誘導褐色脂肪形成的方法和組合物的制作方法

專利名稱：誘導褐色脂肪形成的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本公開文本涉及治療肥胖癥以及體重相關疾病和病患的方法和組合物。更 具體地說，本公開提供了調節(例如提高)細胞或細胞群中褐色脂肪組織的脂肪形成 (adipogenesis)的方法和組合物、以及鑒定能夠分化為褐色脂肪組織細胞系或者向該細胞 系分化的細胞的方法。背景肥胖癥由于其直接或間接在諸如糖尿病、心臟病和癌癥等其他疾病的發展和發病 機理中的作用而成為了主要的全球性健康問題。肥胖癥的發生是當能量的攝入超過能量的 消耗，通常與脂肪細胞或脂肪組織的異常積累相關。脂肪組織，與肌肉和骨骼一樣，來源于中胚層，含有有絲分裂小室(mitotic compartment)，允許白色脂肪細胞(又稱為白色脂肪組織(white adipose tissue, WAT)細 胞)和/或褐色脂肪細胞(又稱為褐色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)細胞)的 生長和分化。BAT和WAT細胞均由間充質干細胞產生，這些間充質干細胞在受到適當的發育 指示引發時定型為脂肪細胞系，并被命名為前脂肪細胞。前脂肪細胞含有WAT和BAT前體 細胞或者能夠分化為BAT或WAT細胞的祖細胞。最近，在褐色脂肪前體細胞，而未在白色脂肪前體細胞中鑒定到肌原基因表達特 征(Timmons et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 104 :4401-4406, 2007),這表明 BAT 前 體細胞與WAT前體細胞不同并且能夠區分開。此外，發現褐色脂肪細胞儲存散布在小鼠，特 別是肥胖癥抗性株小鼠的后肢肌肉束之間(Almind et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.， 104 :2366-2371,2007)，表明骨骼肌可能含有能夠分化為BAT細胞或者向BAT細胞分化的祖 細胞。WAT組織是主要的儲存甘油三酯和釋放脂肪酸的部位。WAT可見于皮下，它提供絕 熱、緩沖撞擊和震動以及能量儲備。一般體態的人具有大概200到400億WAT細胞。肥胖 人含有的WAT可能比一般體態的人多10倍。BAT 細胞含有豐富的大線粒體(Nedergaard et al.，in Brown Adipose Tissue, Trayhurn and Nicholls，Eds. (Edward Arnold，Baltimore，1986))，這些線粒體作為氧化磷 酸化、中間代謝、適應性產熱、產生活性氧以及細胞凋亡的中心部位。在BAT中，長久以來已 知道線粒體生物合成伴隨著褐色脂肪細胞分化。過去10年，越來越多的證據表明線粒體完 整性的改變是造成許多人類疾病(包括肥胖癥、糖尿病、癌癥、神經退行性變)以及衰老的 原因(Duchen, Diabetes 53 (Supp 1 1) :S96_102 (2004) ；Taylor and Turnbul 1, Nat. Rev. Genet. 6 :389-402(2005) ；Lowell and Shulman, Science 307:384-387(2005))。BAT經由解偶聯蛋白-ι (UCP-I)的表達參與產熱能量消耗。BAT-依賴性能量消耗用于在寒冷時保持體溫和/或waste food energy。因此，有缺陷的或者不足的BAT經常 與肥胖癥關聯。小鼠中切除BAT導致了嚴重肥胖癥，通常還伴有胰島素抗性、高血糖癥、高 脂血癥和高膽固醇血癥，這一觀察強調出BAT對整體能量穩態的重要性(Lowell at al., Nature 366(6457) :740-2(1993) ；Hamann et al. , Diabetes.44(11) :1266-73(1995)； Hamann et al. , Endocrinology 137(1) :21_9(1996)。發明概述本文至少部分基于這樣的發現，即用一或多種骨形態發生蛋白(BMP)處理過的干 細胞抗原-1陽性(Sca-Ι+)祖細胞分化為真正的BAT細胞或者向該細胞分化。這些BAT細 胞是真正的BAT細胞，它們具有通過打開BAT細胞產熱程序而對兒荼酚胺刺激產生應答的 能力。“BMP-處理的”用在本文意味著細胞具有人工增強的BMP信號傳導(例如 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7信號傳導)水平。“人工”增強意味著通過人類直接干預提高 了 BMP信號傳導水平。可以通過本文描述的任何方法增強BMP信號傳導，例如通過用文中 描述的能夠增強BMP信號傳導的化合物，例如BMP多肽、編碼BMP的核酸、小分子和/或抗 體來處理細胞。通過本文描述的方法激活的ka-Ι+細胞群也包含在本發明中。這些細胞 可以是自體的、同種異體的或異種的。一些實施方案中，本文描述的方法可以包括用足夠提高BMP信號傳導的量的化合 物處理ka-Ι+祖細胞群(例如與之進行接觸)，從而產生BMP處理的細胞群。具體實施方案中，本文描述的方法包括將這些BMP處理的ka-Ι+細胞移植給受 試對象。可以將BMP-處理的ka-Ι+細胞直接移植或者在細胞可附著其上的支架、基質或 其他可移植裝置(實例包括由膠原蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、醋酸纖維素、硝酸纖維素、多 糖、纖維蛋白、明膠以及它們的組合制成的載體)上給予。一般來說，方法包括移植BMP處 理的^^-1+細胞群，所述細胞群包含足夠提高受試對象中褐色脂肪組織發生的細胞數量， 例如將受試對象的BAT量提高至少1%，例如2%、5%、7%、10%、15%、20%、25%或以上。一些實施方案中，方法包括提供純化的ka-Ι+祖細胞群(例如，其中至少60%、 例如70 % ,80^^90%是&￡1-1+祖細胞的細胞群)；如本文所述將這些細胞與能夠提高 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7中的一種或多種的表達水平或活性的化合物進行接觸，從而產 生BMP處理的細胞。能夠提高BMP-2、-4、-5、_6和/或_7信號傳導的化合物可以是例如以下的一種 或多種(a)BMP_2、_4、_5、_6和/或_7多肽或者其功能性片段或變體，優選活性(例如， BMPR-I和/或BMPR-II活化)BMP-2、-4、-5、_6和/或-7多肽或其功能性片段或類似物 (例如，成熟BMP-2、-4、-5、-6和/或-7多肽，例如文中描述的成熟BMP-2、-4、-5、-6和/ 或-7多肽)；(b)能夠(通過例如提高或穩定BMP-2、-4、-5、_6和/或_7與其受體的結合) 提高BMP-2、-4、-5、-6和/或-7的活性(例如BMPR-I和/或BMPR-II活化活性)的 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7的肽或蛋白質激動劑；(c)模擬BMP-2、-4、_5、_6和/或_7信號傳導活性，例如BMPR-I和/或BMPR-II 結合活性，或SMAD磷酸化活性的小分子或蛋白模擬物；
(d)通過例如結合BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的啟動子區域而提高 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7的表達的小分子；(e)抗體，例如能夠結合BMP-2、-4、_5、_6和/或_7并穩定或協助BMP-2、-4、_5、_6 和/或-7與BMP-2、-4、-5、-6和/或-7結合伙伴(例如本文描述的BMP-2、-4、-5、-6和 /或-7受體)的結合的抗體。在一些實施方案中，結合BMP-2、-4、-5、-6和/或_7的抗體 是單克隆抗體，例如人源化的嵌合單克隆抗體或人的單克隆抗體；或者(f)編碼BMP-2、-4、-5、_6和/或_7或其功能性片段或類似物的核酸。所述核酸 可以是基因組序列或cDNA序列。在一些實施方案中，所述化合物是BMP-2、-4、-5、_6和/或_7多肽或核酸。 “BMP-2、-4、-5、-6和/或-7多肽或核酸”用于本文是如本文描述的BMP-2、-4、-5、-6和/ 或-7多肽或核酸，例如成熟人BMP-2、-4、-5、-6和/或-7多肽或其活性片段，或者編碼成 熟人BMP-2、-4、-5、-6和/或-7多肽或其活性片段的核酸。在一些實施方案中，所述化合物是BMP-2多肽，例如人BMP-2，例如成熟BMP-2多 肽，例如包含SEQ ID NO 1中氨基酸觀3-396的BMP-2多肽。所述多肽可以是重組多肽。在一些實施方案中，所述化合物是BMP-4多肽，例如人BMP-4，例如成熟BMP-4多 肽，例如包含SEQ ID NO :2中氨基酸四3-408的BMP-4多肽。所述多肽可以是重組多肽。在一些實施方案中，所述化合物是BMP-5多肽，例如人BMP-5，例如成熟BMP-5多 肽，例如包含SEQ ID NO 3中氨基酸323-454的BMP-5多肽。所述多肽可以是重組多肽。在一些實施方案中，所述化合物是BMP-6多肽，例如人BMP-6，例如成熟BMP-6多 肽，例如包含 SEQ ID NO :4 中氨基酸 374-513、SEQ ID NO :4 中氨基酸 382_513、SEQ ID NO: 4中氨基酸388-513或者SEQ ID NO 4中氨基酸412-513的BMP-6多肽。所述多肽可以是 重組多肽。在一些實施方案中，所述化合物是BMP-7多肽，例如人BMP-7，例如成熟BMP-7多 肽，例如包含SEQ ID NO 5中氨基酸四3-431的BMP-7多肽。所述多肽可以是重組多肽。在一些實施方案中，所述化合物是編碼BMP-2、-4、-5、_6和/或_7多肽或者其 生物活性片段或類似物的核酸。BMP核酸可以包括BMP-2、-4、-5、_6和/或-7編碼區； 啟動子序列，例如來自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或另一個基因的啟動子序列；增強 子序列；非翻譯調控序列，例如5 ‘非翻譯區(UTR)，例如來自BMP-2、-4、-5、_6和/或-7 基因或另一個基因的5' UTR，例如3' UTR，例如來自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或 另一個基因的3' UTR;多腺苷酸化位點；隔離子序列。在另一個實施方案中，通過提高內 源BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的表達水平來提高BMP-2、-4、-5、_6和/或-7蛋白 的水平，例如通過提高BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的轉錄或者提高BMP-2、-4、-5、-6 和/或_7mRNA的穩定性。在一些實施方案中，提高BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的轉 錄是通過改變內源BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的調控序列，例如通過加入陽性調控 元件(比如增強子或轉錄激活因子的DNA結合位點)；刪除陰性調控元件(比如轉錄抑制 因子的DNA結合位點)和/或將內源調控序列或其中的元件用其他基因的替換，從而允許 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的編碼區被更有效地轉錄。