專利名稱：胰島細胞的制備和移植的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及胰島移植領域，更具體地，涉及用于改進胰島細胞的分離、存活 能力及移植的新組合物及方法。
背景技術：
其背景與胰島細胞移植相關地描述，而不限制本發明的范圍。胰島細胞移植可以用于恢復胰島素產生及對I型(青少年)糖尿病的血糖控制。 當前的結果及毒性不能證明廣泛應用的合理性，然而在這兩者中的改進能夠使此項技術可 用于臨床(非試驗的)應用，并能夠使此成為優選及領先的I型糖尿病療法。在授權給Habener等人的美國專利No. 6，923，959中有一個這種方法，即在器官 移植之前，預先誘導免疫耐受性狀態的方法。簡單地說，描述了新鑒定的干細胞用于I型 胰島素依賴型糖尿病及其他癥狀的治療的組合物及方法，所述干細胞能夠分化成為多種胰 島細胞，包括產生胰島素的beta細胞以及肝細胞。巢蛋白已經被確認為胰島干細胞的分 子標記物，而細胞角蛋白-19充當明顯不同種類的胰島導管細胞的標記物。描述了這樣的 方法，其中巢蛋白陽性的干細胞可以從胰島中分離，并被培養以獲得進一步的干細胞或類 胰島樣結構(pseudo-islet like structures)。公開了胰腺干細胞的體外分化方法。描 述了方法，借助該方法可以分離、擴增胰腺干細胞并將其以異種(allogeneically)、同源 (isogeneically)或異基因(xenogenically)地移植到需要的患者中，以替代損失或損傷 的胰島素分泌細胞或其他細胞。另一種用于提高移植的組織存活能力的方法示于授權給Cochrum等人的美國專 利No. 5，578，314中，其公開了用于移植的生物組織的多層藻酸鹽覆蓋物。簡單地說，示教 了用于移植的生物組織及細胞的多層覆蓋物的方法，在該方法中所述細胞或組織移植物使 用純化的藻酸鹽多重覆蓋物包被。該方法包括施加與二價陽離子形成凝膠的藻酸鈉第一包 被，隨后可選地使用鍶、鋇或其他二價陽離子處理，使藻酸鈉中單層覆蓋的液滴再懸浮，并 在第一覆蓋物周圍通過二價陽離子從單層的覆蓋物到周圍可溶的藻酸鹽的交換或擴散而 形成鹵素層，除去多余的覆蓋物及使得剩余的可溶藻酸鹽與二價陽離子形成凝膠。包覆的 移植物具有不同的結構，其生物組織或細胞核心被第一藻酸鹽包覆所覆蓋，所述包覆被中 間的鹵素層包圍，該鹵素層被外側覆蓋物所覆蓋。Goto等人遞交的美國專利申請No. 20080009061涉及保存胰島的方法，保存胰島 的容器以及用于移植胰島的試劑盒。簡單地說，所述用于保存胰島的方法包括用于保存胰 島的容器及用于移植胰島的試劑盒，以有效地保存胰島。Brand等人遞交的美國專利申請No. 20060189520涉及糖尿病使用組合物的療法， 并提供了胰島再生療法的方法，所述療法包括一組因子的成員，該因子補充胃泌素/CCK受 體配體，使用制劑、設備及方法以持久釋放遞送，并局部遞送到靶器官。發明概述本發明用于改善胰島異種移植的效果，具體地通過(a)通過給予阿那白滯素 (Anakinra)(重組的人白細胞介素_1受體拮抗劑，例如，Kinert )阻斷白細胞介素_1在
