新鑒定的人類鼻病毒hrv-c和檢測hrv-c的方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：新鑒定的人類鼻病毒hrv-c和檢測hrv-c的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及鑒定和檢測人類鼻病毒.更具體地，本發明涉及表征人類鼻病 毒遺傳群C(HRV-C)的新毒株以及用于(例如通過PCR擴增)檢測HRV-C的方法和試劑盒。
背景技術：
人類鼻病毒(HRV)是普通感冒的主要原因。盡管大部分HRV感染僅引起輕微疾病， 但鼻病毒也可引起下呼吸道感染，這可在兒童、老年人以及免疫抑制患者中導致嚴重疾病。 人類鼻病毒在全球的總體患病率及其造成的經濟損失是相當可觀的。鼻病毒是小RNA無包膜病毒，屬于細小RNA病毒科(picornaviridae)。迄今為 止，在世界衛生組織(WHO)所資助的協作項目中，已經通過特異性抗血清鑒定了超過100種 鼻病毒血清型。根據鼻病毒的細胞受體使用情況，將鼻病毒分為主要群(90%)和次要群 (10% )0另一種分離方法基于對抗病毒化合物的敏感性并結合序列相似性和致病性，將病 毒分為A群和8群[1]。近年來，一些研究者鑒定到了一些新的鼻病毒，它們無法被分類為傳統的A群或 B群。McErlean等[2]篩查了 1244份鼻咽吸出物，樣品收集自2003年內由Queensland醫 院或全科醫師介紹的患者，年齡在1天到80歲，均具有急性呼吸道癥狀。在所篩查的這些 樣品中，17份鑒定出存在新的鼻病毒，作者將該新的鼻病毒命名為HRV-QPM，后者被分類 為HRV-A2。HRV-QPM的全基因組比所有其他已知的HRV要短，使用人類細胞系HeLa-Ohio、 A549、MRC-5和WI38均未能成功分離到該毒株。Kistler等[3]使用virochip測試了來自 2001年秋天至2004年12月內患有感冒癥狀的成年人的樣品。他們發現了 5種趨異的HRV， 稱為HRV‘X’，與HRV-B參照血清型相比，它們與HRV-A具有更高的序列相似性。這些趨異的 HRV ‘X’分離株無法被培養。Lee等M使用Respiratory Multicode Assay分析了來自嬰 兒的鼻灌洗物。他們發現了 5種不同毒株，并認為它們代表一種新的HRV遺傳群(HRV-C)。 在用于檢測和分離HRV的標準WI-38或MRC-5細胞培養物中，含有這些新HRV毒株的樣品無 一產生了細胞致病效應(CPE)。Lau等[5]使用RT-PCR方法篩查了一年間(2004年11月至 2005年10月)收集自住院兒童的200份鼻咽吸出物(NPA)。他們發現了 21份陽性HRV，其 屬于一種不同的遺傳群，即進化枝C，與已知的HRV-A毒株的核苷酸相同性<63%，與已知 的HRV-B毒株的核苷酸相同性< 61%。Renwick等M使用MassTag PCR研究了 2003-2006 年間來自兒童醫院的97份鼻咽吸出物。他們發現了與已知的HRVA、HRVB或人類腸道病毒 (HEV)序列不相匹配的30種HRV序列。

發明內容
本發明基于發現了新的HRV-C鼻病毒毒株，稱為BCH019，其被認為與嚴重呼吸道 疾病相關。圖1和SEQ ID NO 1給出了 BCH019的基因組序列。BCH019的基因組的結構顯 示于圖2。因此，在一個方面，本發明涉及分離的HRV-C鼻病毒，其具有RNA基因組，所述基因 組包含選自如下一組中的多核苷酸序列
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(i)SEQ ID NO :1 所代表的序列，(ii)與SEQ ID NO :1具有至少75%相同性、優選地至少80%、85%、90%或95% 相同性的序列，和(iii)⑴或(ii)所代表的序列的互補序列。此外，其基因組還包含至少一個編碼多蛋白的讀框，所述多蛋白的序列由SEQ ID NO 20代表。本發明還涉及所述病毒的核酸序列以及上述多核苷酸或其片段在設計用于檢測 樣品中的HRV-C鼻病毒的引物或探針中的用途。