一些實施方案中，所述核酸編碼或提高BMP-7的轉錄。一些實施方案中，本發明描述了 BMP處理的ka-Ι+祖細胞群。在一些實施方案中，所述細胞被基因工程化從而穩定或者瞬時表達水平提高的文中所述BMP-2、-4、-5、-6和/ 或-7多肽。所述細胞可以是例如培養的哺乳動物細胞，例如人細胞。在一些實施方案中， 所述細胞被基因工程化從而還表達至少一種其他蛋白，例如非BMP-2、-4、-5、-6和/或-7 多肽，和/或第二(或更多)BMP蛋白。表達的BMP-2、-4、-5、_6和/或-7多肽通常與干 細胞是相同物種，例如在人細胞中表達的人BMP。在一些實施方案中，所述細胞被永生化，例 如能夠在培養基中無限地自我更新。本發明的一個方面提供了提高體外細胞群中具有褐色脂肪組織(BAT)細胞特征 之細胞的數量的方法。這些方法包括獲得本文公開的包含干細胞抗原-1陽性(ka-1+)、 CD45陰性、Mac-I陰性的祖細胞的細胞群；以及將所述體外祖細胞群與足夠量能夠促進骨 形態發生蛋白BMP-2、-4、-6或-7中一或多種的表達的化合物接觸，接觸時間足以使所述細 胞群中具有褐色脂肪組織(BAT)細胞特征的細胞的數量增加；或者將所述細胞群進行基因 工程化從而使BMP-2、-4、-6或-7中一或多種表達水平足以將所述細胞群中具有BAT細胞 特征的細胞數量提高。本發明的另一方面提供了促進受試對象褐色脂肪組織形成的方法。這些方法包括 挑選需要處理的受試對象；獲得本文公開的包含干細胞抗原-1陽性(Sca-1+)、CD45陰性、 Mac-I陰性的祖細胞的細胞群；和將所述體外祖細胞群與足夠量能夠促進骨形態發生蛋白 BMP-2、-4、-6或-7中一或多種的表達的化合物接觸，接觸時間足以使所述細胞群中具有褐 色脂肪組織(BAT)細胞特征的細胞的數量增加；或者將所述細胞群進行基因工程化從而使 BMP-2、-4、-6或-7中一或多種表達水平足以將所述細胞群中具有BAT細胞特征的細胞數 量提高；以及將所述細胞群給予受試對象，所述方法在受試對象中有效地提高所述受試對 象具有BAT細胞特征的細胞的數量。本發明又一方面提供了通過本文描述的方法制備的細胞群，以及包含這些細胞群 和可藥用載體的藥物組合物。本發明再一方面提供了細胞遞送系統。這些細胞遞送系統包括儲存容器，所述儲 存容器含有通過本文描述的方法制備的一或多種細胞、可藥用載體，以及與儲存容器有液 相接觸的遞送裝置，例如針頭或插管(套管)。本發明還有一個方面提供了包含產熱BMP處理的干細胞抗原-1陽性(Sca-Ι+)細 胞群的組合物。一些情況中，這些細胞能夠非顫抖地產熱。“治療”用于本文意味著使疾病或病癥被緩解或發生其它有益性改變的任何方式。 用于本文，特定病癥的癥狀緩解是指因為通過發明所述組合物和方法的治療或者與這種治 療有關而發生的癥狀的任何減輕，無論是永久性還是暫時的，長效的還是瞬間的。名詞“有效量”和“有效治療”用于本文是指本文描述的一或多種組合物的量或者 濃度使用一段時間(包括急性或慢性給藥以及周期性或連續性給藥)就造成預期效果或生 理結果的給藥目的而言是有效的。名詞“受試對象”貫穿在說明書中用于描述被給予了根據發明所述方法進行的治 療的動物(人或非人動物、嚙齒類或非嚙齒類動物)。獸醫和非獸醫應用均被考慮到。該名 詞包括但不限于哺乳動物，例如人、其他靈長類動物、豬、諸如小鼠和大鼠的嚙齒類、兔、豚 鼠、倉鼠、牛、馬、貓、犬、綿羊和山羊。典型的受試對象包括人、農場動物和諸如貓和犬的寵 物。在一些實施方案中，所述受試對象是哺乳動物。在一些實施方案中，所述受試對象是人受試對象，例如肥胖的人受試對象。在一些實施方案中，所述受試對象是非人哺乳動物，例 如實驗單位、伴侶動物或食用動物，例如養來作為食品的牛、豬或綿羊。用于本文中“分離的”或“純化的”多肽、肽或蛋白基本不含有來自所述蛋白所來 源的細胞或組織來源的細胞物質或其它雜蛋白，或者在化學合成的情況下基本不含化學前 體或其他化學物質。“基本不含有”意味著選定蛋白的制品含有低于干重大約30% (例如 低于20%、10%或5%)的非選定蛋白或化學物質前體。這種非選定蛋白在文中也稱為“污 染蛋白”。當分離的治療蛋白、肽或多肽是重組產生的時，它們可以基本不含有培養基，即培 養基代表蛋白制品中低于大約20% (例如低于大約10%或5%)的體積。“肥胖癥(obesity) ”用在本文是指受試對象的一種病癥，其中受試對象的體重超 過根據標準表格中他們的理想體重的20%或以上，例如25%、30%、40%、50%或更多。肥 胖還可以表示體質量指數(BMI) 30或以上(例如30-35、35-40或更高)的受試對象。例 如，被診斷為I度肥胖的受試對象BMI范圍為30-34. 9。II度肥胖受試對象BMI范圍為 35.0-39.9。III度肥胖受試對象BMI大于40。“超重”用于本文是指BMI范圍在25. 0-29. 9的受試對象。用于本文，“干細胞”既能夠自我更新也能分化為許多不同細胞系(是多能的)。 “祖細胞”是指具有與干細胞表現型類似表現型的干細胞亞類。祖細胞能夠自我更新，通常 是多能的。除非另有定義，本文使用的所有科技名詞均與本發明所屬技術領域的普通技術人 員通常所理解的意義相同。文中描述了用于本發明的方法和材料，也可以使用本領域已知 的其他合適的方法和材料。這些材料、方法和實例僅用于闡述，并非用于限制。文中提及的 所有出版物、專利申請、專利、數據庫輸入以及其他參考文獻均通過引用全文并入本文。有 沖突的情況下，根據本說明書包括其中的定義。由以下詳細描述和附圖以及權利要求可以容易地看出本發明的其他特性和優點。


圖IA是含有褐色前脂肪細胞的培養皿圖像集。圖IB是白色前脂肪細胞的圖像集。所述細胞用指明的骨形態發生蛋白(BMP)處 理，并用油紅(Oil Red) 0染色來評價脂質累積。對照細胞未暴露于BMP。染色深(顯示為 紅色)的細胞顯示脂質累積。圖2A的條形圖顯示利用定量RT-PCR評估的接觸了指定BMP的褐色前脂肪細胞中 解偶聯蛋白(uncoupling protein,UCP)和誘導細胞死亡的DFF45樣效應因子A(CIDEA)的 表達。對照細胞未暴露于 BMP。< 0. 001, **P < 0. 01, *P < 0. 05o圖2B是用UCP-I和β-微管蛋白的特異抗體探測的免疫印跡圖像。β-微管蛋白 顯示為上樣對照。圖3Α和;3Β顯示油紅0染色的對照細胞㈧和暴露于ΒΜΡ-7的細胞⑶的照片。 染色深(顯示為紅色)的細胞顯示脂質累積。兩幅圖像中還可以清楚看到脂肪滴。圖4Α的條形圖顯示了利用定量RT-PCR評價的對照細胞和暴露于ΒΜΡ-7的細胞中 過氧化物酶體增殖物激活受體、(PPARY)、脂肪酸結合蛋白4(aP》、脂肪酸合成酶(FAS)、 CIDEA和UCP-I的表達。結果表示為相對于對照細胞的百分比增長。
圖4B的條形圖顯示了對照細胞和暴露于BMP-7的細胞中cAMP誘導的UCP-I表達。 顯示單獨UCP-I處理的條形作為cAMP的對照條形。圖5A-5C是從骨骼肌分離的經BMP7處理的細胞的圖像，其中所述細胞用 油紅-O(ORO)染色來評價脂累積。對照細胞未暴露于BMP。染色深(顯示為紅色)的細胞 顯示脂質累積。圖6A的散點圖顯示了利用FACS獲得的Sca-I+/⑶45-/Mac-l-細胞群體。圖6B-6C的線形圖顯示利用流式細胞術評價的ka-l+/CD45-/Mac-l-細胞表面上 各種標記物的有無。箭頭顯示被染色的細胞。圖7A-7N的線形圖顯示了利用定量RT-PCR在暴露于BMP-7的細胞中隨時間檢測 到的標記物水平。箭頭顯示在暴露于BMP7的細胞中觀察到的結果。圖8的條形圖顯示對照細胞和暴露于BMP-7的細胞中cAMP誘導的UCP-I表達。單 獨UCP-I處理得到的條形圖作為cAMP的對照條形。圖9A-F是一組6張顯微照片。9A、9C和9E顯示了未經BMP7處理(對照)的分離 自肩胛間BAT(BAT) (9A)、皮下白色脂肪組織(SQ-WAT) (9C)和內臟白色脂肪組織(EPI-WAT) (9E)的^^-1+細胞。9B的細胞分離自肩胛間BAT(BAT)、9D的細胞分離自皮下白色脂肪組 織(SQ-WAT)、9F的細胞分離自內臟白色脂肪組織(EPI-WAT)，它們均經BMP7處理(BMP7)。圖10A-10B的條形圖顯示了分離自肩胛間BAT(BAT)、皮下白色脂肪組織(SQ-WAT) 和內臟白色脂肪組織(EPI-WAT)的細胞中脂肪酸合成酶(FAS ；Α)和解偶聯蛋白-1 (UCP-1 ； B)的表達水平。圖11是顯示從肥胖抗性小鼠(129)和肥胖傾向小鼠(B6)中分離的總細 胞的條形圖。圖12A-12B的條形圖顯示了從肥胖抗性小鼠(129)和肥胖傾向小鼠(B6)中分離 的經BMP處理的ka-Ι+細胞中UCP-I和PPAR γ的表達水平。圖13A-13D是熒光顯微圖像。13Α和顯示了移植的經ΒΜΡ7處理的綠 色熒光蛋白細胞在移植10天后的圖像。不含有移植細胞的對照圖像見13A和13C。移植的 GFP細胞在右側(圖1 和13D)顯示，細胞表現出顏色更深。圖14A-14F的圖像顯示移植了經BMP7處理的綠色熒光蛋白細胞的脂肪塊 的顯微切片。切片來自非綠色熒光蛋白陽性的受體小鼠。注射后第10天在受體小鼠中通 過落射熒光(印ifIuorescence)檢測到綠色熒光蛋白陽性的細胞。原始放大倍數=200X。圖15A-15F的條形圖顯示用BMP-7、BMP-3、BMP-4或載體對照(C)處理過的來源于 肌肉的ka-Ι+細胞中UCP-I、Cidea、PPARg、FAS、肌細胞生成素(Myogenin)和MyoD的表達 水平。發明詳述本公開提供了尤其是可用于提高受試對象BAT水平和/或功能的組合物以及方 法，從而給受試對象治療肥胖癥和體重相關的疾病和病癥，比如下文提到的狀況。這些方 法包括促進祖細胞的特定亞組(例如能夠分化為BAT細胞的祖細胞)分化為BAT細胞系 或者向該細胞系分化。更具體地說，本公開至少部分基于這樣的發現，即用骨形態發生蛋白 (BMP)處理過的干細胞抗原-1陽性(Sca-Ι+)祖細胞能夠分化為BAT細胞系或者向該細胞 系分化。正如本文描述的，這些組合物和方法可以用于增加BAT細胞數量和/或功能和/或提高BAT WAT細胞的比率，從而治療受試對象的肥胖癥和肥胖相關的疾病和病癥。本文描述的一些方法包括移植BMP處理的ka-Ι+祖細胞，所述祖細胞已用能夠提 高BMP信號傳導的試劑處理過。一般來說，所述方法包括用足夠提高BMP信號傳導的量的化 合物處理(例如與之進行接觸)祖細胞，例如ka-Ι+祖細胞群，然后將BMP活化的ka-1+ 細胞(例如至少一個細胞或一群這類細胞)移植給受試對象。合適的試劑可以包括BMPs 本身(例如重組蛋白或編碼BMP的核酸)和/或能夠提高BMP信號傳導的試劑，例如小分 子、抗體和抗體片段、藥劑和其他生物試劑。在一些實施方案中，處理細胞包括將細胞體外 基因工程化從而表達BMP 2、-4、-5、-6和/或-7多肽。然后將細胞給予受試對象。這類 基因工程化的ka-Ι+祖細胞群也包含在本發明范圍內。其他化合物在文中有描述。細胞類型適合用在本文描述的方法中的細胞包括干細胞抗原-1陽性(Sca-Ι+)祖細胞，例 如哺乳動物ka-Ι+祖細胞。Sca-I是18_kDa的糖基化磷脂酰肌醇錨定的表面蛋白，該蛋白 可作為造血干細胞和存在于組織中的祖細胞的干細胞標記物。可用于本公開的ka-Ι+祖 細胞可以從多種組織和器官中分離，包括但不限于例如骨骼肌、前列腺、真皮、心血管系統、 乳腺、肝、新生兒皮膚、顱蓋(calvaria)、骨髓、小腸和脂肪組織(例如脂肪組織沉積)。