專利名稱：使用FISH技術檢測循環腫瘤細胞中的IGF1R/Chr15的方法
技術領域：
本發明總體涉及腫瘤學和診斷影像學領域。更具體地講，本發明涉及檢測癌癥和 評估患者的治療方案的方法。
背景技術：
盡管對癌癥患者的治療和管理的改善已作了很多努力，但是在過去的二十年里， 對于許多癌癥類型，癌癥患者的存活并沒有改善。因此，大多數癌癥患者并非死于原發性腫 瘤，而死于轉移性腫瘤即，由惡性細胞建立的多個廣泛分布的腫瘤集落，所述惡性細胞自 身從原發部位腫瘤脫離并在體內移動，通常到達遠端。最成功的癌癥治療策略是在腫瘤仍 限于某一器官時進行早期診斷并通過手術切除腫瘤。事實證明，對于某些癌癥來說，尤其是 存在合適的診斷性試驗(例如用于子宮頸癌的PAP涂片、用于乳腺癌的乳房X線照相術和 用于前列腺癌的血清前列腺特異性抗原(PSA))時，癌癥早期診斷是可行的。然而，早期診 斷出的許多癌癥在通過外科手術切除之前就已出現微轉移。因此，及時準確地確定腫瘤的 惡性可能性對于選擇正確療法十分重要。優化療法將基于診斷和預后信息的組合。需要準確和可重復的診斷測試，以提供 關于特定癌癥的轉移性質的具體信息，同時需要進行預后評估，預后評估將提供關于存活 的具體信息。正確設計的預后測試會為醫生提供關于存活風險和可能性的信息，此信息繼而使 患者不必忍受無用治療而受益。根據預后測試而選擇的治療將是有效的，患者基于這樣的 認識，情緒也會受到鼓舞。與這種測試相關的成本節省將是明顯的，因為可為醫生提供替代 無效療法的理論基礎。在關注存活的轉移性癌癥的治療和檢測中，正確開發的診斷和預后 數據庫明顯將為醫學提供極大益處(US 6，063，586)。如果足夠早地檢測出原發腫瘤，往往可以提供外科手術、放療或化療或這些療法 的某種組合來去除腫瘤。遺憾的是，很難檢測和移除轉移集落，并且通常不可能成功治療所 有這些轉移集落。因此，從臨床角度來看，轉移可視作癌癥自然進展中的決定性事件。此外， 轉移能力是唯一表征惡性腫瘤的屬性。對血液中完整腫瘤細胞的檢測直接關聯到接受過原發腫瘤切除術的癌癥患者的 復發轉移性疾病。遺憾的是，同樣的惡性細胞擴散仍然被傳統的腫瘤分期程序錯過。最 近的研究表明，癌癥患者骨髓內單一惡性腫瘤細胞的存在是轉移復發的獨立預后因素 (Diel IJ，Kaufman M，Goerner R，CostaSD，Kaul S，Bastert G. Detection of tumorcells in bone marrow ofpatients with primary breast cancer -.a prognostic factor fordistant metastasis. J Clin Oncol,10 :1534-1539,1992(Diel IJ、Kaufman M、Goerner R、Costa SD、Kaul S, Bastert G.，對原發性乳癌患者骨髓內的腫瘤細胞的檢測遠程轉移 的預后因素，《臨床腫瘤學雜志》，第10卷第1534-1539頁，1992年))。但與血液中散布的 上皮腫瘤細胞的檢測相比較，這些侵入式技術被認為對于常規或多重臨床檢測分析法是不 可取或不可接受的。以前已描述了來自生物樣品的腫瘤細胞、稀少細胞或其他生物實體的鑒定方法 (US 6，365，362)。此兩步法要求有效富集以確保在分析之前獲取靶細胞，同時去除大量碎 片和其他干擾物質，使得可通過成像技術進行細胞檢驗。此方法以獨特的自動方式將免疫 磁性富集元件與多參數流式細胞術、顯微鏡術和免疫細胞化學分析組合起來。此組合方法 用于富集和計數血樣中的上皮細胞，因此提供了一種量度癌癥的工具。此兩步法可應用于轉移性癌癥患者的癌癥預后和存活分析(W004076643)。基于在 血液中形態完整的循環癌細胞的存在性，此方法能夠將轉移性乳腺癌患者的循環癌細胞的 存在性與疾病進展和存活的時間聯系起來。更具體地講，每7. 5毫升存在五(5)個或更多 個循環腫瘤細胞提供了在第一次隨訪時的預測值，因此提供了患者存活的早期預后指標。上述檢測分析法的特異性隨著受檢細胞的數目增多而增加，而在只有少量細胞 (通常少于5個循環腫瘤細胞)被檢測到的情況下特異性是不足夠的。此問題的一種解決 方法是提供關于可疑癌細胞的詳細遺傳學信息。因此，一種將血樣富集與對單個可疑癌細 胞的多參數圖像細胞計量術和多參數遺傳分析整合起來的方法將提供完整的譜圖和確認 機制，可顯著改善目前用于患者篩選、評估疾病復發或總體存活的程序。