4移植物移入期的激活，保護接收者免受炎癥導致的胰島損壞，(b)通過ET-Kyoto溶液的導 管注射，增加從供體胰腺得到的胰島的收率，和/或(c)在胰腺消化期間，通過使用胰蛋白 酶抑制劑進行胰蛋白酶抑制作用，來增加從供體胰腺得到的胰島的收率。更具體地，本發明包括制備可移植的胰島制備物(pr印aration)的組合物和方 法，所述方法包括，獲得供體胰腺；向胰腺導管注射ET-Kyoto溶液或其等價物；分離胰腺 β-胰島細胞；并使用人類白細胞介素-1拮抗劑在胰島移植時處理患者。在一個實施方案 中，其中所述胰腺β-胰島細胞使用合適的膠原蛋白酶處理，例如，人類膠原蛋白酶。在一 個具體的實施例中，胰島在其從胰腺中提取之后，在ET-Kyoto溶液中處理。在一個方面，人 類白細胞介素-1拮抗劑選自白細胞介素-lbetadL-Ιβ)基因轉錄的一種或多種改性劑； IL-I β基因翻譯的一種或多種改性劑；靶向IL-I β表達的一種或多種siRNA ；—種或多種 IL-I β受體阻斷劑；一種或多種白細胞介素-1受體拮抗劑蛋白質；一種或多種白細胞介 素-1受體拮抗劑肽；改變IL-I β的釋放的一種或多種活性劑；中和IL-I β的一種或多種 抗體；阻斷IL-I β受體的一種或多種抗體；一種或多種重組的、天然產生的IL-I β受體拮 抗劑；一種或多種陰離子運輸抑制劑、脂氧素及α “生育酚，其抑制IL-I β的釋放；一種或 多種鴉片樣物質，其抑制蛋白水解酶，所述蛋白水解酶將無活性的IL-I β前體轉化為其成 熟的、有活性的形式；中和IL-I β的生物功能的一種或多種抗體，及其混合物和組合物。在 一個具體的實施例中，所述IL-I β拮抗劑為阿那白滯素。該方法可以進一步包括同時向患 者提供腫瘤壞死因子拮抗劑，所述拮抗劑選自基因轉錄的抑制劑、滅活的腫瘤壞死因子、腫 瘤壞死因子受體阻斷劑及可溶的腫瘤壞死因子受體。本發明的另一個方面為制備可移植的胰島制備物的方法，所述方法包括步驟獲 得供體胰腺；向胰腺導管注射ET-Kyoto溶液或其等價物；在胰蛋白酶抑制劑存在下從獲 得的胰腺中分離胰腺β “胰島細胞；并使用人類白細胞介素-ι拮抗劑在胰島移植時處理 患者。胰蛋白酶抑制劑的實例包括血清α-1抗胰蛋白酶、利馬豆胰蛋白酶抑制劑、庫尼茲 (Kunitz)抑制劑、卵類粘蛋白抑制劑或大豆抑制劑。本發明的另一個實施方案為制備可移植的胰島制備物的方法，通過獲得供體胰 腺；在胰蛋白酶抑制劑存在下從獲得的胰腺中分離胰腺β-胰島細胞分離胰腺β-胰島細 胞；并使用人類白細胞介素-1拮抗劑及腫瘤壞死因子拮抗劑在胰島移植時處理患者。附圖簡要說明為了更完全地理解本發明的特征和優點，參考本發明的詳細描述以及附圖進行說 明，其中
圖1顯示導管注射組(DI)及標準組(標準)中純化前后的胰島收率。DI組在胰 島純化前后的胰島收率均顯著地更高。圖2顯示DI組中三個患者在胰島移植前后的空腹血糖值。所有患者在胰島移植 后改善了血糖控制。圖3顯示了 DI組中三個患者在胰島移植前后的日常胰島素劑量。所有三個患者 變得不依賴胰島素。發明詳述雖然在下文詳述了本發明的不同實施例的制備和使用，應該意識到本發明提供多 種可行的發明構思，該構思可以在多種具體環境下具體化。此處討論的具體的實施例僅僅為了說明制造并使用本發明的具體方法，而非限制本發明的范圍。
為了減輕本發明理解上的困難，多個術語定義于下文。此處定義的術語具有本發 明相關領域普通技術人員所熟知的含義。術語如“一個(a) ”，“一個(an) ”，“該(the)，，不 期待僅指單數的個體，而包括具體實例可能用作說明的一般的類別。該術語在此用于描述 本發明的具體實施例，但其使用并不限制本發明，除非在權利要求中指出。
縮寫列表
佳
2-D ABO
AE
AIDS ALT ANC AST BCC BUMC BUN CBC CFR CMP CRF DL DM DRI
EBV 愛潑斯坦-巴爾病毒 EU 內毒素單位 FDA 食品與藥物管理局 Fr 法國的 G 厚度 g 克
GFR 腎小球濾過率 Glofil 碘酞GFR評價 Hb血紅蛋白
HbAlc 血紅蛋白 HBsAg B型肝炎表面抗體 HBV B型肝炎病毒 HCV C型肝炎病毒 Hg萊
HIV 人類免疫缺陷病毒 HLA 人類白細胞抗體