在 一些實施方案中，Sca-I+細胞分離自骨骼肌，例如骨骼肌肌束。在一些實施方案中，Sca-I+ 細胞分離自脂肪組織，例如脂肪蓄積。ka-Ι+祖細胞可以是單能性的、多能性的和全能性的，并且可以來源于間充質。在 一些實施方案中，ka-Ι+祖細胞是非肌原性的祖細胞。在一些實施方案中，ka-Ι+祖細胞 可以是人工來源于(例如分化或部分分化)非多能細胞的多能干細胞。這類細胞在本領 域被稱為誘導多能干細胞，通常縮寫為iPS或iPSCs (綜述可參見例如Nishikawa et al.， Mol. Cell. Biol.，9 :725-729, 2008)。ka-1+祖細胞通過確定一或多種細胞表面表達標記物的存在與否來鑒定。可 以用于鑒定ka-Ι+祖細胞的示范性細胞表面標記物包括，但不限于ka-1、CD45、Mac-U CM9 (整聯蛋白 β 1)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、CD166 (ALCAM)、結蛋白(desmin)、 波形蛋白(vimentin)和 c_kit。在一些實施方案中，可以通過檢測Sca-I來鑒定陽性細胞。替代地或者 此外，可以通過檢測其他細胞表面標記物來鑒定ka-Ι+祖細胞。在一些實施方案中，可 以用于本文描述的方法的ka-Ι+祖細胞是細胞表面標記物CD45和/或Mac-I陰性的，例 如細胞可以是 ka-l+/CD45_、Sca-1+/Mac-1 或 ka-l+/Cd45-/Mac_l-。在一些實施方案 中，ka-Ι+祖細胞可以是ka_l+/CD29+細胞。在一些實施方案中，祖細胞可以是 ka-l+/Q^9+/Cd45-/Mac-l-細胞。在一些實施方案中，祖細胞可以是帶有以下細 胞表面標記物⑶四+、CD;34+、Cd45-、Mac-I-和CD117-中的一或多種的細胞。在一些實施方案中，鑒定到ka-Ι+祖細胞之后，可以鑒定ka-Ι+祖細胞表面上 的其他細胞表面標記物，從而例如進一步表征和/或確認細胞系的身份。例如，可以評價 Sca-I+細胞來確定其他標記物的細胞表面表達，所述標記物包括但不限于例如CM9 (整聯 蛋白β 1)、CD105(內皮糖蛋白)、⑶166 (ALCAM)、結蛋白、波形蛋白、⑶34，⑶133和c-kit。一旦鑒定出某細胞群具有指定的細胞表面標記物(例如，Sca-Ι)，用于這類細胞 群的鑒定、分離和富集的方法是本領域常規和已知的。這些方法包括例如，免疫磁性細胞分選、熒光激活細胞分選(FACS)、附著到組織培養板和瓶上，或者在利用所需干細胞生長的條 件下進行培養，以及這些方法的組合。利用這些方法，可以分離、純化和/或富集ka-Ι+祖 細胞或ka-Ι+細胞群，例如這樣的ka-Ι+祖細胞群，其中至少60%，例如70%、80%、90% 或更多的細胞是細胞。在一些實施方案中，可以不經過細胞的鑒定、分離和/或富集獲得ka-Ι+細胞。例 如^^-1+細胞可以從細胞保藏機構獲得，例如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)。在一些實施方案中，可以利用標準細胞培養技術對分離的^^-1+細胞、克隆或細 胞群進行培養從而獲得更大量的所述細胞。在一些實施方案中，Sca-I+細胞可以保存在液氮中。為細胞保存在液氮中做準備 的技術以及在液氮中保存這些細胞的方法在本領域是常規已知的。名詞“原代細胞”包括從哺乳動物組織來源分離的細胞懸浮液中存在的細胞(在 它們被培養，即附著到諸如平板或培養瓶的組織培養基質之前)、來源于組織的外植體中存 在的細胞，包括第一次培養的細胞類型和來源于這些培養細胞的細胞。名詞“次級細胞”或 “細胞株”是指所有隨后的培養步驟中的細胞。次代細胞是由已被傳代一或多次的次代細胞 構成的細胞株。原代和次代干細胞可以從多種組織獲得，包括可以在培養物中保持和繁殖的細胞 類型。優選從被給予BMP處理細胞的受試對象或動物中獲取原代細胞。但也可以由供體 (例如，不是受體的受試對象，通常是相同物種，優選免疫相容的受試對象)獲取原代細胞。 獲得和培養這些細胞的方法是本領域已知的。所述方法可以包括允許^^-1+祖細胞進行足夠輪的倍增，例如產生所需大小的 克隆細胞株或者異質細胞株，例如細胞株達到足夠數量以便給受試對象提供治療效果，或 者足夠數量從而在BMP活化之前或之后建立穩定的細胞系。細胞沒有轉染而是用BMP處理 時，可以在沒有BMP的情況下將細胞培養一段時間，然后在移植到受試對象之前，在有BMP 的情況下培養一段時間(例如，1、2、3或更多天)。細胞可以在移植前進行清洗(例如在等 滲PBS中)以便在移植前除去所有污染物，包括BMP或生長培養基成分。所需細胞數量不 同，取決于多種因素，包括但不限于轉染細胞的用途、外源DNA在轉染細胞中的功能水平、 轉染細胞的植入部位(例如，可以使用的細胞數量受到植入解剖部位的限制)以及受試對 象的年齡、表面積和臨床狀況。在一些實施方案中，BMP處理干細胞群包括至少107、108、109 或更多細胞。BMP處理的ka-Ι+細胞是具有增強的BMP信號傳導(例如BMP-2、_4、-5,-6和/ 或-7)水平的ka-Ι+細胞，其中BMP信號傳導水平通過直接的人類干預被提高。可以通過 本領域已知的或者本文描述的任何方法增強細胞內的BMP信號傳導，例如通過用能夠增強 BMP信號傳導的化合物，例如BMP多肽或核酸來處理細胞。通過本文描述的方法活化的干 細胞群也包含在本發明范圍中。任選地，BMP處理細胞群可以懸浮在可藥用載體中，例如用 于保存或移植。“可藥用載體”這樣的說法用在本文意圖包括與用藥和細胞活性相容的任意 和所有溶劑、培養基/介質、抗菌和抗真菌試劑、等滲劑等。一般來說，細胞被維持在無菌狀 態。給藥物活性物質使用這類培養基和試劑是已知的。除非某種常規培養基或試劑與活性 化合物不相容的情況，這類培養基都可以用于本發明的組合物中。補充性活性化合物也可以合并到組合物中。所述細胞可以是自體的、同種異體的(allogeneic)或者異種的(xenogeneic)。在 一些實施方案中，本文描述的方法可以包括從受試對象中獲得干細胞群，任選對干細胞進 行培養和/或富集以獲得純化的干細胞群，如本文所述用能夠增強BMP信號傳導的試劑處 理細胞將細胞活化，以及將細胞移植到分離它們的同一受試對象中。在一些實施方案中，細 胞是同種異體的或者異種的；如果必要，可以提供免疫抑制來防止細胞排斥。在一些實施方案中，用于本文描述的方法和組合物的ka-Ι+祖細胞表達一或多 種BMP受體，例如I型或II型BMP受體。骨形態發生蛋白(BMP)在一些實施方案中，能夠增強BMP信號傳導的化合物是全長或截短的BMPs (例如 BMPs，多肽和肽)。BMP是轉化生長因子超家族的成員，它們參與胚胎發育以及整個生命的多個關 M Ρ M (Kishigami and Mishina, Cytokine. Growth Factor. Rev. 16 :265-278(2005)； Chen et al. , Growth Factors. 22 :233-241 (2004) ；Yamamotoand Oelgeschlager, Naturwissenschaften 91 =519-534 (2004)) 已有報道顯示BMPs在脂肪細胞發育的兩個不 同階段發揮作用。首先，BMP-2和4刺激多能間充質細胞和骨髓基質細胞在合適的條件下 分化為脂肪細胞(Butterwith et al. ,Biochem. Soc Trans 24 163S (1996) ；Chen et al.， J. Cell.Biol. 142 :295-305(1998) ；Chen et al. , J Cell Biochem. 82 187-199(2001)； Tang et al. , Proc Natl. Acad Sci U S. A. 101 :9607-9611 (2004))。此外，BMPs 還刺激 已定型的白色前脂肪細胞的分化(Sottile and Seuwen, FEBS Lett. 475 :201-204(2000)； Rebbapragada et al.，Mol. Cell. Biol. 23 :7230-7242 (2003))。但是其他研究顯示，BMP-2 借助同源框基因Msx2在多能間充質祖細胞中抑制脂肪形成分化并促進骨發生(Ichida et al. ， J. Biol. Chem. 279 :34015-34022 (2004) ；S. L. Cheng et al. ， J. Biol. Chem. 278 45969-45977(2003))。BMPs結合特異I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體復合體_RIa、Rib和RII，這 些復合體通過SMAD蛋白或p38有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)進行信號傳導。BMI3s是組 織發育和形態發生許多方面中關鍵事件(包括胚胎發生過程中的骨形成、出生后生長、骨 骼的重構和再生的過程)的重要調節物。在人和小鼠組織中進行的定位研究顯示在脂肪、 心、肺、小腸、肢芽和牙齒中有各種BMPs的高水平mRNA表達和蛋白合成。BMPs曾被用于臨床治療骨和軟骨病癥或損傷。Einhorn，J. Bone and Joint Surgery 85A :82-88(2003)和 Sandhu，Spine 28(15) :S64_73 (2003)中討論了重組 BMP 的 有效臨床應用。BMP多肽(例如成熟BMP多肽)自身是可行的治療性化合物，因為BMI^s是 小的分泌蛋白，能夠進入其靶細胞并在其中發揮活性。雖然本文描述的是人蛋白，本領域 技術人員可以理解當處理細胞的預期接受者是另一物種時，可以使用來自該物種，例如牛、 豬、綿羊或山羊的同源蛋白。這些同源蛋白可以利用本領域已知的方法來鑒定，例如檢索現 有數據庫(例如Homologene數據庫)尋找目標物種中鑒定到的同源物。正如本文描述的，BMP-2、-4、_5、_6和_7參與褐色脂肪細胞分化，用 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7處理祖細胞促進褐色脂肪組織形成。因此 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7是諸如肥胖癥及相關病癥(比如糖尿病、胰島素抗性、高血糖癥、高脂血癥和高膽固醇血癥)的脂肪組織相關病癥的治療、診斷和藥物開發的針對目標。 總的來說，本文描述的方法包括將文中描述的BMP處理的ka-Ι+細胞群移植給受試對象。適合用于本文描述的方法的BMP包括BMP-2BMP-2的長度為396個氨基酸，位于人的染色體20pl2。Wozney et al.，Science 242(4885) :1528-1534(1988)中公開了人BMP-2的核苷酸和氨基酸序列。BMP2屬于轉化生 長因子-β (TGFi3)超家族。骨形態發生蛋白誘導骨形成，BMP2是常染色體顯性遺傳病-進 行性肌肉骨化癥(肌炎)的可能基因。骨形態發生蛋白2通過前肌原形成細胞中劑量依賴 性PAX3表達來調節肌細胞生成，并通過S0X9在SHM調控下在中胚層表達。人BMP-2如下所示。氨基酸38-268是TGF β前肽結構域，291-396是TGF β家族N 末端結構域。氨基酸沘3-396 是成熟肽。Wozney et al.，Science 242 :1528-1534(1988) 中提供了序列。