熒光原位雜交(FISH)已被描述為富集之后在稀少細胞檢測中的單模式分析，如 在 TO 00/60119 ；Meng et al. PNAS 101 (25) :9393_9398 (2004) (Meng 等人，《美國國家科 學院院刊》，第 101 卷第 25 期第 9393-9398 頁，2004 年)；Fehm et al. Clin Can Res 8 2073-2084 (2002) (Fehm等人，《臨床癌癥研究》，第8卷第2073-2084頁，2002年)中所描述， 所述文獻以引用方式并入本文。上皮細胞富集后，通過已知的雜交方法篩選捕獲的細胞并 在顯微鏡載片上成像。由于內在技術誤差和缺少滿意的遺傳學信息的確認，雜交圖譜獨自 不提供臨床置信度水平，該臨床置信度水平對于敏感性分析將是必需的，如在評估具有少 于5個靶細胞的樣品情況下。此外，此方法用于FISH分析時難以自動化。此前已描述在單個細胞分析中結合使用基于雜交的方法和免疫細胞化學術(US 6，524，798)。對單個細胞同時進行的表型和基因型評估要求在原位雜交準備步驟后表型特 性保持穩定，并且表型特性在可檢測標簽的選擇方面是有限的。通常，常規的原位雜交檢 測分析法需進行以下步驟(1)用熱或堿變性；(2)降低非特異性結合的可選步驟；(3)將 一種或多種核酸探針雜交到靶核酸序列；(4)移除未結合的核酸片段；以及(5)檢測雜交探 針。用于完成一個或多個這些步驟(即甲醇洗滌)的試劑將改變在后續免疫細胞化學術中 的抗原識別，造成靶細胞位置的微小變化或靶細胞的完全移除，由此有可能錯誤鑒定出可 疑細胞。通過對單個分離的靶細胞結合進行的表型和基因型多參數分析來分析稀少循環 細胞的能力可確保臨床醫師獲得任何定量信息。當使用極少數量的(1、2、3、或4個)循環 腫瘤細胞(CTC)評估疾病狀態，并提供早期疾病檢測的確認時，該方法尤其適用。
已在肺癌中描述了用于多參數FISH分析的探針組和方法(US20030087248)。也 已描述了在檢測患者膀胱癌時產生95 %敏感性的3探針組合，參見US 6，376，188、US 6，174，681。這些方法在評估小數量靶細胞時特異性和敏感性不高，因此無法對疾病狀態的 早期檢測進行確認性評估。這些方法也無法提供方便的自動化的方式。最近描述的探針去除了 DNA的重復序列以提供無重復的序列。無重復的序列起到 雜交探針的作用，而不用封閉DNA或不需要封閉不想要的DNA序列(W007/053245)。與具有低IGF-I水平的個體相比，高水平的IGF-I表達與癌癥，例如肺癌、乳腺癌、 前列腺癌和結腸直腸癌的風險增加相關。此外，有相當多的證據表明了 IGF-I和/或IGF-IR 在體外或體內保持腫瘤細胞的作用。IGF-IR水平在以下腫瘤中升高肺腫瘤(Kaiser et al.，J. Cancer Res. Clin. Oncol. 119 :665_668，1993 (Kaiser 等人，《癌癥研究和臨床腫瘤 學雜志》，第 119 卷第 665-668 頁，1993 年)；Moody et al. ,Life Sciences52 :1161_1173， 1993 (Moody 等人，《生命科學》，第 52 卷第 1161-1173 頁，1993 年)；Macauley et al.， Cancer Res. ,50 :2511_2517，1990 (Macauley 等人，《癌癥研究》，第 50 卷第 2511-2517 頁， 1990 年))、乳腺腫瘤(Pollak et al.，Cancer Lett. 38 :223_230，1987 (Pollak 等人，《癌 癥通訊》，第 38 卷第 223-230 頁，1987 年)；Foekens et al.，Cancer Res. 49 7002-7009, 1989 (Foekens 等人，《癌癥研究》，第 49 卷第 7002-7009 頁，1989 年)；Arteaqa et al.， J. Clin. Invest. 84 1418-1423，1989 (Arteaqa 等人，《臨床研究雜志》，第 84 卷第 1418-1423 頁，1989 年))、前列腺腫瘤和結腸腫瘤(Remaole-Bennet et al.，J. Clin. Endocrinol. Metab. 75 =609-616,1992 (Remaole-Bennet等人，《臨床內分泌代謝雜志》，第75卷第 609-616 頁，1992 年)；Guo etal.，Gastroenterol. 102 :1101_1108，1992 (Guo 等人，《胃 腸病學》，第102卷第1101-1108頁，1992年))。