本發明還涉及核酸片段，所述核酸片段包含至少50個連續核苷酸、優選地至少 100、150或200個連續核苷酸或由所述至少50個連續核苷酸、優選地至少100、150或 200個連續核苷酸組成，所述連續核苷酸來自從SEQ ID NO :1的第627位核苷酸開始至 第7064位核苷酸結束的核苷酸序列或來自與從SEQ ID NO 1的第627位核苷酸開始至第 7064位核苷酸結束的核苷酸序列具有至少85%相同性、優選地至少90或95%相同性的 核苷酸序列或它們的互補序列；本發明特別涉及以下序列中的片段SEQ ID N0:21(VP4nt 627-827 (含))、SEQ ID NO :22(VP2nt 828-1613 (含))和 SEQ ID NO :23 (PCR 產物 nt 556-886 (含))以及分別與其具有至少85%相同性、優選地至少90或95%相同性的變體或 它們的互補序列。在另一方面，本發明提供用于通過PCR擴增來擴增樣品中的HRV-C毒株的引物對， 其中至少一個引物包含由位于從SEQ ID NO 1的大約第556位核苷酸至大約第886位核 苷酸的區域內的18至30個連續核苷酸、特別是18至25個連續核苷酸組成的核苷酸序列。 在優選的實施方式中，所述引物對包含SEQ ID NO :6所示的正向引物556F和SEQ ID NO 7 所示的反向引物886R。在另一方面，本發明提供用于PCR擴增樣品中的HRV-C毒株的試劑盒，其包含至少 一種本發明的上述引物對。在另一方面，本發明提供用于檢測樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括(a)從所述樣品中提取核酸，(b)擴增所提取的核酸，和(c)確定一或多種核酸序列的存在，其中所述擴增步驟例如通過使用至少一種本 發明的上述引物對通過RT-PCR進行。也可采用其他技術來擴增樣品中的靶核酸，例如，NASBA和TMA技術。樣品選自人類的口腔和鼻腔樣品(獲自鼻灌洗物、鼻咽吸出物、支氣管灌洗液、痰 液、口腔和鼻腔拭子)和病毒培養上清液。SEQ ID No :1、21、22和23列出的核苷酸序列對應于通過對基因組RNA進行反轉 錄而獲得的cDNA。在其他方面，本發明涉及(a)分離的以下蛋白質-由選自如下一組的多核苷酸序列編碼的蛋白質(i)SEQID N0:1所代表的序 列，(ii)與SEQ ID NO 1具有至少75%相同性的序列，和(iii)⑴或(ii)所定義的序列 的互補序列；或
-由多核苷酸的核酸片段編碼的蛋白質，所述多核苷酸的核苷酸序列如以上(i)、 (ii)或(iii)定義；或-包含SEQID NO 20所示氨基酸序列的蛋白質或由SEQ ID NO 20所示氨基酸序 列組成的蛋白質；(b)多肽，其氨基酸序列包含(a)中所述蛋白質的至少15個連續的氨基酸、優選 地至少20個連續的氨基酸、有利地至少30個連續的氨基酸，或由(a)中所述蛋白質的至少 15個連續的氨基酸、優選地至少20個連續的氨基酸、有利地至少30個連續的氨基酸組成；(c)對(a)或(b)中所定義的蛋白質的表位具有特異性的抗體；(d)檢測樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括將樣品與上述(a)中所定義的蛋 白質或與上述(b)中所定義的多肽相接觸，并檢測所述蛋白質或多肽與抗HRV-C抗體之間 形成的免疫復合物的存在，例如通過免疫酶學方法，包括比色法、熒光法、發光法或電化學 檢測，例如蛋白印跡、夾心免疫測定法和競爭技術；樣品優選地是選自血液、血漿和血清的 人類樣品；(e)檢測樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括將樣品與至少一種對該毒株的 HRV-C蛋白的表位具有特異性的抗HRV-C抗體相接觸，并檢測抗體/HRV-C蛋白免疫復合 物的存在，例如通過免疫酶學方法，包括比色法、熒光法、發光法或電化學檢測，例如蛋白印 跡、夾心免疫測定法和競爭技術；樣品優選地選自人類口腔和鼻腔樣品(獲自鼻灌洗物、鼻 咽吸出物、支氣管灌洗液、痰液、口腔和鼻腔拭子)和病毒培養上清液；(f)診斷HRV-C毒株的試劑盒，特征在于其包含上述(a)或(b)中定義的至少一種 蛋白質或至少一種多肽；(g)診斷HRV-C毒株的試劑盒，特征在于其包含上述(c)中定義的至少一種抗體。可通過重組技術或化學合成法產生蛋白質或多肽。抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體或它們的片段，例如Fab、Fab\ Fab' 2、scFv、Fv0根據以下附圖和具體實施方式