1 MVAGTRCLLA LLLPQVLLGG AAGLVPELGR RKFAAASSGR PSSQPSDEVL SEFELRLLSM61 FGLKQRPTPS RDAWPPYML DLYRRHSGQP GSPAPDHRLE RAASRANTVR SFHHEESLEE121 LPETSGKTTR RFFFNLSSIP TEEFITSAEL QVFREQMQDA LGNNSSFHHR INIYEIIKPA181 TANSKFPVTR LLDTRLVNQN ASRffESFDVT PAVMRffTAQG HANHGFVVEV AHLEEKQGVS241 KRHVRISRSL HQDEHSffSQI RPLLVTFGHD GKGHPLHKRE KRQAKHKQRK RLKSSCKRHP301 LYVDFSDVGff NDffIVAPPGY HAFYCHGECP FPLADHLNST NHAIVQTLVN SVNSKIPKAC361 CVPTELSAIS MLYLDENEKV VLKNYQDMVV EGCGCR (SEQID NO 1)BMP-2的成熟形式每個多肽鏈中含有四個可能的N連接糖基化位點，和四個可能 的二硫鍵。參見 UniProt entry No. P12643 ;HomoloGene :926。BMP-4BMP-4誘導軟骨和骨的形成，對中胚層誘導、牙齒發育、肢體形成和骨折修復非常 重要。BMP-4前蛋白原的序列如下所示。氨基酸41-276是TGFii前肽結構域，302-408 是TGF β家族N末端結構域。氨基酸四3_408是成熟肽。Wozney et al.，Science 242 1528-1534(1988)中提供了序列。1 MIPGNRMLMV VLLCQVLLGG ASHASLIPET GKKKVAEIQG HAGGRRSGQS HELLRDFEAT61 LLQMFGLRRR PQPSKSAVIP DYMRDLYRLQ SGEEEEEQIH STGLEYPERP ASRANTVRSF121 HHEEHLENIP GTSENSAFRF LFNLSSIPEN EAISSAELRL FREQVDQGPD WERGFHRINI181 YEVMKPPAEV VPGHLITRLL DTRLVHHNVT RffETFDVSPA VLRffTREKQP NYGLAIEVTH241 LHQTRTHQGQ HVRISRSLPQ GSGNWAQLRP LLVTFGHDGR GHALTRRRRA KRSPKHHSQR301 ARKKNKNCRR HSLYVDFSDV GffNDffIVAPP GYQAFYCHGD CPFPLADHLN STNHAIVQTL361 VNSVNSSIPK ACCVPTELSA ISMLYLDEYD KVVLKNYQEM VVEGCGCR(SEQ ID NO 2)BMP-4的成熟形式在每個多肽鏈中含有四個可能的N連接糖基化位點。存在V152
#HUniProtAccession No. P12644 ;HomoloGene :7247。BMP-5BMP-5前蛋白原是如下所示具有4 個氨基酸的蛋白質。BMP-5誘導軟骨和骨形 成。Celeste et al.，Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α.，87，9843-9847，1990 中提供了它的序 列。
1MHLTVFLLKGIVGFLffSCffVLVGYAKGGLGDNHVHSSFIYRRLRNHERREIQREILSILG
61LPHRPRPFSPGKQASSAPLFMLDLYNAMTNEENPEESEYSVRASLAEETRGARKGYPASP
121NGYPRRIQLSRTTPLTTQSPPLASLHDTNFLNDADMVMSFVNLVERDKDFSHQRRHYKEF
181RFDLTQIPHGEAVTAAEFRIYKDRSNNRFENETIKISIYQIIKEYTNRDADLFLLDTRKA
241QALDVGffLVFDITVTSNHWVINPQNNLGLQLCAETGDGRSINVKSAGLVGRQGPQSKQPF
301MVAFFKASEVLLRSVRAANKRKNQNRNKSSSHQDSSRMSSVGDYNTSEQKQACKKHELYV
361SFRDLGffQDffIIAPEGYAAFYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMFPDHVPKPCCA
421PTKLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRSCGCH(SEQ ID NO 3)
成熟BMP-5蛋白被認為是SEQID NO 3中的氨基酸323-454，每個多肽鏈含有四
個可能的N連接糖基化位點和四個可能的二硫鍵。參見UniProtAccession Nos. P22003 ； Q9H547 或 Q9NTM5 ；HomoloGene :22412。BMP-6BMP-6是軟骨細胞分化的自分泌刺激物，參與胚胎神經和泌尿系統的發育，以及 肝和角化細胞的分化。BMP-6敲除小鼠能夠存活，在胸骨的骨化方面略有延遲。BMP-6(前 體)是57kD的蛋白，長513個氨基酸，位于人染色體6pM。美國專利5，187，076中公開了 人BMP-6的核苷酸和氨基酸序列。預測BMP-6是被合成為前體分子，然后切割產生132個 氨基酸的成熟多肽，其計算分子量大約15Kd。成熟形式的BMP-6每個多肽鏈含有三個可能 的N連接糖基化位點。活性BMP-6蛋白分子可能是二聚體。將BMP-6加工為成熟形式包括 二聚體化和去除N末端區，其方式與相關蛋白TGFii的加工過程(Gentry et al. , Molec. Cell. Biol. 8 :4162(1988) ；Dernyck et al. ,Nature 316 :701(1985))類似。人 BMP-6 前體 如下所示。成熟多肽被認為包括SEQ ID NO :4中的氨基酸374-513。其他活性BMP-6多肽
包括含有SEQ ID NO 4中氨基酸382-513、388_-513和412-513的多肽。
MPGLGRRAQffLCffffffGLLCSCCGPPPLRPPLPAAAAAAAGGQLL⑶GGSPGRTEQPPPSP61
QSSSGFLYRRLKTQEKREMQKEILSVLGLPHRPRPLHGLQQPQPPALRQQEEQQQQQQLP121
RGEPPPGRLKSAPLFMLDLYNALSADNDEDGASEGERQQSWPHEMSSSQRRQPPPGAAH181
PLNRKSLLAPGSGSGGASPLTSAQDSAFLNDADMVMSFVNLVEYDKEFSPRQRHHKEFKF241
NLSQIPEGEVVTAAEFRIYKDCVMGSFKNQTFLISIYQVLQEHQHRDSDLFLLDTRVVffA301
SEEGffLEFDITATSNLffVVTPQHNMGLQLSVVTRDGVHVHPRAAGLVGRDGPYDKQPFMV361
AFFKVSEVHVRTTRSASSRRRQQSRNRSTQSQDVARVSSASDYNSSELKTACRKHELYVS421
FQDLGffQDffIIAPKGYAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAP481
TKLNAISVLYFDDNSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQID NO 4) 人 BMP-6 啟動子已被表征(參見 Tamada et al.，Biochim Biophys Acta. 1998， 1395(3) :247-51)，可以用在本文描述的方法中。參見 UniProt Accession No. P22004 ； HomoloGene 1300.BMP-6 的給藥、反義治療和定量在 Boden et al. (Endocrinology Vol. 138， No. 72820-2828)中有描述。BMP-7BMP-7同樣屬于TGFii超家族。它誘導軟骨和骨形成，并且可能是造成上皮成骨這 一現象的骨生成誘導因子。BMP-7在鈣調節和骨骼穩態，以及成人腸組織的抗炎反應中發揮作用。BMP-7的序列如下所示1 MHVRSLRAAA PHSFVALffAP LFLLRSALAD FSLDNEVHSS FIHRRLRSQE RREMQREILS61 ILGLPHRPRP HLQGKHNSAP MFMLDLYNAM AVEEGGGPGG QGFSYPYKAV FSTQGPPLAS121 LQDSHFLTDA DMVMSFVNLV EHDKEFFHPR YHHREFRFDL SKIPEGEAVT AAEFRIYKDY181 IRERFDNETF RISVYQVLQE HLGRESDLFL LDSRTLffASE EGffLVFDITA TSNHWVVNPR241 HNLGLQLSVE TLDGQSINPK LAGLIGRHGP QNKQPFMVAF FKATEVHFRS IRSTGSKQRS301 QNRSKTPKNQ EALRMANVAE NSSSDQRQAC KKHELYVSFR DLGffQDffIIA PEGYAAYYCE361 GECAFPLNSY MNATNHAIVQ TLVHFINPET VPKPCCAPTQ LNAISVLYFD DSSNVILKKY421 RNMVVRACGC H(SEQ ID NO 5)氨基酸1- 是潛在的信號序列；30-431是前肽原，293-431是成熟蛋白。成熟形 式的BMP-7每個多肽鏈含有四個可能的N-連接糖基化位點，和四個可能的二硫鍵。參見 UniProtAccession No. P18075 ；HomoIoGene :20410。本文描述的組合物和方法也考慮到與以上顯示的BMP序列有至少50% (例如至 少60%、70%、80%、90%、95%、98%和99% )相同度的氨基酸序列的使用。用在文中，這 些序列也被稱為BMP。為了確定兩條序列的相同度百分比，將序列為了最佳比較而做對位排列(根據最 佳比對的需要，在第一和第二氨基酸或核苷酸序列中引入空位，并且為了進行比較，可以不 考慮非同源序列)。為了比較，對位排列的參照序列長度是至少80% (在一些實施方案中， 是參照序列長度的大約85^^90^^95%或100% )。然后對相應位點上的核苷酸或殘基進 行比較。當占據第一序列中某位點的核苷酸或殘基與第二序列的相應位點相同時，則分子 在該位點是相同的。考慮為了兩個序列的最佳比對所引入的空位的數量以及每個空位的長 度，兩個序列間的相同度百分比是序列共有的相同位點的數量的函數。對序列進行比較以及確定兩個序列的相同度百分比可以利用數學算法來實現。例 如,可以利用被并入GCG軟件包中GAP程序的Needleman和Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48 444-453)算法來確定兩個氨基酸序列之間的相同度百分比，其中使用空位罰分為12、空位 延伸罰分為4和讀框移動空位罰分為5的Blossum 62評分矩陣。Biffs可以利用重組技術或化學合成來產生。產生這類多肽的方法以及純化這類多 肽所需的方法都是本領域已知的,參見例如Sambrook and Russel, Molecular CloninR ;A laboratory Mannual(CSHL Press,3rtd Edition,2001)。可以對BMP進行修飾從而改變該蛋白的藥物代謝動力學特性。例如，所述修飾可 以導致更長的循環系統半壽期、更高的細胞攝入、向靶組織的分布改善、清除減少和/或免 疫原性下降。可以用于優化BMP的治療活性的多種措施是本領域已知的，包括化學修飾。表達系統可以將BMI3S表達為重組蛋白。對于重組蛋白，表達系統的選擇會影響到其藥物動 力學特性。表達系統之間在翻譯后加工上的差異會產生不同分子大小和電荷的重組蛋白， 而這又會影響到例如循環系統半壽期、清除率和免疫原性。蛋白質的藥物動力學特性可以 通過適當地選擇表達系統(比如選擇細菌、病毒或哺乳動物表達系統)使之優化。可以用 做治療性蛋白的表達系統的示范性哺乳動物細胞系有中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、猴C0S-1 細胞系和CV-I細胞系。