IGF-I在前列腺上皮的去調控表達導致 轉基因小鼠的瘤變(DiGiovanni et al. , Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA 97:3455-3460， 2000 (DiGiovanni等人，《美國國家科學院院刊》，第97卷第3455-3460頁，2000年))。另 外，IGF-I似乎是人神經膠質瘤的自分泌刺激物(Sandberg-Nordqvist et al.，Cancer Res. 53(11) :2475_78，1993 (Sandberg-Nordqvist 等人，《癌癥研究》，第 53 卷第 11 期第 2475-2478頁，1993年))，而已顯示IGF-I刺激過表達IGF-IR的纖維肉瘤的生長(Butler et al.，Cancer Res. 58 :3021_3027，1998 (Butler 等人，《癌癥研究》，第 58 卷第 3021-3027 頁，1998年))。如需查閱關于IGF-1/IGF-1R相互作用在多種人腫瘤生長中所起的作用，參 見 Macaulay，Br. J. Cancer, 65 :311_20，1992 (Macaulay 等人，《英國癌癥雜志》，第 65 卷第 311-320 頁，1992 年)。使用IGF-IR RNA的反義表達載體或反義寡核苷酸時顯示，IGF-1R的干擾導致 IGF-I 介導的細胞生長的抑制(參見，例如 Wraight et al.，Nat. Biotech. 18 =521-526, 2000(Wraight等人，《自然-生物技術》，第18卷第521-526頁，2000年))。使用IGF-I的 肽類似物(Pietrzkowski etal.，Cell Growth & Diff. 3 199-205,1992 (Pietrzkowski 等 人，《細胞生長和分化》,第3卷第199-205頁，1992年)；Pietrzkowski et al.，Mol. Cell. Biol. 12 3883-3889,1992 (Pietrzkowski 等人，《分子細胞生物學》，第 12 卷第 3883-3889 頁，1992年))、或表達 IGF-I RNA 的反義RNA 的載體(Trojan et al. ,Science 259:94-97， 1992 (Trojan等人，《科學》，第259卷第94-97頁，1992年))也能抑制細胞生長。另外， IGF-IR 的抗體(Arteaga et al. , Breast Cane. Res. Treatm. 22 101-106,1992(Arteaga等人，《乳腺癌研究和治療》，第22卷第101-106頁，1992年)和Kalebic et al.，Cancer Res. 54 5531-34,1994(Kalebic 等人，《癌癥研究》，第 54 卷第 5531-5534 頁，1994 年)) 和 IGF-IR 的顯性失活突變體(Prager et al.，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA91 :2181_85， 1994 (Prager等人，《美國國家科學院院刊》，第91卷第2181-2185頁，1994年)；Li et al., J. Biol. Chem. 269 :32558_2564，1994 (Li 等人，《生物化學雜志》，第 269 卷第 32558-32564 頁，1994 年)Jiang et al.，Oncogene 18 :6071_6077，1999 (Jiang 等人，《癌基因》，第 18 卷，第6071-6077頁，1999年))可以逆轉轉化表型、抑制腫瘤發生和誘導轉移表型的缺失。IGF-I在凋亡的調控中也很重要。凋亡，即程序性細胞死亡，參與多種發育過程， 包括免疫和神經系統成熟。除了其在發育中的作用，也有研究表明凋亡在抗腫瘤發生的細 胞防衛中的重要作用(Williams, Cell 65 :1097_1098，1991 (Williams，《細胞》，第65卷 第 1097-1098 頁，1991 年)；Lane, Nature 362 :786_787，1993 (Lane,《自然》，第 362 卷第 786-787頁，1993年))。凋亡程序的抑制可促進惡性腫瘤的發展和進展。一些研究表明IGF-IR的表達水平與臨床效果相關。