的詳細描述，顯然可以明了本發明的這些以及其他 方面、優勢和特征。


圖1給出了 BCH019的基因組序列。圖2顯示了 BCH019的基因組結構(A部分)和通過隨機PCR最初獲得的3個不同 克隆的位置(B部分)。圖3顯示了 HRV系統進化分析的結果基于所有已知的HRV和一些HEV的全長核 苷酸序列構建的自舉鄰位相連樹(bootstrapped neighbor-joining tree)。圖4顯示了使用靶向BCH019的蛋白質編碼區的引物獲得的PCR產物。在瓊脂糖 凝膠上分離PCR產物。發明詳述本發明基于發現了一種新的鼻病毒毒株，稱為BCH019，認為其與嚴重的呼吸道疾 病相關聯。BCHO19的全基因組序列顯示于圖1和SEQ ID NO :1。基因組表征顯示BCH019的
6全長基因組具有7121nt，包括5，-UTR(626nt)、多蛋白編碼序列(6438nt)、3，-UTR(38nt) 和polyA尾(圖2)。BCH019中的多蛋白前體的編碼區結構與所有已知的HRV相同，其具有 高度保守的翻譯起始位點(編碼MGAQVS)和對應于殼體基因VP4、VP2、VP3、VPl和非結構 基因 2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D 的區域。使用軟件MEGA 4進行系統進化分析后，構建了基于所有已知HRV和一些HEV的 全長核苷酸序列的自舉鄰位相連樹，其顯示BCH019是一種不同的鼻病毒，其屬于C群HRV 而非A群或B群(圖3)。VPl是形成殼體的峽部(canyon)和藥物結合袋(drug-binding pocket)的主要蛋白。峽部是受體結合位點。VP4基因是HRV的所有結構蛋白中最為保守 的區域。BCH019是在一位臨床診斷為支氣管肺炎的患者(樣品編號BCH019)的鼻咽吸出物 樣品中檢測到的唯一微生物，這一點提示BCH019與該患者發生的急性下呼吸道感染癥狀 之間存在密切關聯。在另一方面，本發明提供用于通過PCR擴增來特異性擴增樣品中的HRV-C毒株的 引物、試劑盒和方法。本發明的引物被設計為靶向BCH019的VP4基因周圍的區域。在本發 明的一個實施方式中，本發明的至少一個引物包含相應于從BCH019基因組序列VP4基因5’ 上游約70bp至3’下游約60bp的區域內的18-25個連續核苷酸的核苷酸序列，即從SEQ ID NO 1的約第556位核苷酸至約第886位核苷酸。在另一實施方式中，要通過本發明的引物 對擴增的區域包括VP4基因5’上游約70bp(5’ UTR的3’ -末端區域，其在所有鼻病毒中 是保守的)、整個VP4基因和VP4基因3’下游約60bp的區域(VP2基因的5’ -末端區域， 其僅在HRV-C中是保守的)。在這一實施方式中，根據該5’ UTR的3’ -末端區域(其在所 有鼻病毒中是保守的)的序列設計正向引物，同時根據VP2基因的5’ -末端區域(其僅在 HRV-C中是保守的)的序列設計反向引物。本領域人員熟知如何設計用于擴增特定核苷酸序列的引物。用于輔助設計引物的 軟件是本領域已知的，例如Vector NTI Advance 10 (Invitrogen)。設計引物需要考慮的因 素包括長度、Tm、防止形成二級結構等等，這也是本領域人員已知的。在本發明的一個具體實施方式
中，正向引物是556F(5’-ACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT C-3，，SEQ ID NO :6)，反向引物是886R(5，-TTTCCRATAGTGATTTGCTTKAGCC-3，，SEQ ID NO :7)。 該引物對所覆蓋的區域為從BCH019基因組的VP4基因5’ -上游70bp至VP4基因3’ -下 游59bp，即從SEQ ID NO 1的556位核苷酸至886位核苷酸。如實施例所示，使用了引物對556F和886R來篩查臨床樣品，結果顯示，所篩查的 一些樣品也含有屬于HRV進化枝C的鼻病毒。因此，在優選的實施方式中，本發明提供用于通過PCR擴增來擴增樣品中的HRV-C 毒株的引物對，其中所述引物對包含SEQ ID NO :6所示的正向引物556F和SEQ ID N0:7所 示的反向引物886R。 本發明還包括用于擴增樣品中的HRV-C毒株的試劑盒，其包含至少一個本發明的 上述引物對。在另一實施方式中，本發明提供用于檢測來自哺乳動物的樣品中的HRV-C毒株的 方法，其步驟包括(a)從所述樣品中提取核酸，