本發明的重組表達載體可以設計成便于在原核或真核細胞中表達BMP。例如，可 以在大腸桿菌、昆蟲細胞(例如，利用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表 達本發明的蛋白。合適的宿主細胞在Goeddel,Gene Exrression Technology :Methods in Enzymology, 185, (Academic Press, San Diego, CA 1990)中有更多討論。替代地,重組表 達載體可以利用例如T7啟動子調控序列和T7聚合酶在體外轉錄和翻譯。化學修飾可以通過化學方式將BMPs改變從而在保持活性的情況下，改善其藥物動力學特 性。蛋白可以被共價連接上多種部分，改變蛋白的分子大小和電荷，從而使藥物動力學特 征也被改變。所述部分優選無毒并且生物相容。在一個實施方案中，可以給蛋白共價附 著上聚乙二醇(PEG)(聚乙二醇化)。有多種PEG分子是已知的和/或可以購買的(參 見例如Sigma-Aldrich產品目錄)。聚乙二醇化可以提高蛋白的穩定性，通過表位的空 間掩蓋降低免疫原性，以及通過減少腎小球濾過而提高半壽期(參見例如Harris and Zalipsky, Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series,No. 680,American Chemical Society (1997) ；Harris et al·,Clinical Pharmacokinetics, 40 485-563，2001)。以PEG構建體的方式給藥的治療性蛋白實例包 括 Adagen (PEG-ADA)和 Oncospar (Pegylated asparaginase)。另一個實施方案中， 蛋白可以借助氨基基團類似地連接上氧化葡聚糖(參見Sieffield，Curr. Drug Targets Cardiovas.Haemat.Dis.，1 :1-22，2001)。再一個實施方案中，精氨酸寡聚物與環孢霉素A 的接合可以促進局部遞送(Rothbard et al.，Nat. Med.，旦1253-1257，2000)。此外，蛋白可以化學連接另一個蛋白，例如與載體蛋白交聯(例如經由雙功能交 聯劑)形成分子量更大的復合物，則具有更長的循環系統半壽期和更高的細胞攝入。在一 些實施方案中，載體蛋白可以是血清蛋白，比如白蛋白。另一個實施方案中，治療性蛋白可 以借助例如異基雙功能或同基雙功能交聯劑自身交聯形成同型二聚體、三聚體或更高的多 聚體(參見 Mykowski et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 :1184-1188,1998) 通過二 聚體化或三聚體化提高治療性蛋白的分子量和大小可以減少蛋白被清除。蛋白制劑也可以對蛋白制劑進行優化。例如，可以將Biffs配制在載體系統中。載體可以是 膠體系統。膠體系統可以是脂質體這種磷脂雙層介質。在一個實施方案中，在保持蛋白完 整性的情況下，治療性蛋白被包裹在脂質體中。本領域技術人員明白，有許多方法可以制備 月旨質體(參見 Lichtenberg et al. ，Methods Biochem. Anal. ,33 :337-462,1988 ；Anselem et al. , Liposome Technology, CRC Press (1993))。脂質體制劑可以延遲蛋白被清除并提 高其細胞攝入(參見 Reddy，Ann. Pharmacother. ,34 :915-923, 2000)。載體也可以是聚合物，例如生物可降解、生物相容的聚合物基質。在一個實施方 案中，治療性蛋白可以在保持蛋白完整性的同時包埋在聚合物基質中。所述聚合物可以是 天然的，比如多肽、蛋白或多糖；或者是合成的，比如多聚(α-羥基)酸。實例包括由例 如膠原蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、醋酸纖維素、硝酸纖維素、多糖、纖維蛋白、明膠以及它們 的組合制成的載體。在一個實施方案中，聚合物是聚乳酸(PLA)或聚乳酸/聚乙醇酸共聚 物(PGLA)。聚合物基質可以制備和分離成各種形式和大小，包括微球和納米球。聚合物制 劑可以使治療效果持續更長時間(參見Reddy，Ann. Pharmacother. ,M :915-923,2000)。人生長激素(hGH)的聚合物制劑已被用于臨床試驗(參見Kozarich and Rich, Chemical Biology,2 :548-552,1998)。PCT 公開文本 WO 99/15154 (Tracy et al.)、美國專利 5，674，534 和 5，716，644 (both to Zale et al.)、PCT 公開 WO 96/40073 (Zale et al.)和 PCT 公開 WO 00/38651 (Shah et al.)中描述了聚合物微球緩釋制劑的實例。美國專利5，674，534和 5，716，644以及PCT公開WO 96/40073描述了含有促紅細胞生成素顆粒的聚合物基質，其中
用鹽使顆粒抗聚集而穩定。在一些實施方案中，融合蛋白包含細胞穿膜肽序列來協助BMP進入細胞，所述肽包 括例如HIV來源的TAT肽、穿膜肽(penetratins)、transportans或hCT來源的細胞穿膜肽， 參見例如 Caron et al.，Mol Ther. 3 :310-8,2001 ；Langel, Cell-Penetrating Peptides Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL 2002) ；El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Des.，U :3597-611,2005 以及 Deshayes et al. , Cell. Mol. Life Sci. ,62 1839-49,2005。肽模擬物在一些實施方案中，BMP蛋白是肽模擬物(例如肽或非肽的肽模擬物)。合 成能夠模擬肽序列的非肽化合物是本領域已知技術。這類肽模擬物包括可以根據本領 域已知方法進行修飾產生擬肽類(ρ印tidomimetics)的BMPs。參見例如Kazmierski， W. Μ. , ed. , Peptidomimetics Protocols, HumanPress(Totowa NJ 1998) ；Goodman et al. ， eds. ， Houben-ffeyl Methods of OrRanic Chemistry:Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003)；以及 Mayo et al. , J. Biol. Chem., 278 :45746, 2003。在一些情況中，本文公開的肽和片段的這些經過修飾的擬肽類形式相對 非擬肽類肽，表現出更高的體內穩定性。制備擬肽類的方法包括用D-氨基酸對映體取代肽 序列中的一或多個，例如全部氨基酸。這種序列在文中稱為“反構型(retro)”序列。另一 個方法中，氨基酸殘基的N末端到C末端順序被反過來，因此原始肽從N端到C端的氨基酸 殘基順序變成了被修飾擬肽類中C端到N端的氨基酸殘基順序。這種序列可以稱為“反排 列(inverso)”序列。擬肽類可以是反構型，也可以是反排列形式，即文中公開的肽的“反構 型-反排列(retro-inverso)”形式。新的擬肽類可以由D-氨基酸構成，其排列使得擬肽 類從N端到C端的氨基酸殘基順序對應原始肽中C端到N端的氨基酸殘基順序。制備擬肽類的其他方法包括將肽的一或多個氨基酸殘基替換為化學屬性不同但 公認的氨基酸功能類似物，即人工氨基酸類似物。人工氨基酸類似物包括氨基酸、 β-取代的β-氨基酸(“β 3_氨基酸”)、氨基酸的含磷類似物(比如V-氨基膦酸和V -氨基三亞甲基膦酸)，以及含有非肽連接的氨基酸。人工氨基酸可以用于制成擬肽類，比 如類肽寡聚物(例如類肽酰胺或酯類似物)、β -肽、環肽、寡聚脲或寡聚氨基甲酸酯肽，或 者雜環分子。這些序列可以通過例如氨基端的生物素化和羧基端的酰胺化被修飾。本文描述的任何肽，包括文中描述的變體形式還可以包含異源多肽。所述異源多 肽可以是能夠提高其所附著的(例如象在融合蛋白中那樣融合)肽的循環半壽期的多肽。 異源多肽可以是白蛋白(例如人血清白蛋白或其部分)或者免疫球蛋白的一部分(例如 IgG的Fc區域)。異源多肽可以是能夠穿過線粒體的部分。本公開還考慮了合成性的模擬化合物。正如本領域已知的，可以通過與諸如二環己基碳二亞胺(DCC)的偶聯劑反應，將氨基基團連接到已被活化的羧基基團上合成肽。游 離氨基基團對活化羧基的攻擊導致形成肽鍵并釋放二環己脲。可能有必要保護氨基和羧基 基團之外的可能發生反應的活性基團。例如，可以用叔丁氧羰基基團阻斷含有活化羧基基 團的成分的α-氨基基團，通過將肽與稀釋酸接觸可以隨后將這個保護基團去除，留下完 整的肽鍵。利用這種方法，通過將氨基酸依次加到連接在不溶性基質(比如聚苯乙烯珠)上 不斷生長的肽鏈上，經固相法可以容易地合成肽。首先將所需肽序列的羧基端氨基酸(帶 有氨基保護基團)錨定到聚苯乙烯珠子上。然后除去氨基酸的保護基團。下一個氨基酸 (帶有保護基團)利用偶聯劑添加上。之后是清洗循環。可以按照需要重復該循環。在一些實施方案中，本公開所述模擬物是與本文描述的BMP蛋白具有序列同源性 的肽。這些模擬物包括，但不限于其中L-氨基酸被它們的D-異構體替代的肽。一種常 見的評估序列同源性，更重要的是評估統計學顯著性類似度的方法學是通過利用Lipman 和Pearson寫的算法的Monte Carlo分析獲得Z值。根據該分析，Z值大于6表明可能的 顯著性，Z值大于10被認為是統計學顯著性的(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),85 :2444-2448,1988 ；Lipman and Pearson, Science,227 :1435-1441,1985)。 更概括地說，可以利用任何已知方法來合成本文描述的BMPs和以上描述的模擬物，包括 Merrifield et al. ,Biochemistry,21 :5020-5031,1982 ；Houghten ffellings,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) ,82 :5131-5135,1985 ；Atherton, Methods in Enzymology,289 :44-66, 1997 或者 Guy and Fields, Methods in Enzymology, 289 :67-83,1997 中描沭的薟包 (tea-bag)方法學或者固相肽合成程序，或者利用商品自動合成儀。