在腫瘤模型中，IGF-IR調節 細胞增殖、存活和轉移，并誘導對靶向療法的抗性。IGF-IR的抑制顯著增加了細胞毒素劑 的活性(Cohen, B. e al.，Clin. Cancer Res. 11(5) 2063-73 (Cohen, B.等人，《臨床癌癥研 究》，第11卷第5期第2063-2073頁))。因此IGF-IR信號的抑制對于新型癌癥療法的開發 似乎是一種很有前景的策略。已經將在CTC表面上的IGF-IR表達的檢測與對癌癥患者的IGF-IR拮抗劑療法的 功效預測相關聯(W007/141626)。然而，此方法不能直接檢測單個腫瘤細胞的染色體排列。 對IGF-IR基因的分析將提供關于表達IGF-IR的單個腫瘤細胞的凋亡或增殖狀態的信息， 因此導致對腫瘤發生的更特異的評估。此外，與檢測IGF-IR的表面表達的能力相結合的、能夠評估IGF-1R的存在和任何 染色體畸變的方法，將產生表達IGF-IR的循環腫瘤細胞中的非整倍性的更直接指標。這繼 而允許對疾病進展進行更特異和更靈敏的診斷和評估。
發明內容
本發明提供一種用于在IGF-IR循環腫瘤細胞中評估染色體排列的直接方法。更直 接的分析方法將輔助臨床醫生預測IGF-IR療法對癌癥患者的益處，并為這些患者提供更特 異的診斷。該方法包括a)從患者獲得血樣，所述樣品包含懷疑含有循環腫瘤細胞的混合細 胞群；b)通過免疫磁性富集來分離上皮細胞的亞群；c)鑒別具有IGF-IR遺傳畸變的循環腫 瘤細胞；以及e)將提供關于測試受試者的診斷、預后或治療信息的循環腫瘤細胞相關聯。本發明還提供一種試劑盒，用于篩選存在表達IGF-IR的循環腫瘤細胞的患者樣 品，此試劑盒包括a)具有涂層的磁性納米顆粒，其包括磁芯材料、蛋白基底涂層材料、和 特異結合于來源于上皮細胞的腫瘤細胞的抗體，此抗體直接或間接偶聯到所述基底涂層材 料；b)用于將除待分析腫瘤細胞以外的樣品組分排除的細胞染料；c)用于染色體計數和非 整倍性檢測的衛星計數探針；以及d) —種能夠限定IGF-IR基因座的無重復序列探針。
圖1:描述從起始BAC DNA去除重復序列的DNA探針的生成的示意圖。將片段化的全基因組擴增文庫變性并允許在過量Cot DNA存在下重新退火。雙鏈DNA的DSN消化產 生單鏈的單一序列的混合物，可用于生成探針的模板。圖2 顯示用于鑒定IGF-IR基因的兩個克隆的位置的圖表。通過選擇含有IGF-IR 基因座旁側序列的BAC克隆來設計IGF-IR探針。圖3 描述了無重復序列的IGF-IR DNA克隆的染色體定位。將IGF-1R克隆(紅 色)與染色體17 α衛星對照探針(綠色)一起雜交到正常人中期染色體。圖4 15號染色體的α衛星探針(SE-15)的圖像顯示于IGF-1R基因座。將無重 復序列的IGFlR克隆(紅色)與SE-15探針(綠色)一起混合并雜交到正常中期染色體涂 片。圖5 在LNCAP細胞(右)和ΒΤ474細胞(左)上的IGF-1R探針配置(probe configuration)的雜交。圖6 顯示組合使用的探針的相對位置的圖表。這兩個克隆是無重復序列的，并通 過熒光標記(紅色)的探針，使用IGF-IR探針(藍色)作為對照對其進行染色體定位。圖7 顯示了在檢測分析中使用的熒光染料的光譜。ULS DY415用于標記IGF-1R。圖8 用IGF-IR探針評估的7個細胞系的圖像，表明此探針能夠檢測染色體畸變。圖9 圖中顯示了對CeIlTracks儀器所采集的圖像進行評分的能力。將 CellTracks儀器所采集的圖像與標準熒光顯微鏡所采集的圖像進行比較。圖10 用于對FISH結果評分的FISH軟件的截圖形式的圖像。頂行顯示來自于CTC 掃描的原始圖像CK+、DAPI+/⑶45-和CTC。底行顯示具有異常數目IGF-IR的CTC和15號 染色體探針。
具體實施例方式本發明通過將免疫磁性富集和圖像分析與熒光原位雜交(FISH)相結合而將循環 腫瘤細胞的分離和鑒定整合在一起，以便檢測具有異常基因譜的腫瘤細胞中的IGF-1R。為此，CellTracks系統利用免疫磁性選擇和分離來高度富集和濃縮全血樣品中存 在的任何上皮細胞。將所捕獲的細胞可檢測地標以白細胞特異性標記物和一種或多種腫瘤 細胞特異性熒光單克隆抗體，以使得能對所捕獲的CTC進行鑒別和計數以及與污染性非靶 細胞明確地在儀器上或視覺上做區分。由于具有在每7. 5-30mL血液中可檢測到1或2個 上皮細胞的極強敏感性，此檢測分析法使得即使在出現小腫瘤塊的早期階段也能檢測到腫 瘤細胞。本發明的實施例并不限于CellTracks系統，而是包括敏感性和特異性相當的任何 分離和成像方案。