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(b)擴增所提取的核酸，和(c)確定HRV-C特異性核酸序列的存在，其中所述擴增步驟例如通過使用本發明的至少一個引物對進行RT-PCR擴增而進 行。可根據本發明進行測試的樣品可以是鼻灌洗物、鼻咽吸出物、支氣管灌洗液或痰 液。采用本發明的方法，可以進一步澄清并表征普通感冒的致病因素是否是HRV-C，且 因此可根據具體的致病因素對患有普通感冒的患者進行治療，這將使患者因此而獲益。
實施例實施例1 鑒定新的C群人類鼻病毒，稱為BCHO19病例介紹該新的鼻病毒毒株是從來自一名診斷為支氣管肺炎的2個月男性嬰兒的鼻咽吸 出物樣品(樣品編號BCH019)中鑒定到的。該患者針對抗CMV、EBV、HSV和CoX的IgM的檢 測均為陰性。對該鼻咽吸出物樣品進行了排除性測試，結果顯示對已知的呼吸道病毒(包 括人副流感病毒1-4、流感病毒、呼吸道合胞病毒、人類腸道病毒、人類鼻病毒、人冠狀病毒 229E、NL63、HKU1和0C43、人變性肺病毒、人腺病毒和博卡病毒)均為陰性。痰液培養中僅 發現正常菌群。從該患者的鼻咽吸出物樣品中提取核酸并通過隨機PCR進行擴增以便尋找 未知的致病微生物。隨機PCR隨機PCR可用于檢測DNA和RNA病毒基因組[7]。已經使用隨機PCR鑒定了 3種不 同的病毒人博卡病毒[8]、人KI多瘤病毒[9]和人WU多瘤病毒[1°]。隨機PCR的第一個擴增 步驟使用第一隨機引物，其具有5’端獨特核苷酸通用序列，含有用于后續克隆的限制性酶 切位點，隨后是位于3’端的簡并6聚體或7聚體序列。第一擴增步驟后，使用與第一隨機 因為的5’通用區域互補的特異性第二引物進行隨后的PCR擴增。從北京兒童醫院2007年4月的住院兒童獲得鼻咽吸出物。為了檢測那些普通致 病微生物呈陰性的呼吸道樣品，采用了以往描述的隨機PCR方法[8’11]并進行了一些改進。 簡言之，將樣品在Sigma 3k30臺式離心機上3000rpm離心10分鐘以去除細胞碎片。通過 0. 2 μ m Super Membrane ( Acrodisc 25mm Syringe Filter, Pall)過濾 200 μ 1 無細胞 上清液。加入20 μ 1的無RNase的DNase I (Promega)，經樣品在37°C溫浴60分鐘。使用 NucliSens基本試劑盒提取模塊(bi0M6rieux)提取核酸。將10 μ 1的核酸與0. 4 μ 1的通 用引物 FR26RV-N(5' -GCCGGAGCTCTGCAGATATCNNNNNN-3，，SEQ ID NO 2) (50 μ M)禾口 1. 7 μ 1 無菌去離子水混合。將樣品在65°C溫浴5分鐘，然后置于冰上冷卻。加入7. 9 μ 1反應試劑 混合物，其含有4μ 1 的 5Χ 第一鏈緩沖液(Invitrogen)、2 μ 1 的 IOOmM DTT(Invitrogen)、 1 μ 1的含濃度為IOmM的各種dNTP的溶液(Invitrogen)、8單位(0. 4 μ 1)的重組RNase抑 制劑(Ambion)和 100 單位(0. 5 μ 1)的 SuperScript II 反轉錄酶(Invitrogen)。將反應 混合物在25°C溫浴10分鐘，然后42°C溫浴50分鐘。在94°C變性3分鐘并在冰上冷卻，之 后加入 2. 5 單位(0. 5μ 1)的 3，-5，exo-Klenow DNA 聚合酶(New England Biolabs)，并將 反應混合物在37°C溫浴1小時，隨后在75°C進行酶滅活步驟10分鐘。使用5 μ 1的各反應混合物作為后續PCR的模板。50 μ 1的反應混合物含有5 μ 1 10 XExTaq緩沖液(Mg2+plus) (TaKaRa)、0. 