得固體培養物濾過液。這樣獲得的固體培養物濾過液的半纖維素酶活性為90U/ml，這是通過上述方法測 量的。使要被糖化的纖維素原料按照下述方法進行去木質處理。將蔗渣塊分別精細研磨 成粉，并且混懸在0.3N NaOH中，并且在120°C處理15分鐘。隨后，將這樣得到的產物用水 徹底洗滌，并且干燥。粉狀纖維素(由NipponPaper Chemicals Co.，Ltd.(日本造紙化學 有限公司)制備，商品名KC flockff-50)按其原樣進行糖化。纖維素原料通過在50°C pH 4. 8搖動這樣的液體(6. 5%的纖維素原料液)24小時 進行糖化，所述液體由纖維素原料0. 65g，里氏木霉培養物上清液4. 6ml，白曲霉固體培 養物濾過液4. 6ml，和IM乙酸緩沖液(pH4. 8) 0. 2ml組成(培養物上清液與固體培養物濾 過液的體積比例為50%:50%)。然后，通過葡萄糖CII-檢測Wako (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd. (Wako純化學工業有限公司))測量這樣生產的葡萄糖。分別單獨使用 里氏木霉培養物上清液9. 2ml和白曲霉固體培養物濾過液9. 2ml替換上述混合物作為對 照。這樣得到的結果顯示在圖11中。圖中水平軸顯示的混合比例為體積比例。附圖簡述[圖1]圖1是生產的葡萄糖濃度相對于啤酒殘渣糖化反應時間繪制的圖。[圖2]圖2是生產的葡萄糖濃度相對于稻草糖化反應時間繪制的圖。[圖3]圖3是生產的葡萄糖濃度相對于麥稈糖化反應時間繪制的圖。[圖4]圖4是生產的葡萄糖濃度相對于蔗渣糖化反應時間繪制的圖。[圖5]圖5是生產的葡萄糖濃度相對于粉狀纖維素糖化反應時間繪制的圖。[圖6]圖6是比較改變里氏木霉培養物上清液和白曲霉培養物上清液的混合比例 對蔗渣進行糖化產生的葡萄糖濃度的圖。[圖7]圖7是比較改變里氏木霉培養液和白曲霉培養液的混合比例對粉狀纖維素 進行糖化產生的葡萄糖濃度的圖。[圖8]圖8是比較改變里氏木霉培養物上清液和白曲霉培養物上清液的混合比例 對啤酒殘渣進行糖化產生的葡萄糖濃度的圖。[圖9]圖9是比較使用各種類型的曲霉屬絲狀真菌的培養物上清液與里氏木霉培 養物上清液組合對粉狀纖維素進行糖化產生的葡萄糖濃度的圖。[圖10]圖10是比較使用包含來源于兩種木霉屬絲狀真菌的纖維素酶的液體與白 曲霉培養物上清液組合對粉狀纖維素進行糖化產生的葡萄糖濃度的圖。[圖11]圖11是顯示使用里氏木霉培養物上清液與白曲霉固體培養物濾過液組合 對纖維素原料進行糖化產生的葡萄糖濃度的圖。
權利要求
木霉屬(Trichoderma)絲狀真菌的培養液或上清液和白曲霉(Aspergillus kawachii)培養產物的混合物、或其干品，其表現出纖維素水解活性。
2.根據權利要求1所述的混合物或其干品，其中白曲霉培養產物是培養液或上清液。
3.根據權利要求1所述的混合物或其干品，其中白曲霉培養產物是固體培養產物或其 提取液。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的混合物或其干品，其中所述木霉屬絲狀真菌的培 養液或上清液的纖維素酶活性不小于50U/ml，并且白曲霉培養液、上清液或固體培養產物 提取液的半纖維素酶活性不小于50U/ml。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的混合物或其干品，其中所述木霉屬絲狀真菌的培 養液或上清液與所述白曲霉培養液、上清液或固體培養產物提取液的混合比例按體積比在 10 90-90 10 范圍內。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的混合物或其干品，其中所述木霉屬絲狀真菌是里 氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)。
7.根據權利要求1-5中任一項所述的混合物或其干品，其中所述木霉屬絲狀真菌是里 氏木霉。
8.—種生產葡萄糖的方法，其包括使用根據權利要求1-7中任一項所述的混合物或其 干品糖化纖維素原料的步驟。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述糖化在30-70°C和pH3_7的條件下進行。
全文摘要
本發明的目的是提供一種以非常有效、簡單且廉價的方式酶促糖化纖維素質物質的方法。該目的的溶液是表現出纖維素水解活性的混合物或其干品，其包含木霉屬絲狀真菌的培養液或上清液和白曲霉的培養產物。
文檔編號C12P19/02GK101981178SQ200980110856
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月27日 優先權日2008年3月28日
發明者福田和郎 申請人:朝日啤酒株式會社