DNA包含單一序列和重復序列。重復序列存在于整個染色體上，并具有干擾雜交反 應的潛在作用，例如，干擾靶向這些重復序列之外的特定區域或單一序列的原位雜交。為了 鑒定在染色體、基因或DNA序列上特定序列的存在、數量和位置，將雜交探針只雜交于所關 注的位置是重要的。重復序列在雜交探針混合物中的存在降低了結合特異性，因此需要從 探針上移除重復序列或防止探針雜交到靶標上的重復序列的方法。例如，經常在雜交期間 添加Cot-I DNA以防止探針結合到重復序列(US 5，447，841和US6, 596，479)。在圖1中描述了生成去除了重復序列的DNA探針的總體圖表。與單鏈DNA相 比，優先切割脫氧核糖核酸分子的雙鏈特異性核酸酶(DSN)(以引用方式并入本文的US2005/0164216和US 6，541，204)優先切割核酸雙鏈多核苷酸，從而提供了一種從樣品混合 物中移除非靶標雙鏈DNA的方法。這些核酸酶優先消化雙鏈形式的多核苷酸的能力提供了 在生產單一的靶向特異性探針方面的潛在應用，從而消除了封閉DNA的干擾作用，并提供 了一種用于快速、有效和高性價比生產的方法。起始DNA通常是含有多種DNA片段的一種或多種DNA序列的形式。已在直接標記 探針的生產中描述了探針組合物生產中的單個起始材料的初始來源(US 6，569，626)。優 選從組織純化起始寡核苷酸來源，并使用任何已知的技術，例如，酶處理(限制性酶)、聚合 酶、DNA酶I有限消化、綠豆核酸酶有限消化、超聲降解、DNA剪切等將其片段化成150kb到 200kb的片段。這些片段化的片段中的一些將互補于特定的單一靶序列中的一種或多種 DNA片段的至少一部分。通過通常所知的方法(例如克隆進質粒構造再轉染進細菌)擴增單個DNA片段。克隆片段擴增后，鑒定代表分離片段的單個菌落是否含有所關注序列的至少一部 分。通過已知的技術，例如雜交、PCR、或搜索可商購獲得的文庫中的已建立的數據庫來完成 鑒定。培養每個挑選的菌落，以獲得具有單一片段的分離的質粒構造，該單一片段至少部分 地互補于染色體上的靶序列的一個片段(即BAC克隆)。一旦擴增和分離了所關注的克隆片段，它們的多核苷酸重復序列即被去除。使用 全基因擴增(WGA)，從分離的質粒構造將這些片段擴增成200到500bp片段。擴增后，通過 如下方式將Cot-I DNA與WGA文庫組合(librarypool)相結合首先加熱到95°C，將雙鏈多 核苷酸變性成單鏈狀態；然后冷卻到65°C，以允許對重復序列的選擇性再退火。然后在雙 鏈特異核酸酶(DSN)的最適條件下添加DSN，以優先切割含有完全配對的核酸雙鏈的脫氧 核糖核酸分子，而不影響任何剩余的單鏈片段。通過酶消化DNA-DNA雙鏈和DNA-RNA雙鏈 來完成雙鏈核酸的選擇性切割。從勘察加半島蟹(US10/845，366)或蝦(US 6，541，204)分 離的DSN可移去雙鏈結構。使用內切酶特異性核酸酶水解雙鏈DNA主鏈中的磷酸二酯鍵， 其優點在于不具有核苷酸序列特異性，因此適用于大多數所關注的靶標。采用DSN消化的 目的是移除大量核酸雙鏈，以便對剩余的單鏈多核苷酸進行后續擴增。所得的消化產物含 有單鏈DNA(其對應于染色體上單一靶序列的部分)、一定量的未消化的雙鏈DNA和消化的 堿基對。通過離心(即離心柱色譜法)將未消化的DNA與消化的DNA和DSN分離。在將純 化的組合物擴增以進行后續的應用(例如標記或原位雜交)之前或之后，立即使用該混合 物或將其保存于80°C。擴增后，使用PCR擴增所得的靶探針序列，產生90%到99%純度的 靶探針序列，并將其指定為去除了重復序列的DNA。將所得的探針并入體現于本發明的方法中。如本發明所述，去除了重復序列的DNA 用于包括FISH的原位雜交，如雜交到可疑CTC的IGF-IR基因。使用本發明所述的去除了 重復序列的探針，消除了對競爭性結合的要求，導致反應特異性增加，并減少了結合所需的 探針的量。重新分析免疫磁性標記的細胞染色體非整倍性與遺傳疾病(尤其是癌癥)有關。用于檢測這些染色體異常的診 斷方法、尤其是使用原位雜交(ISH)來檢測這些染色體異常的診斷方法是可獲得的。已經 很好地建立了 ISH和免疫細胞化學(ICC)在組織或細胞樣品上的應用，但是明顯需要建立 有效的診斷方法，以便在單個細胞上同時進行ISH和ICC分析。因為這些染色體異常與癌癥細胞上的IGF-IR基因座相關，因此，本發明采用高性價比和高特異性方法在單細胞上檢 測這些染色體異常。本發明的一個方面涉及在富集和免疫細胞化學(ICC)分析后對稀少細胞的進一 步處理。