2mM 的各種 dNTP (TaKaRa)、40pmol 特異性引物 FR20RV(5，_GCCGGAGCTCTGCAGAT ATC-3，，SEQ ID NO 3)(特異于通用引物 FR26RV-N)、和 2· 5 單位的 ExTaq (TaKaRa)。94°C 10 分鐘后，使用GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem)進行 40 個循環的擴增 (940C 1 分鐘，65 °C 1 分鐘，72 °C 2 分鐘)。PCR產物的克降和測序使用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)純化如上獲得的擴增產物。在 瓊脂糖凝膠上分離產物，切取長度在 500和2000bp之間的片段并用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)提取。純化的 PCR 產物被連接至 pMD18_T 載體(TaKaRa) 并導入化學感受態的大腸桿菌(E. colDDHlOBdnvitrogen)。細菌培養在氨芐青霉 素-X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)瓊脂板中，進行藍白篩選。挑取白色集 落并在Iml的Luria-Bertani肉湯加氨芐青霉素中培養2小時。為了隨后PCR擴增克隆的插入物，將1μ 1細菌懸液加入至PCR混合物中，該混 合物含有 0. 2 μ M 的 PMD18-T 載體引物 M13fwd(5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，，SEQ ID NO :4)和 M13rev(5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，，SEQ ID NO :5)、2mM 各種 dNTP、 2 μ IlOXExTaq緩沖液和1. 25U的Taq DNA聚合酶，總反應體積為20 μ 1。如下進行循環 1個循環的94°C 3分鐘，隨后30個循環的94°C變性30s，55°C退火30s，并在72°C延伸1分 鐘。為了避免對相同克隆的PCR產物或引物二聚體進行重復測序，僅將大于250bp且 大小不同的PCR產物送至測序公司進行測序。從樣品編號為BCH019的患者(其對所檢測的所有熟知的呼吸道病毒和細菌均為 陰性)的樣品中獲得了 185個隨機PCR克隆，發現其中有6個呈鼻病毒陽性，它們代表鼻病 毒基因組的3個不同片段。然后使用3個原始的不同克隆的序列設計新的PCR引物，以便逐 步連接缺口。使用1 μ 1提取自BCH019的核酸作為模板進行一步式RT PCR0 20 μ 1反應混 合物含有10μ1 2 X Reaction Mix (Invitrogen)，1 μ 1 Superscript IIIRT/'platinum Taq Mix(Invitrogen)，20pmol各種引物。在48°C溫育45分鐘，94°C 3分鐘之后，進行35 個循環的擴增。在瓊脂糖凝膠上觀察產物，提取產物，然后連接到PMD18-T載體。轉化至感 受態DH10B并培養，之后將含有產物的克隆送至測序公司測序。使用RACE系統擴增末端序 列，以便快速擴增cDNA末端(Invitrogen)。采用BLASTn和MEGA 4軟件分析所獲得的序列與可從GenBank數據庫中獲得的核 苷酸序列的序列相似性。表征BCH019的基因組這3個原始的不同克隆代表鼻病毒基因組的3個不同片段(圖2B)。第一個307bp， 覆蓋5，UTR/VP4區域，第二個494bp，覆蓋VP2/VP3區域，第三個635bp，覆蓋2C/3A區域。設 計了一系列PCR引物，利用它們逐步獲得了絕大多數基因組片段。然后使用Invitrogen的 RACE系統獲得基因組的5’端和3’端末端序列。這一新病毒被鑒定為鼻病毒，稱為BCH019， 其完整性基因組序列見圖1和SEQ ID NO :1。BCHO19的基因組長度為7121nt，包括5，UTR(626nt)、多蛋白編碼序列(6438nt)、 3’ UTR(38nt)和polyA尾(圖2A)。BCHO19中的多蛋白前體的結構與所有的HRV相同，其