血型系統(A，B, AB及0) 不良事件
獲得性免疫缺陷綜合征 丙氨酸轉氨酶 嗜中性細胞絕對計數 天冬氨酸轉氨酶 基底細胞瘤 貝勒大學醫學中心 血液尿素氮 全血球計數 聯邦管理法規 完全代謝檢查 病歷報告表 分升 糖尿病
糖尿病研究所[邁阿密]
Mg
鎂
mL毫升mm毫米mm3立方毫米MMF麥考酚酸酯(CellCept)Na鈉NCI國立癌癥研究所ng納克OGTT口服葡萄糖耐量試驗PA前后方向的PAK腎臟移植后的胰腺PCP間質性漿細胞肺炎PO經口服PPD純化的蛋白衍生物PRA群體反應性抗體PSA前列腺特異性抗原PT凝血酶原時間PTA僅胰腺移植PTT部分凝血活酶時間PV門靜脈RBC紅細胞SAE嚴重不良事件SCC鱗狀細胞癌SIR西羅莫司SPK同時的胰腺-腎臟移植AlcTAC他克莫司(Prograf)TB肺結核TC總膽固醇TGC甘油三酸酯UNOS器官統一網絡Uff威斯康星大學WBC白細胞
6
HTLV-I 人類T淋巴細胞病毒
HTN高血壓
ICT胰島細胞移植
ICU加護病房
IE胰島等價物
IgG免疫球蛋白G
IgM免疫球蛋白M
IND研究用新藥
INH異煙胼鹽酸鹽
IRB機構審查委員會
IU國際單位
IV經靜脈的
IVGTT靜脈葡萄糖耐量試驗
K鉀
kg千克
LDL低密度脂蛋白
LFT肝臟功能試驗
MAGE平均血糖漂移幅度
I型糖尿病(DM)是具有顯著的 :
為19歲或以下個人約120，000,以及在全年齡300，000到500，000人，以及全世界1. 5億
人。在美國每年有30，000新診斷的病例。DM在美國是最常發的兒童慢性疾病之一、在 美國該疾病的治療及并發癥的花費為每年900億美元。本發明的新特征包括(a)在胰島細胞移植物接受者中使用白細胞介素-1阻礙物， (b)在器官采集時，使用保存液ET-Kyoto進行供體胰腺的導管保存，和/或(c)在供體胰腺 消化中采用胰蛋白酶抑制。ET-Kyoto溶液，及其變體，包括作為非還原二糖的海藻糖，其使 細胞膜在不同壓力條件下穩定。ET-Kyoto溶液的兩種變體具有不同的電解質組成，例如， Na 1 OOmmol/L, K44mmol/L (所謂“細胞外”溶液)以及“細胞內型” IT-Kyoto溶液，例如Na 20mmol/L, K 130mmol/L,以及35gr/l海藻糖。完整的溶液歸納于表1。
權利要求
制備可移植的胰島制備物的方法，所述方法包括步驟獲得供體胰腺；向胰腺導管注射ET Kyoto溶液或其等價物；分離胰腺β 胰島細胞；以及使用人類白細胞介素 1拮抗劑在胰島移植時處理患者。
2.權利要求1所述的方法，其中所述分離胰腺β-胰島細胞的步驟使用膠原蛋白酶進行。
3.權利要求2所述的方法，其中所述膠原蛋白酶包括人類膠原蛋白酶。
4.權利要求1所述的方法，其中所述胰島在其從胰腺中提取之后，在ET-Kyoto溶液中處理。
5.權利要求1所述的方法，其中所述分離胰腺β-胰島細胞的步驟在胰蛋白酶抑制劑 的存在下進行。
6.權利要求1所述的方法，其中所述人類白細胞介素-1拮抗劑選自白細胞介 素-lbeta(IL-l β)基因轉錄的一種或多種改性劑；IL-I β基因翻譯的一種或多種改性劑； 靶向IL-I β表達的一種或多種siRNA ；—種或多種IL-I β受體阻斷劑；一種或多種白細胞 介素-1受體拮抗劑蛋白質；一種或多種白細胞介素-1受體拮抗劑肽；改變IL-I β的釋放 的一種或多種活性劑；中和IL-I β的一種或多種抗體；阻斷IL-I β受體的一種或多種抗 體；一種或多種重組的、天然產生的IL-I受體拮抗劑；一種或多種陰離子運輸抑制劑、脂氧 素及α-生育酚，其抑制IL-I β的釋放；一種或多種鴉片樣物質，其抑制蛋白水解酶，所述 蛋白水解酶將無活性的IL-I β前體轉化為其成熟的、有活性的形式；中和IL-I β的生物功 能的一種或多種抗體，及其混合物和組合。