例如，將諸如上皮細胞的循環稀少細胞鑒定為可疑癌細胞(以引用方式并入本文 的US 6, 365, 362,US 6，645，731和US11/202，875)。通過特定的細胞抗原和核酸標記鑒定 可疑細胞。然后通過限定染色體和/或基因的特定的單一靶序列的表達確定這些可疑細胞 的IGF-IR確認，用于評估在鑒定的可疑細胞內的染色體改變(即非整倍性)。因此，本發明 的一個實施例包括ICC染色和后續確認的組合，其中后續確認通過使用能夠結合到一個基 因或一組基因的衛星計數探針(SE)和單一序列探針的熒光原位雜交(FISH)進行。在對循環腫瘤細胞的免疫磁性富集和熒光成像后，此方法提供了增加的特
異性，循環腫瘤細胞由GellTraeks AutoPrep 和CellTraeks 分析儀11系統 (Cel lTracks Analyzer II System) (Veridex, LLC)提供，并在US6，365，362 中進一步描 述。一種方法允許指定一種或多種CTC為IGF-IR陽性癌細胞，而不考慮疾病階段，因此降 低了指定樣品為CTC陽性的閾值。本發明的一個實施例是檢測作為治療靶標的IGF-IR存 在與否，因此提供了一種正確選擇治療的方法。因此，一種用于血樣處理的自動化和標準化方法提供了通過ICC實現對循環上皮 細胞的鑒定。將從分離血樣中吸出的血漿與連接到靶細胞群(即EpCAM陽性)特異性抗體 的鐵磁流體試劑混合。通過施加外部磁場以免疫磁性方式收集這些細胞，而允許分離和移 除未標記細胞。分離靶細胞后，將細胞分配到一次性柱體(cartridge)中，以使用圖像呈現裝置 進行圖像分析(US 6，790，366和US 6，890，426)。此裝置用于施加磁場將標記細胞沿著小 室的光學透明表面定位，以進行后續的ICC成像。ICC成像后，使用合適算法鑒定可疑細胞。將可疑細胞的圖像遞交給用戶，其對呈 現的可疑細胞的身份做出最終決定。記錄并歸檔可疑細胞的圖像及其沿著小室的光學透明 觀測表面的相對位置，以方便后續使用。因為單獨的ICC成像對于評估少于5個CTC的血樣的臨床重要性的特異性不高、 或對于提供關于可疑癌細胞的詳細遺傳學信息的特異性不高，需要對單個可疑細胞的后續 分析，以提供完整的譜圖和建立確認方法，確認所選可疑腫瘤細胞可以用于診斷分析，包括 篩選、評估疾病復發和總體存活率。FISH要求高于DNA的熔解溫度的溫度以及與ICC標記不相容的試劑。大部分ICC 和DNA標簽經不住FISH過程，在處理過程中會丟失所有信號。因此，鑒定為用于FISH分析 的所關注細胞不能在其位置被回溯。因此，需要一種檢測方法，即一旦獲得ICC圖像，便保 持沿著光學透明觀測表面的細胞位置，以進行后續的遺傳分析(FISH)或其他類型的分析 (其中丟失了 ICC標簽)。這部分地通過在獲得ICC圖像后在不丟失細胞或任何沿著表面 的基本運動的情況下將細胞固定在光學透明表面上實現。因此，添加FISH試劑后，將柱體置于熱板上，使固定細胞的表面與熱板接觸。根據 檢測分析的類型對熱板以運行于2至48小時的不同溫度循環進行程控。完成溫度循環后， 從柱體中移去過量的FISH試劑。用含有DNA標簽的緩沖液填充柱體以顯現固定細胞的細 胞核。根據所用的DNA標簽，將標簽保留在柱體中或在染色后將其從柱體洗脫。
接下來，將柱體放回CellTraeks 分析儀Ii系統以進行第二次掃描。因為在第 一次ICC圖像分析期間呈現于上表面的細胞被固定，相同的細胞仍然位于柱體內相同的相 對位置。為了評估柱體相對于成像系統(CellTracks 分析儀II系統)的位移，將第二 次掃描的圖像中的細胞核位置與第一次icc掃描的圖像中的細胞核位置進行比較。使用卷 積算法確定這些圖像相對于彼此之間的位移。確定了這些位移后，根據所關注的特定細胞 的icc圖像，可以在第二次掃描中的fish后從列表中選擇所關注的特定細胞，并將其重新 定位于柱體表面。采集所選FISH探針的下一個熒光圖像。實例1-用于IGF-IR/Chr 15 FISH檢測分析的探針組的津立。對于此檢測分析，需要兩類探針。一類是衛星計數(SE)探針。這些探針結合染色 體著絲粒附近的衛星(重復)序列，并用于染色體計數和非整倍性檢測。第二類探針是單 一序列探針。如其名稱所指，這些探針結合單一序列，如基因。使用生物信息學，可以針對 基因組中的任何位置設計單一序列探針。單一序列探針通常包含重復元件，如Alu或Kpn 重復序列，這些重復序列可以導致探針的非特異性結合。通常通過在雜交中摻入未標記的 封閉DNA來進行非特異性結合的抑制。