9具有高度保守的翻譯起始位點(MGAQVS)和對應于結構蛋白VP4、VP2、VP3、VP1和非結構蛋 白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D編碼序列的區域(圖2A)。系統講化分析基于將BCHO19與所有HRV血清型(人類鼻病毒分離株NAT045 [F077280]、人 類鼻病毒分離株NAT001 [EF077279]、人類鼻病毒QPM [EF186077]、人類鼻病毒C毒株 026[EF582387]、人類鼻病毒 C 毒株 025 [EF582386]、人類鼻病毒 C 毒株 024 [EF582385]、 HRV89[NC 001617]、B [NC 001490]、93[EF173425]、52[EF173424]、37 [EF173423]、 3[EF173422]、27[EF173421]、17[EF173420]、94[EF173419]、78[EF173418]、64[EF173417]、 24[EF173416],12[EFl73415],11[EF173414]、30[DQ473512]、55[DQ473511 ]、 75 [DQ473510]、A[DQ473509]、28 [DQ473508]、53 [DQ473507]、46 [DQ473506]、36 [DQ473505]、 88[DQ473504]、7[DQ473503]、76[DQ473502]、34[DQ473501]、59[DQ473500]、44[DQ473499]、 10[DQ473498]、23[DQ473497]、49[DQ473496]、38[DQ473495]、74[DQ473494]、 15[DQ473493]、73[DQ473492]、41[DQ473491]、4[DQ473490]、70[DQ473489]、48[DQ473488]、 35[DQ473487]、6[DQ473486]、2[X02316]、39[AY751783]、14[K02121]、IB[D00239]、 16 [L24917])以及10種HEV (人類腸道病毒68 [EF107098]、人類腸道病毒70 [DQ201177]、 人脊髓灰質炎病毒1型[V01148]、脊髓灰質炎病毒2型[X00595]、人柯薩奇病毒 A2 [AY421760]、人柯薩奇病毒A6 [AY421764]、腸道孤病毒1 [AF029859]、人腸道孤病毒 6 [AY302558]、柯薩奇病毒B2 [AF081485]、和人柯薩奇病毒Al [AF499635])的完整序列進行 比對而構建系統進化樹(圖3)。發現BCH019的序列代表一種不同的新的人類鼻病毒。即便與系統進化樹中最接 近的HRV毒株HRV NAT045相比，BCH019與HRV NAT045之間的序列相似性也僅有66. 7%。 BCHO19與其他一些最近發現的鼻病毒，包括HRV-QPM ；HRV-NAT045.001 ；HRV-C 024,025和 026顯然屬于一個不同的進化枝，即HRV-C。實施例2 驗證BCH019的基因組序列為了驗證BCH019的序列，再次提取樣品BCHO19的核酸。使用新設計的針對所有推 定蛋白編碼序列的特異性引物來擴增基因。設計引物VP4(5’-ATGGGTGCACAAGTGAGTAA-3’， SEQ ID NO 8)和弓丨物 VP2R(5，-GCTATTGCTTTTGGGTTTG-3，，SEQ ID NO 9)來擴 增 VP4 和 VP2 基因(圖 4B)。設計弓丨物 VP3(5，-GGGCTACCAACCAGACTACCAA-3，， SEQ ID NO: 10)禾口 弓丨物 VP3R(5，-CGATATGTTGTTACTAGGCTGTTC-3，，SEQ ID NO: 11)來擴增 VP3 基因(圖 4D)。設計弓丨物 2A(5，-GGACCCAGTGATTTATTTGTACA-3，， SEQ ID NO: 12)和弓丨物 2BR (5，-CTGCTTGGAGGGCGGTTTA-3，，SEQ ID NO: 13)來擴 增 2A 和 2B 基因(圖 4D)。設計引物 2C(5，-CAGTGGTGATGGTTGGCTC-3，，SEQ ID NO 14)和弓丨物 2CR(5，-GCGTTGGAATATTGCATCTAG-3，，SEQ ID NO: 15)來擴增 2C 基 因(圖 4A)。