7.權利要求1所述的方法，進一步包括向患者提供腫瘤壞死因子拮抗劑，所述拮抗劑 選自基因轉錄的抑制劑，滅活的腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子受體阻斷劑及可溶的腫瘤壞 死因子受體。
8.制備可移植的胰島制備物的方法，所述方法包括步驟 獲得供體胰腺；向胰腺導管注射ET-Kyoto溶液或其等價物；從割取的胰腺中在胰蛋白酶抑制劑的存在下分離胰腺β-胰島細胞；以及 使用人類白細胞介素-ι拮抗劑在胰島移植時處理患者。
9.權利要求8所述的方法，其中所述胰蛋白酶抑制劑選自血清α-l抗胰蛋白酶，利馬 豆胰蛋白酶抑制劑，庫尼茲抑制劑，卵類粘蛋白抑制劑或大豆抑制劑。
10.權利要求8所述的方法，其中所述胰腺胰島在其從胰腺中提取之后，在ET-Kyoto溶 液中處理。
11.權利要求8所述的方法，其中所述胰腺胰島使用膠原蛋白酶處理。
12.權利要求11所述的方法，其中所述膠原蛋白酶包括人類膠原蛋白酶。
13.權利要求8所述的方法，其中所述人類白細胞介素-1拮抗劑選自白細胞介 素-lbeta(IL-l β)基因轉錄的一種或多種改性劑；IL-I β基因翻譯的一種或多種改性劑； 靶向IL-I β表達的一種或多種siRNA ；—種或多種IL-I β受體阻斷劑；一種或多種白細胞 介素-1受體拮抗劑蛋白質；一種或多種白細胞介素-1受體拮抗劑肽；改變IL-I β的釋放的一種或多種活性劑；中和IL-I β的一種或多種抗體；阻斷IL-I β受體的一種或多種抗 體；一種或多種重組的、天然產生的IL-I受體拮抗劑；一種或多種陰離子運輸抑制劑、脂氧 素及α-生育酚，其抑制IL-I β的釋放；一種或多種鴉片樣物質，其抑制蛋白水解酶，所述 蛋白水解酶將無活性的IL-I β前體轉化為其成熟的、有活性的形式；中和IL-I β的生物功 能的一種或多種抗體，及其混合物和組合。
14.權利要求8所述的方法，進一步包括向患者提供腫瘤壞死因子拮抗劑，所述拮抗劑 選自基因轉錄的抑制劑，滅活的腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子受體阻斷劑及可溶的腫瘤壞 死因子受體。
15.制備可移植的胰島制備物的方法，所述方法包括步驟獲得供體胰腺；從割取的胰腺中在胰蛋白酶抑制劑的存在下分離胰腺β-胰島細胞分離胰腺β-胰島 細胞；以及使用人類白細胞介素-1拮抗劑及腫瘤壞死因子拮抗劑在胰島移植時處理患者。
16.權利要求15所述的方法，其中所述提取使用ET-Kyoto溶液中的合適的膠原蛋白酶 進行。
17.權利要求15所述的方法，其中所述胰島在其從胰腺中提取之后，在ET-Kyoto溶液 中處理。
18.權利要求15所述的方法，其中所述胰蛋白酶抑制劑選自血清α-1抗胰蛋白酶，利 馬豆胰蛋白酶抑制劑，庫尼茲抑制劑，卵類粘蛋白抑制劑或大豆抑制劑。
19.權利要求15所述的方法，其中所述膠原蛋白酶包括人類膠原蛋白酶。
20.權利要求15所述的方法，進一步包括向患者提供腫瘤壞死因子拮抗劑，所述拮抗 劑選自基因轉錄的抑制劑，滅活的腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子受體阻斷劑及可溶的腫瘤 壞死因子受體。
全文摘要
本發明包括制備用于移植的胰島細胞的組合物和方法。
文檔編號C12N5/071GK101981180SQ200980110879
公開日2011年2月23日 申請日期2009年1月21日 優先權日2008年1月22日
發明者松本慎一 申請人:貝勒研究院