研究顯示封閉DNA干擾單一序列與衛星探針之間的 雜交。本發明方法通過使用無重復探針去除了該步驟，這些無重復探針允許更快、信號更亮 的探針雜交，同時沒有使用封閉DNA的缺點。使用生物信息學，通過選擇含有IGF-IR基因座旁側序列的細菌人工染色體(BAC) 克隆設計IGFlR探針。圖2中的圖表顯示這兩個克隆相對于IGFlR基因的位置。使用Qiagen 大構造試劑盒(Qiagen Large ConstructKit)擴增和分離BAC DNA0將克隆進行FISH染色 體定位以檢測特異性，然后根據所描述的方案使之無重復序列。在圖2中，紅色的“A”和“B” 代表IGF-IR基因座旁側的兩個克隆。綠色區代表15號染色體上的衛星計數探針(SE-15)。將IGFlR克隆進行染色體定位以確認它們的功能。將這兩個克隆的擴增的無重復 序列 DNA進行超聲降解并用 ULS-PlatinumBright 550 (Kreatech Diagnostics)標記。如圖 3所示，將IGFlR克隆(紅色)與染色體17 α衛星對照探針(綠色)一起雜交到正常人中 期染色體上。這兩個克隆都在大小合適的近端著絲粒染色體的長臂末端產生明亮的信號。 未在其他染色體上觀察到無重復序列的克隆的交叉雜交。對15號染色體的α衛星探針(SE-15)進行評估以用作IGF-IR基因座的對照探 針。如圖4所示，將無重復序列的IGF-IR克隆A和B(紅色)與SE-15著絲粒探針(綠色) 一起混合，并雜交到正常中期染色體涂片。下面的圖像清晰地表明，IGFlR和SE-15探針定 位到正確的染色體并發出強信號。實例2-對IGF-1R/SE-15探針配置的細胞系評估。測試15號染色體的α衛星探針和IGF-1R克隆A和B的組合(IGF_1R/SE_15)以 評估遺傳畸變。將IGF1R/SE-15探針配置在數個細胞系上使用以查看探針是否可以檢測 非整倍性或基因擴增/缺失。用此配置測試了 A549 (肺)、BT474 (乳腺)、PC3 (前列腺)、 LNCAP (前列腺)、H1299(肺)和MCF7 (乳腺)細胞系。圖5中的圖像顯示LNCAP有四個拷 貝的SE-15和四個拷貝的IGF1R，表明具有非整倍性但無基因擴增。測試的剩余5個細胞系 顯示了 SE-15探針與其他染色體的交叉雜交。BT 474細胞含有2-3個拷貝的IGFlR和多個 指示交叉雜交的SE-15信號。其他細胞系具有不同數量的SE-15探針的交叉雜交。由于交 叉雜交程度在細胞系和所測試的正常供體之間不同，可能此交叉雜交是由于供體之間的變已為了解決SE-15的交叉雜交問題，用靶向15號染色體上其他基因座的單一序列探 針重新配置IGF-1R/SE-15探針。因為該探針是單一序列探針，所以應可以結合到15號染 色體的特定區域，而沒有因使用α衛星探針(如SE-15)而產生的交叉雜交問題。在15號 染色體的ql區，即與IGFlR位于15號染色體的相同臂上的近著絲粒區選擇兩個相鄰的克 隆。圖6中的圖表顯示以該配置使用的探針的相對位置。根據無重復序列方案生成這兩個 克隆并進行熒光標記(紅色)。IGF-IR探針(藍色)用作染色體定位的對照。如圖所示， 克隆Chr 15 A定位到不正確的染色體。克隆Chr 15 B正確地定位到15號染色體，并被進 一步評估為IGF-IR的對照探針。圖7顯示了用作探針標簽的熒光染料的光譜。為Chr 15探針選擇ULS-550染料 (Kreatech Diagnostics)，而 ULS DY415 用于 IGF-1R。配置中的每個探針的最佳濃度是基于具有最優信噪比量度的最亮信號。雜交混 合物由50%的甲酰胺、1 X SSC、10%的硫酸葡聚糖、10%的Kreaboost和不同濃度的探針組 成。將固定在CelITracks柱體內的白細胞過夜進行FISH，并使用24%的甲酰胺和0. 1 X SSC 進行嚴格的洗脫。通過采集10個細胞的熒光圖像并通過將細胞核中最亮像素(信號)的 強度除以細胞核中一些隨機像素(噪音)的平均強度，從而測量信號和背景強度。表I列 出了測得的濃度和相關信噪比(SNR)。將IGFlR和Chr 15兩者的最佳濃度都確定為4ng/ μ I。表 I