目標肽在一些實施方案中，可以將BMPs和/或BMP激動劑在體外和/或體內導靶至 ka-Ι+細胞。將化合物導靶到特定細胞類型和組織的方法是本領域已知的。例如將肽和其 他治療劑導靶到特定細胞或組織的組合物和方法包括利用可以尋靶預期目標細胞或組織 上獨特或特異的抗原或標記物的物質，例如包括但不限于抗體或抗體的抗原結合片段，以 及短的親和肽。在一些實施方案中，這類物質可以是ka-Ι和/或⑶四特異的。作為一個實例，可以利用連接BMP或BMP激動劑以及連接尋靶部分(例如 抗-Sca-I抗體或其抗原結合片段)的納米顆粒。BMP和尋靶部分可以位于相同或不同的納 米顆粒上。在一些實施方案中，組合物包含BMP和分開的尋靶部分，例如與ka-Ι尋靶部分 連接的納米顆粒。本領域已知多種生物相容納米顆粒，例如有機或無機納米顆粒。脂質體、樹狀大分 子、碳納米材料和聚合物膠束是有機納米顆粒的例子。也可以使用量子點。無機納米顆粒 包括金屬納米顆粒，例如Au、Ni、Pt和TW2納米顆粒。也可以使用磁性納米顆粒，例如!^2+ 和/或!^3+核心被葡聚糖或PEG分子包圍的10-20nm球形納米晶體。在一些實施方案中， 使用了膠體金納米顆粒，例如象 Qian et al. , Nat. Biotechnol. 26(1) =83-90(2008)；美國 專利7060121、7232474以及美國專利申請公開2008/0166706中描述的。合適的納米顆粒 以及構建和使用多功能納米顆粒的方法在例如Sanvicens and Marco, Trends Biotech., 26(8) :425-433(2008)中有討論。在所有實施方案中，納米顆粒借助功能基團附著(連接)在BMP和本文描述的尋 靶部分上。一些實施方案中，納米顆粒與包含功能基團的聚合物關聯，并且用于防止金屬氧化物各自分散開來。所述聚合物可以是合成聚合物，比如但不限于聚乙二醇或硅烷 ’天然聚 合物；或者是合成聚合物或天然聚合物的衍生物；或者它們的組合。有用的聚合物是親水 性的。在一些實施方案中，聚合物“包衣”不是包圍磁性金屬氧化物的連續膜，而是附著和 圍繞在金屬氧化物的延伸聚合物鏈的“篩網”或者“云層”。聚合物可以包含多糖及其衍生 物，包括葡聚糖、pullanan、羧基葡聚糖、羧甲基葡聚糖和/或還原羧甲基葡聚糖。金屬氧化 物可以是相互接觸的或者各自被聚合物包裹或圍繞的一或多個晶體集合。其他實施方案中，納米顆粒與非聚合物功能基團成分關聯。合成不帶有相關聚合 物的穩定、功能化的納米顆粒的方法是已知的，也涵蓋在本發明的范圍內。這類方法在例如 Halbreich et al. , Biochimie, 80 (5-6) :379_90，1998 中有描述。在一些實施方案中，納米顆粒整體大小以直徑計算低于約Ι-lOOnm，例如約 25-75nm，例如約40-60nm，或約50-60nm。一些實施方案中的聚合物成分可以是包衣的形 式，例如厚約5到20nm或更多。納米顆粒的整體大小大約15到200nm，例如約20到lOOnm， 約40到60nm ；或約60nm。抗體在一些實施方案中，可以利用抗體將BMPs導靶到ka-Ι+細胞或包含細胞 的組織上，例如選擇性地對細胞尋靶。在一些實施方案中，可以用例如能夠提高細胞內一或多種BMP的表達和/或活性 的抗體替代BMP蛋白，或者與BMP蛋白結合使用。名詞“抗體”用在文中是指全長、雙鏈免疫球蛋白分子及其抗原結合部分和片段， 包括合成的變體。典型的全長抗體包含兩個重(H)鏈可變區(文中縮寫為VH)，和兩個輕 (L)鏈可變區(文中縮寫為VL)。名詞抗體的“抗原結合片段”用于本文是指全長抗體中保 持與目標特異結合的能力的一或多個片段。抗原結合片段的實例包括，但不限于(i)Fab 片段，由VL、VH、CL和CHl結構域片段構成的單價片段；(ii)F(ab‘ )2片段，由兩個通過二硫 鍵在鉸鏈區連接的Fab片段構成的二價片段；(iii)Fd片段，由VH和CHl結構域構成；(iv) Fv片段，由抗體一個臂的VL和VH結構域構成；(ν) dAb片段(Ward et al.，Nature 341 544-546(1989))，由VH結構域構成；以及(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，盡管Fv片 段的兩個結構域-VL和VH是由不同基因編碼的，可以利用重組技術，通過合成連接肽將它 們連接起來，使它們被產生為一個蛋白鏈，其中VL和VH區聯合形成單價分子(被稱為單鏈 Fv(scFv)；參見例如 Bird et al. Science :423_426，1988 ；以及 Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883,1988)。這種單鏈抗體也涵蓋在名詞“抗原結合片段” 中。抗體和抗體片段的制備在本領域已有很好的記載。參見例如Harlow and Lane, 1988.Antibodies, A L aboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York :CoId Spring Harbor Laboratory。例如 Jones et al. ,Nature321 :522_525，1986，該文章公開了用小鼠 抗體的⑶R取代人抗體的⑶R。Marx, Science 229 =455-456,1985討論了具有小鼠可變區 和人恒定區的嵌合抗體。Rodwell，Nature 342 :99-100,1989討論了來源于抗體CDR信息 的較低分子量識別元件。Clackson，Br. J. Rheumatol. 3052 :36-39,1991討論了基因工程化 的單克隆抗體，抗體包括Fv片段衍生物、單鏈抗體、融合蛋白嵌合抗體和人源化嚙齒類動 物抗體。Reichman et al. ,Nature 332 :323-327,1988討論了其上移植了大鼠高變區的人抗體。Verhoeyen, et al. ,Science 239 :1534-1536,1988教導了將小鼠的抗原結合位點移 植到人抗體上。小分子藥物一些實施方案中，本發明提供了促進BMP蛋白表達或活性的藥物(例如小分子藥 物)。一些實施方案中，這類小分子藥物可以利用本文描述的藥物篩選方法來鑒定。在優選 實施方案中，本發明的小分子藥物促進細胞中的BMP活性和/或表達。一些實施方案中，小 分子藥物是利用以下描述的藥物篩選方法鑒定的。在一些實施方案中，BMP激動劑是美國專利7，482，329中公開的分子或其擬肽。BMP 核酸ka-Ι+祖細胞源可以例如轉染外源核酸，所述外源核酸包含異源核苷酸序列，例 如編碼BMP-2、-4、-5、-6和/或-7或其激動劑，以及有或沒有編碼信號肽的核苷酸序列， 并在一段時間內瞬時或穩定地產生所編碼的產物。異源氨基酸還可以是調控序列，例如啟 動子，該調控序列導致內源BMP-2、-4、-5、-6和/或-7序列的表達，例如組成型或誘導型 表達或者上調它們的表達。可以通過例如美國專利5，641，670 (其內容通過引用并入本文) 中描述的同源重組將內源核酸序列導入原代或次代細胞。轉染細胞還可以包含編碼可選擇 標記物的DNA，所述標記物賦予它們用于挑選的表現型，協助其鑒定和分離。在一些實施方案中，文中描述的可以增強BMP信號傳導的化合物包括，例如BMP核 酸，例如BMP-2、-4、-5、-6和/或-7編碼序列或其活性片段，以及任何下述序列啟動子 序列，例如來自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或者另一個基因的啟動子序列；增強子序 列，例如5'非翻譯區(UTR)，例如來自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或另一個基因的 5' UTR, 3' UTR，例如來自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或另一個基因的3' UTR ；多腺 苷酸化位點；隔離子序列(insulator sequence)；或另一種能夠提高ΒΜΡ_2、-4、-5、_6和/ 或-7的表達的序列。本文描述的核酸，例如編碼如文中所述BMP-2、-4、-5、_6和/或_7多肽的核酸， 可以引入基因構建體。本文描述的方法可以利用這類表達載體在特定的細胞類型(例如干 細胞，例如多能間充質干細胞)中體外轉染和表達本文描述的BMP-2、-4、-5、-6和/或-7 多肽。包含BMP核酸序列的表達構建體可以放在任何有效載體中給予，例如能夠有效地將 帶有的基因體內遞送給細胞的任何制劑或組合物。措施包括將基因插入病毒載體，包括重 組逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、痘病毒、α病毒和單純皰疹病毒-1，或者重組 細菌或真核細胞質粒。病毒載體可以直接轉染細胞；質粒DNA的遞送可以用裸DNA或者在 例如陽離子脂質體(Lipofectamine)或其衍生物(例如偶聯了抗體)、多聚賴氨酸偶聯物、 短桿菌肽S、人工病毒被膜或其他這類胞內載體的幫助下進行，也可以體內進行基因構建體 或CaP04沉淀的直接注射。在一些實施方案中，表達載體是含有一或多個BMP核酸序列(例如cDNA)的病毒 載體。用病毒載體感染細胞的優勢是靶細胞中的一大部分可以接收到核酸。此外，病毒載 體中編碼的分子，例如病毒載體中含有的cDNA所編碼的分子可以在攝入病毒載體核酸的 細胞中有效地表達。逆轉錄載體和腺相關病毒載體可以作為體內轉移外源基因，特別是轉移到人體中 的重組基因遞送系統。這些載體能夠將基因有效地遞送到細胞內，被轉移的核酸穩定整合到宿主的染色體DNA中。只會產生復制缺陷型逆轉錄病毒的專門細胞(稱為“包裝細 胞”)的發展提高了逆轉錄病毒在基因治療中的用途，缺陷型逆轉錄病毒用于為基因治療目 的而進行的基因轉移已有研究(在 Hu and Pathak, Pharmacol. Rev. 52 :493-511 (2000)； Young et al. , J. Pathol. 208 =229-318 (2006)中有綜述)。復制缺陷型逆轉錄病毒可以 包裝成毒粒，毒粒可以用于通過標準技術借助輔助病毒來轉染靶細胞。產生重組逆轉錄病 毒和用這些病毒體外或體內轉染細胞的試驗方案可以在Ausubel，et al.，eds.，Current Protocols in Molecular RioIory, Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9. 10-9. 14和其他標準實驗手冊中找到。合適的逆轉錄病毒的例子包括本領域技術人員 已知的PLJ、pZIP、pffE和pEM。用于制備親嗜性和兼嗜性逆轉錄病毒系統的合適包裝病毒 系例子包括 WCrip、ΨCre, Ψ2、ΨΑπκ ρΑ12 和 ΡΑ317 (綜述參見 Miller et. al, Hum. Gene Ther.l :5-14(1990))。逆轉錄病毒已被用于將多種基因體外和/或體內引入包括上皮細胞 的許多不同細胞類型(參見例如 Eglitis et al.，Science 230 1395-1398 (1985) ；Danos and Mulligan, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85 :6460-6464(1988) ；Wilson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :3014-3018(1988) ；Armentano et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :6141-6145(1990) ；Miller et al.