設計引物 3A(5，-GATTAGGAGATTCTGAGACACCA-3，，SEQ ID NO: 16)和 引物 3CR(5，-CGCTGGGTGTCATTAAAGTATT-3，，SEQID NO: 17)來擴增 3A、3B 和 3C 基 因(圖 4D)。設計引物 3D(5，-TGCTATCACACATGTCCAAGA-3，，SEQ ID NO 18)和弓丨物 3DR(5，-GAAATTGTCAAGCCACTGC-3，，SEQ ID NO 19)來擴增 3D 基因(圖 4C)。圖4顯示了使用針對BCH019的蛋白編碼區的引物獲得的PCR產物。對每一 PCR 產物測序至少3個克隆以確保各個區域的序列的準確性。結果證實該樣品中存在鼻病毒BCHO19且序列是準確的。實施例3 檢測來自患有呼吸道感染的患者的樣品中的HRV-C設i十用干確定C群人類鼻病毒的PCR ^mVP4基因是全部結構蛋白中最為保守的區域，因此比較了所有已知HRV的該區域 的全長序列，以便設計針對HRV-C的特異性引物。設計了正向引物556F(5，-ACTACTTTGGGTG TCCGTGTTTC-3，，SEQ ID NO 6)和反向引物 886R(5，-TTTCCRATAGTGATTTGCTTKAGCC-3，，SEQ ID NO 7)，它們針對的是SEQ ID NO 1中從VP4基因5，-上游70bp至VP4基因3，-下游 59bp的區域。根據5’ UTR 3’ -末端區域的序列設計正向引物556F，該區域在所有鼻病毒 中是保守的，同時根據VP2基因5’-末端區域的序列設計反向引物886R，該區域僅在HRV-C 中是保守的。為了評估HRV-C感染的發病率，使用弓丨物556F和886R來篩查臨床樣品中HRV-C 毒株的感染證據。各樣品單獨進行提取并擴增。每一實驗設置陽性和陰性對照。使用 NucliSens基本試劑盒提取模塊(bioM6rieuX)提取核酸。使用核酸(1 μ 1)作為PCR 的模板。20 μ 1 反應試劑混合物包括10 μ 12 X Reaction Mix(Invitrogen)，1 μ 1 Superscript IIIRT/ platinum Taq Mix (Invitrogen), 20pmol 各個引物 556F (5，-ACTAC TTTGGGTGTCCGTGTTTC-3',SEQ ID NO 6)和 886R(5，-TTTCCRATAGTGATTTGCTTKAGCC-3，，SEQ ID NO :7)。48°C溫育45分鐘，94°C 3分鐘之后，進行35個循環的擴增(94°C 30秒，55 °C 30 秒，和72°C 1分鐘)。在瓊脂糖凝膠上觀察產物。預期產物的大小為330bp。對所有PCR產 物進行測序以確認它們是HRV-C特異性的。檢測HRV-C感染使用引物556F和886R篩查了來自BCH的298份樣品，又有另外13份樣品發現 HRV-C陽性(表1)。其中有12名男童，1名女童。年齡范圍在1個月6天至3歲。病例分 別來自急診室、兒科病房、兒科重癥監護室(PICU)。在8例中，鼻病毒是檢測到的唯一的呼 吸道病毒。2007年夏季(7、8、9月)無病例出現。由于C群人類鼻病毒是一個新的進化枝，迄今尚不知C群鼻病毒是否也與A群或B 群一樣具有許多類型，以及該類病毒在急性呼吸道感染患者中的分布。本發明人發現了 13 個額外的HRV-C陽性樣品。這一結果提示C群鼻病毒感染可能是常見的，且與A群或B群 鼻病毒感染相比，其臨床表現有所不同。這些結果提示，同HRV-A和HRV-B—樣，HRV-C毒 株也具有高度的遺傳多樣性。
權利要求
1.分離的HRV-C鼻病毒，其具有RNA基因組，所述基因組包含選自如下一組中的多核苷 酸序列(i)SEQID NO :1所代表的序列，(ii)與SEQID NO :1具有至少75%相同性的序列，和(iii)(i)或(ii)所代表的序列的互補序列。
2.權利要求1的病毒，特征在于其基因組包含至少一個編碼多蛋白的讀框，所述多蛋 白的序列由SEQ ID NO 20代表。
3.可從權利要求1的病毒的基因組獲得的核酸序列。