Ing/ μ 12ng/ μ 14ng/ μ 16ng/ μ 1信號SNR信號SNR信號SNR信號SNRIGFlR DY41518. 11. 927. 52. 53δ. 93.238. 82. 7Chr 15 DY55022. 71. 835. 62. 841.42.638. 62. 2實例3_對來自供體樣品的探針配置的評估。在獲得檢測分析的最佳條件(包括在反應中每個探針的使用濃度為4ng/y 1) 后，在得自3個不同供體的總共350個CD45/CK細胞(白細胞)上評估探針配置，并使用 CellTracks-FISH系統分析。下表列出了所評分的每個靶標的拷貝數和結果。能夠在大于 95%的由CellTracks-FISH系統重新定位的細胞中評分FISH信號。表II顯示了來自三個供體的結果。期望的IGFlR的2個拷貝出現在從3個供體測 得的87%、81%和93%的WBC中。期望彡75%的WBC應該顯示期望的結果，即對于IGFlR 而言，每個WBC有2個斑點，并且應可以對> 85 %的評估的WBC進行評分。這三個供體顯示 了期望的91%、97%和93%的所檢測WBC中的Chr 15的2個拷貝。為此，我們設定了 QC 標準，即彡80 %的WBC應該顯示期望的2個斑點的結果，并且應可以對> 85 %的評估的WBC 進行評分。此數據與使用其他選擇的探針以相似的方式收集的數據一致。表II
權利要求
一種用于評估來自患者樣品的循環腫瘤細胞中的IGF 1R基因異常的方法，包括a.從患者獲得血樣，所述血樣包含懷疑含有循環腫瘤細胞的混合細胞群；b.通過免疫磁性富集來分離上皮細胞的亞群；c.鑒定可疑循環腫瘤細胞；以及d.將所述可疑循環腫瘤細胞與能夠檢測染色體畸變的IGF 1R無重復序列的探針配置雜交。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述免疫磁性富集包括a.將所述樣品與偶聯于配體的膠質免疫磁性顆粒混合，所述配體特異性結合于可疑循 環腫瘤細胞，從而基本上排除其他群體；和b.使所述樣品_免疫磁性顆粒混合物經受高梯度磁場，以產生富含免疫磁性顆粒結合 的腫瘤細胞的分離的細胞組分。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述表型譜由選自下列的方法確定多參數流式 細胞術、免疫熒光顯微術、激光掃描細胞計量術、明視野基準圖像分析、毛細管容量分析、光 譜成像分析、人工細胞分析、自動細胞分析以及它們的組合。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述表型譜由自動免疫熒光細胞分析確定。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述探針配置由IGF-1R基因座旁側的克隆序列和 缺少交叉雜交的a衛星探針組成。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述克隆序列選自細菌人工染色體克隆。
7.根據權利要求5所述的方法，其中所述a衛星探針選自SE-17、SE-15以及它們的 組合。
8.根據權利要求5所述的方法，其中所述a衛星探針是對15號染色體的ql區特異的。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述雜交可疑的靶細胞提供所述患者的診斷、預 后或治療信息。
10.一種用于確定來自患者樣品的循環腫瘤細胞中的IGF-1R基因異常的試劑盒，包括a.IGF-1R基因座旁側的多核苷酸探針序列，其中所述探針的重復序列被去除；b.缺少交叉雜交的a衛星探針；和c.連接到所述(a)和(b)的標記部分。
11.根據權利要求10所述的試劑盒，其中通過用雙鏈特異性核酸酶消化來去除所述多 核苷酸探針序列的所述重復序列。
12.根據權利要求31所述的試劑盒，其中所述標記部分是由基于鉬的配位鍵連接的熒光團。
全文摘要
本發明描述了方法和探針組合物，所述方法和所述探針組合物用于對含有表達所述IGF-1R基因的循環腫瘤細胞的血樣進行自動FISH檢測分析。所述檢測分析提供可疑循環腫瘤細胞的遺傳分析，所述可疑循環腫瘤細胞已經在免疫磁性選擇和熒光標記后被鑒定。使用IGF-1R基因座的單一、無重復序列探針和15號染色體對照探針檢測表達異常數目的IGF-1R和Chr 15信號的細胞系，包括具有低水平IGF-1R擴增的細胞系。在循環腫瘤細胞上直接檢測IGF-1R的基因譜的能力可以提供一種用于評估疾病和患者對治療的反應的自動方法。
文檔編號C12Q1/68GK101978076SQ200980111141
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月25日 優先權日2008年3月25日
發明者B·富爾克, L·W·M·M·特斯塔彭 申請人:維里德克斯有限責任公司