，Blood 76 :271-8(1990) ；Huber et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8039-8043(1991) ；Ferry et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 8377-8381(1991) ；Chowdhury et al. S cience 254 1802~1805(1991) ；van Beusechem et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :7640-7644(1992) ；Kay et al. Human Gene Therapy 3 :641-647(1992) ；Dai et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10892-10895 (1992) ；Hwu et al. J. Immunol. 150 :4104-4115 (1993) ；Cavazzana-CaIvo et al. , Science 288 669-672(2000)；美國專利 4，868，116 ；美國專利 4，980，沘6 ；PCT 申請 WO 89/07136 ；PCT 申 it WO 89/02468 ；PCT 申請 WO 89/05345 ；以及 PCT 申請 WO 92/07573)。可用于本發明的方法的另一種病毒基因遞送系統利用了腺病毒衍生載體。產生復 制缺陷型腺病毒是通過操縱腺病毒的基因組，從而使得它編碼并表達目的基因產物，但其 正常的裂解病毒生命周期中的復制能力被滅活。參見例如Berkner et al. ,BioTechniques 6 :616(1988) ；Rosenfeld et al.，Science 252 :431-434(1991)；禾口 Rosenfeld et al.， Cell M :143-155(1992)。來源于腺病毒株Ad 5型dl3M的合適腺病毒載體是本領域技 術人員已知的。重組腺病毒在特定情況中是有利的，因為它們不能感染不分裂細胞并且可 以用于感染包括上皮細胞的許多不同的細胞類型(Rosenfeld et al. , (1992)，同上)。此 外，病毒顆粒相對穩定和易于純化和濃縮，并且如上所述，可以通過修飾影響其感染范圍。 另外，引入的腺病毒DNA(以及其中含有的外來DNA)不會整合到宿主細胞的基因組中而是 保持游離狀態，從而避免了因為在引入DNA整合到宿主基因組(例如逆轉錄DNA)的地方發 生插入突變而帶來的可能問題。而且，腺病毒基因組攜帶外來DNA的能力相對其他基因遞 送載體很大(可達至1J 8 kilobases (kb), Berkner et al.,同前；Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57 :267(1986)).再者，已制備出可以含有301Λ以上轉基因的特殊的高容量腺病 毒(HC-Ad)載體(Kochanek et al. , Hum. Gene Ther. 10 :2451-9 (1999)) 還有一種可用于遞送核酸的病毒載體系統是腺相關病毒(AAV)。腺相關病毒是天 然缺陷型病毒，它需要諸如腺病毒或皰疹病毒的另一種病毒作為輔助病毒來獲得有效的復 制和有生產力的生命周期(綜述見McCarty et al.，Annu Rev Genet 38 =819-45(2004)；Daya et al.，Clin. Microbiol. Rev. :583-93 (2008))。它還是少數幾種可能將 DNA 整合到不分裂細胞中的病毒之一，表現出高頻率的穩定整合帶來長期表達(參見例如 Samulski et al.，J. Virol. :3822-3828(1989)；和 McLaughlin et al. , J. Virol. 62 1963-1973(1989) ；Flotte et al. , Am. J. Respir Cell. Mol. Biol. 7 :349-356(1992)； Miller et al. , Nature Genet. 36 :767-773 (2004)) 含有少到 300 個堿基對的 AAV 的載 體仍可以包裝并整合。可供外源DNA的空間限于大約4kb。諸如"Tratschin et al. , Mol. Cell. Biol. 5 :3251-3260(1985)中描述的AAV載體可被用于將DNA引入細胞。通過利用來 源于許多不同血清型的AAV載體，已有各種核酸被引入不同細胞類型(參見例如Hermonat et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6466-6470(1984) ；Tratschin et al. , Mol. Cell. Biol. 4 :2072-2081 (1985) ；Wondisford et al. , Mol. Endocrinol. 2 :32-39 (1988)； Tratschin et al. , J. Virol. 51 :611-619 (1984)；以及 Flotte et al.，J. Biol. Chem. 268 3781-3790(1993) ；Summerford et al. , J.Virol. 72 1438-45(1998) ；Davidson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428-32(2000) ；Zabner et al. , J. Virol. 74 3852-8(2000) ；Rabinowitz JE et al. , J. Virol. 76 :791-801(2002) ；Davidoff et al.， Mol Ther. 11 :875-88(2005) ；Mueller et al.，Gene Ther. 15 :858-63. (2008)) 除了以上闡述的病毒轉移法，也可以采用非病毒方法帶來本文描述的核酸化合物 的表達(這類方法的綜述可以參見Niidome et al. ,Gene Ther. 9 1647-52 (2002)) 一般 來說，基因轉移的非病毒法依賴哺乳動物所用的正常機制進行大分子的攝入和胞內運輸。 在一些實施方案中，非病毒基因遞送系統可以依賴胞吞途徑使對象基因被靶細胞攝入。示 范性的這種類型的基因遞送系統包括來源于脂質體的系統、諸如多聚胺和多聚賴氨酸的多 聚陽離子綴合物，以及人工病毒被膜。其他實施方案包括諸如Cohen et al. ,Gene Ther. 7 1896-905(2000) ；Tam et al. , Gene Ther. 7 1867-74(2000) ；Meuli et al. , J. Invest. Dermatol. 116 :131-135(2001)；或Fenske et al. ,Methods Enzymo 1. 346 :36-71(2002)中 描述的質粒注射系統。在一些實施方案中，可以利用裸DNA構建體和/或基于DNA載體的構建體來表達 BMP。裸DNA構建體和這類構建體的治療應用是本領域技術人員公知的(參見例如 Chiarella et al., Recent Patents Anti-Infect. Drug Disc. ,3 :93-101,2008 ；Gray et al. , Expert Opin. Biol. Ther.,旦911-922,2008 ；Melman et al. , Hum. Gene Ther.,17 1165-1176,2008)。一般來說，裸DNA構建體包含一或多個治療性核酸(例如，編碼BMP的 DNA)和啟動子序列。裸DNA構建體可以是DNA載體，通常稱為pDNA。裸DNA —般不會整合 到染色體DNA中。通常，裸DNA構建體不需要脂質、聚合物或病毒蛋白的存在，或者不會與 它們聯合使用。這類構建體還可以包含本文描述的一或多種非治療性成分。DNA載體是本領域已知的，一般是環形雙鏈DNA分子。DNA載體的大小通常在3到 5千堿基對范圍內(例如，包括插入的治療性核酸)。與裸露DNA—樣，DNA載體可以用于 在靶細胞中遞送并表達一或多種治療性蛋白。DNA載體不會整合到染色體DNA中。通常，DNA載體包含至少一個啟動子序列以便在靶細胞內進行復制。通過將DNA載 體與例如陽離子脂質組合，形成DNA復合體可以協助(例如提高)DNA載體的攝入。在一些實施方案中，DNA載體可以經由常規轉化或轉染技術引入靶細胞。名詞“轉化”和“轉染”用于本文是指多種本領域認可的向靶細胞引入外來核酸(例如DNA)的技術， 包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質轉染或電穿孔。制備本文描述的表達構建體所需的所有分子生物學技術都是本領域技術人員能 夠理解的標準技術。詳細方法還可以在例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (eds. )Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9. 10-9. 14 以 及其他標準實驗手冊中找到。編碼改變的BMP氨基酸序列(例如與文中所示野生型BMP序 列有至少50、60、70、80、90、95、98和99%相同度的氨基酸序列)的DNA可以利用例如定點 突變技術制備。制劑通常，在使用BMP多肽或核酸的情況中，所述多肽或核酸來自與受試對象相同的 物種，例如人、貓、犬、牛、豬或綿羊。文中描述的BMP化合物可以以任何合適的方式配制，例如配制在載體系統中用 于與細胞群接觸。載體可以是膠體系統。膠體系統可以是脂質體這種磷脂雙層介質。在 一些實施方案中，在保持蛋白完整性情況下，蛋白被包被在脂質體中。本領域技術人員知 道有許多方法可以制備脂質體(參見Lichtenberg et al.，Methods Biochem Anal, 33 337-462(1988) ,LIPOSOME TECHNOLOGY Anselem et al. ,CRC Press，1993)。可以由大小和 取代基各不相同的磷脂來制備脂質體，脂質體還可以含有其他低毒性成分，比如膽固醇。脂 質體可以配制和分離為各種形狀和大小。此外，可以給脂質體表面附著上部分以便進一步 提高載體的藥物動力學特性。所述部分可以附著到磷脂或膽固醇分子上，可以調節表面上 引入的部分的百分比來達到最佳脂質體穩定性和藥物動力學特征。一個實施方案包含表面 上添加聚乙二醇(PEG)的脂質體。脂質體制劑可以延遲清除和增加細胞攝入(參見Reddy， Annals of Pharmacotherapy,34(7/8) :915-923(2000))。載體還可以是聚合物，例如生物可降解、生物相容性的聚合物基質。在一些實施 方案中，可以在保持蛋白完整性的情況下，將蛋白包埋在聚合物基質內。所述聚合物可以 是天然的，比如多肽、蛋白或者多糖；或者是合成的，比如聚(α-羥基)酸。