4.核酸片段，特征在于其包含至少50個連續核苷酸、優選地至少100個連續核苷酸或 由所述至少50個連續核苷酸、優選地至少100個連續核苷酸組成，所述至少50個連續核苷 酸、優選地至少100個連續核苷酸來自從SEQ ID NO 1的第627位核苷酸開始至第7064位 核苷酸結束的核苷酸序列或來自與從SEQ ID NO :1的第627位核苷酸開始至第7064位核 苷酸結束的核苷酸序列具有至少85%相同性的核苷酸序列或來自它們的互補序列。
5.權利要求4的核酸片段，特征在于其選自如下一組-SEQ ID N0:21、與SEQ ID NO :21具有至少85%相同性的序列或它們的互補序列，-SEQ ID N0:22、與SEQ ID NO :22具有至少85%相同性的序列或它們的互補序列，和-SEQ ID N0:23、與SEQ ID NO :23具有至少85%相同性的序列或它們的互補序列。
6.弓丨物對，用于通過PCR擴增來擴增樣品中的HRV-C毒株，其中至少一個引物的序列由 18-30個連續核苷酸組成，所述18-30個連續核苷酸位于從SEQ ID NO=I的大約第556位 核苷酸至大約第886位核苷酸的區域內。
7.權利要求6的引物對，其中正向引物由SEQID NO :6所示核苷酸序列組成，反向引 物由SEQ ID NO 7所示核苷酸序列組成。
8.檢測樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括(a)從所述樣品中提取核酸，(b)擴增所提取的核酸，和(c)確定一或多種HRV-C特異性核酸序列的存在，其中所述擴增步驟例如通過使用權利要求6或7所定義的至少一個引物對進行RT-PCR 擴增而進行。
9.權利要求8的方法，其中所述樣品選自人類鼻部和口腔樣品和培養上清液。
10.用于擴增樣品中的HRV-C毒株的試劑盒，其包括至少一個權利要求6或7所定義的 引物對。
11.權利要求1所定義的多核苷酸序列或其片段在設計用于檢測樣品中的HRV-C鼻病 毒的引物或探針中的用途。
12.分離的蛋白質，其由權利要求1所定義的多核苷酸序列編碼。
13.分離的蛋白質，其由具有權利要求4所定義的核苷酸序列的核酸片段編碼。
14.分離的蛋白質，其包含SEQID NO :20的氨基酸序列或由SEQ IDNO 20的氨基酸序 列組成。
15.多肽，特征在于其氨基酸序列包含權利要求12-14中任一項所定義的蛋白質的至 少15個連續的氨基酸、優選地至少20個連續的氨基酸、有利地至少30個連續的氨基酸，或由權利要求12-14中任一項所定義的蛋白質的至少15個連續的氨基酸、優選地至少20個 連續的氨基酸、有利地至少30個連續的氨基酸組成。
16.抗體，其對權利要求12-14中任一項所定義的蛋白質的表位具有特異性。
17.用于檢測樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括將所述樣品與權利要求12-14中 任一項所定義的蛋白質相接觸或與權利要求15所定義的多肽相接觸，并檢測所述蛋白質 或多肽與抗HRV-C抗體所形成的免疫復合物的存在。
18.用于檢測樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括將所述樣品與至少一種權利要 求16所定義的抗體相接觸，并檢測抗體/HRV-C蛋白質的免疫復合物的存在。
19.權利要求17的方法，其中所述樣品是選自血液、血漿和血清的人類樣品。
20.權利要求18的方法，其中所述樣品選自人類鼻部和口腔樣品和培養上清液。
21.診斷HRV-C毒株的試劑盒，特征在于其包含至少一種權利要求12-14中任一項所定 義的蛋白質或權利要求15所定義的多肽。
22.診斷HRV-C毒株的試劑盒，特征在于其包含至少一種權利要求16所定義的抗體。
全文摘要
本發明涉及人類鼻病毒遺傳群C(HRV-C)的新毒株的表征以及用于通過PCR擴增檢測HRV-C的方法和試劑盒。
文檔編號C12R1/93GK102007208SQ200980113369
公開日2011年4月6日 申請日期2009年4月16日 優先權日2008年4月17日
發明者R·岡薩雷斯, 王健偉, 申昆玲, 相子春 申請人:中國醫學科學院病原生物學研究所, 生物梅里埃公司, 首都醫科大學附屬北京兒童醫院