實例包括由 膠原蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、醋酸纖維素、硝酸纖維素、多糖、纖維蛋白、明膠以及它們的 組合制成的載體。在一些實施方案中，聚合物是聚乳酸(PLA)或聚乳酸/聚乙醇酸共聚 物(PGLA)。聚合物基質可以制備和分離為各種形式和大小，包括微球和納米球。聚合物 制劑可以使治療效果持續更長時間(參見Reddy，Annals of Pharmacotherapy, 34 (7/8) 915-923(2000))。人生長激素(hGH)的聚合物制劑已被用于臨床試驗(參見Kozarich and Rich, Chemical Biology, 2 :548-552,1998)。聚合物微球緩釋制劑的實例在PCT公開WO 99/15154 (Tracy et al.)、美國專利 5，674，534 和 5，716，644 (均授予 Zale 等)、PCT 公開 W 96/40073 (Zale et al.)和 PCT 公 開 TO 00/38651 (Shah et al.)中有描述。美國專利 5，674，534 和 5，716，644 以及 PCT 公 開WO 96/40073描述了含有促紅細胞生成素顆粒的聚合物基質，其中用鹽使顆粒抗聚集而穩定。分化方法這里描述的是通過用一或多種BMP與^^_1+祖細胞群進行接觸，產生成熟BAT細 胞或具有成熟BAT細胞特性的細胞的方法。所述一或多種BMP的量(例如濃度或劑量)以及處理時間足以增加ka-Ι+祖細胞群中BAT細胞或者具有成熟BAT細胞特性的細胞的數 量。本領域技術人員利用已知方法可以確定BMP用量和處理時間。在一些實施方案中，所 述 BMP 是 BMP-7。在一些實施方案中，一或多個BMP的量可以包含例如每種ΒΜΡ0. 1_50ηΜ。在一些實施方案中，處理時間可以是例如1-2天、1-3天、1-4天、1_5天和1_5天以上。在一些實施方案中，ka-Ι+細胞在例如沒有任何分化誘導步驟情況下，只與一或 多種BMP進行接觸。替代地，Sca-I+細胞用包含一或多種BMP的第一溶液和包含一或多種 化學或激素性分化誘導劑和/或噻唑烷二酮的第二溶液進行處理。ka-Ι+細胞可以順序 (例如，第一然后第二，或者第二然后第一)或者同時接觸所述第一和第二溶液。本領域技 術人員利用已知方法可以很容易地確定第一和第二溶液的用量、處理時間以及第一和第二 溶液的使用順序。在一些實施方案中，包含一或多種化學或激素性分化誘導劑和/或噻唑烷二酮的 第二溶液是成骨、軟骨形成、肌組織形成或脂肪形成分化溶液。示范性的分化溶液已有描述 (Klien et al.，J. Biol. Chem. ,274 :34795-34802,1999 ；Hauner et al.，J. Clin. Invest.， M =1663-1670,1989)。為了促進本文描述的細胞分化為BAT系或者向該譜系分化，可以用 噻唑烷二酮處理細胞。替代地或者附加的，可以象例如先前描述的，用含有胰島素、地塞米 松、三碘甲腺原氨酸、異丁基甲基黃嘌呤和0. 125mM吲哚美辛(indomethacin)的脂肪形成 誘導混合液處理本文描述的細胞(Klien et al.，J. Biol. Chem. ,2U =34795-34802,1999)。在一些實施方案中，通過確定細胞群中一或多種標記物的存在與否對分化處理進 行評價。在一些實施方案中，方法包括評價BMP處理細胞和細胞群的脂肪形成水平。脂肪 形成的評價可以通過(例如利用油紅O(ORO)染色)測量例如一或多種脂質的累積。油 紅0染料用于將細胞中的中性脂質染色。染色的量與細胞中脂質的量直接成比例，可以通 過分光光度法測量。確定脂質累積的量作為分化的參數。替代地或者此外，可以通過測 量脂肪形成的一或多種標記物來評價脂肪形成，例如選自過氧化物酶體增殖物激活受體 Y ( 々1 ￥)、脂肪酸結合蛋白4爾48 4，aP2)、和/或脂肪酸合成酶(FAS)的一或多種標記 物。在一些實施方案中，方法包括評價細胞或細胞群的BAT脂肪形成水平。BAT分化可 以通過測量以下的一或多種一或多種BAT特異標記物，比如解偶聯蛋白(UCP)、誘導細胞 死亡DFF45樣效應因子A (CIDEA) ,PPAR γ共活化因子(PGC) -I α，和/或PPAR γ共活化因 子(PGC)-I β和/或PRDM-16 ；BAT形態學(例如利用目測，例如對細胞顯微鏡觀測)；或者 BAT熱動力學，例如細胞色素氧化酶活性、Na+-K+-ATPaSe酶單位、或者其他參與BAT產熱的 酶。在一些實施方案中，方法可以包括評價細胞內前脂肪細胞因子(pref)-l這種脂 肪形成抑制劑的水平，其中相對例如合適的未處理對照細胞或相同細胞在處理前的pref-1 水平，pref-Ι水平的下降表明細胞已發生BAT分化。在一些實施方案中，方法包括用環化AMP(cAMP)或其類似物，比如二丁酰cAMP或 β 3-腎上腺素能激動劑CL316249處理細胞來估計細胞激活產熱的能力。冷誘發的體內產熱由一個信號傳導級聯介導，該信號傳導級聯涉及交感神經系統和BAT中的β 3腎上腺素 能受體的活化。這些事件導致細胞質cAMP水平增加，繼而引發參與成熟褐色脂肪細胞產熱 的基因的表達。為了確定分化細胞是否成為真正的褐色脂肪細胞，可以測量用細胞穿膜性 cAMP類似物-二丁酰cAMP (Sigma)或β 3-腎上腺素能激動劑CL316249 (Sigma)處理過的 分化脂肪細胞中產熱基因(比如UCP-1)的表達。這些方法包括評估(例如測量)成熟褐 色脂肪細胞中參與產熱的一或多個基因的表達。示范性的這類基因包括，但不限于UCP-1、 CIDEA、PGC-I、PRDM16以及參與線粒體生物形成和功能的基因。顯示表達一或多個這類基 因的細胞即可鑒定為成熟BAT細胞和/或具有成熟褐色脂肪細胞特征的細胞。在一些實施方案中，方法包括評價WAT分化，例如評價WAT特異標記物，比如抵抗 素(resistin)、TCF21、瘦素(1印tin)和/或核受體相互作用蛋白1 (RIP140)中的一或多 個，和/或評價WAT形態學。WAT和BAT可以通過常規技術予以區分，例如WAT或BAT特異的形態學改變，或者 評價WAT-特異的或者BAT-特異的標記物。例如，BAT細胞可以通過解偶聯蛋白(UCP)(例 如UCP-1)的表達來鑒定。治療方法本文描述的方法和組合物可用于治療肥胖癥和體重相關疾病。通常方法包括將有 效量的BMP處理細胞給予有需要的受試對象，包括被診斷為需要這種治療的對象。受試對象的選擇在一些實施方案中，方法包括鑒定需要治療的受試對象(例如，超重或肥胖受試 對象，例如體質量指數(BMI) 25- 或30或更高，或者患有體重相關疾病的受試對象)并給 予受試對象有效量的BMP處理細胞。需要用本文描述的方法進行治療的受試對象可以根據 受試對象的體重或體質量指數來選擇。在一些實施方案中，方法包括評價受試對象體重、脂 肪組織儲存、脂肪組織形態學、胰島素水平、胰島素代謝、葡萄糖水平、產熱能力和冷敏感度 中的一或多項。在一些實施方案中，受試對象的選擇可以包括估計受試對象中BAT的量或 活性并記錄這些觀察。在給予化合物之前、過程中和/或之后可以進行評價。例如，可以在給藥之前和/ 或之后至少1天、2天、4、7、14、21、30或更多天進行評價。在一些實施方案中，Sca-I+祖細胞可以從被挑選接受治療的受試者獲得。細胞療法本文描述的方法可以包括將BMP處理的ka-Ι+細胞，如文中描述地移植給待治療 受試對象，其中所述BMP處理的干細胞群或者它們的后代(即子細胞)發生褐色脂肪組織 形成。ka-Ι+細胞一移植后，通常會經歷脂肪組織發生，在受試對象中產生BAT。這些細胞治療方法可以用于例如治療受試對象的肥胖癥和胰島素抗性，或者治療 與缺少線粒體相關的疾病，例如糖尿病、癌癥、神經系統退行和衰老。BMP處理的ka-Ι+細胞群(例如，用本文描述的分化方法處理過的細胞) 的植入方法是本領域已知的，例如利用設計成能將細胞導入受試對象的遞送系統進行植 入。一般來說，遞送系統可以包含含有細胞群的儲存容器和與該容器液體相通的針頭，其中 所述細胞群包含BMP處理的ka-Ι+細胞。BMP處理的細胞群一般在有或沒有細胞 可附著其上的支架、基質或其他可移植裝置(實例包括由膠原蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、醋酸纖維素、硝酸纖維素、多糖、纖維蛋白、明膠以及它們的組合制成的載體)的情況下，置 于可藥用載體中。這類遞送系統也在本發明的范圍內。通常這類遞送系統被保持無菌狀態。 可以使用各種給藥途徑和各種部位(例如，腎包膜下、皮下、中樞神經系統(包括鞘內)、血 管內、肝內、內臟內、腹膜內(包括網膜內)、肌內植入)。通常細胞將被皮下植入受試對象。 在一些實施方案中，植入的BMP處理的ka-Ι+細胞群包含至少107Q、108、109或更多細胞。在使用了非免疫相容性細胞的情況下，可以給予受體受試對象劑量足夠抑制細胞 排斥的免疫抑制化合物，例如藥物或抗體。免疫抑制劑的劑量范圍是本領域已知的。參見 例如 Freed et al. , N. Engl. J. Med. 327 1549 (1992) ；Spencer et al.，N. Engl. J. Med. 327 1541(1992) ；Widner et al.，N. Engl. J. Med. 327 :1556 (1992))。劑量值可能根據各種因素， 比如受試對象的疾病狀態、年齡、性別和體重而不同。在一些實施方案中，除了 BMP處理的細胞，方法還包括接觸、給予或表達一或多種 下列其他化合物，例如過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR0、類視黃醇X受體α (RxRV )、胰島素、Τ3、噻唑烷二酮(TZD)、視黃酸、另一種BMP蛋白(例如BMP-I或BMP-3)、維生素 A、視黃酸、胰島素、糖皮質激素或其激動劑、無翅型(Wingless-type (Wnt)，例如Wnt-Ι)、胰 島素樣生長因子-I(IGF-I)或其他生長因子(例如表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因 子(FGF)、轉化生長因子(TGF)-a ,TGF-β，腫瘤壞死因子α (TNF α )、巨噬細胞集落刺激因 子(MCSF)、血管內皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍生生長因子(PDGF))。其他實施方案 中，化合物可以是本文描述的ΒΜΡ-2、-4、-5、-6和/或-7蛋白或其部分連接了異源多肽序 列，例如第二種BMP蛋白，從而形成嵌合分子或融合蛋白。在一些實施方案中，方法包括將 化合物與第二治療方法聯合給予，例如肥胖癥或諸如糖尿病的相關疾病的第二治療方法。 例如，第二治療方法可以是胰島素、orlistat、苯二甲嗎啉(phendimetrazine)和/或苯丁 胺(phentermine)。體內療法 在一些實施方案中，本公開提供了體內治療方法。所述方法包括如上所述挑選受 試對象，并將能夠增強受試對象的BMP信號傳導的一或多種化合物給予受試對象，其中所 述各種化合物特異靶向受試對象中的ka-Ι+細胞。可以用于這些方法的化合物包括，例如 BMPs和特異靶向ka-Ι+細胞的BMP激動劑。這類化合物可以特異結合和/或細胞 表面的⑶四受體。有效劑量通過標準藥物學程序，例如培養細胞或實驗動物確定LD5CI(對群體50%致死的劑 量)和ED5tl (在群體50%治療有效的劑量)可以確定本文描述的化合物和藥物組合物的毒 性和治療有效。毒性效果和治療效果之間的劑量比率是治療指數，可以表達為比率LD5tl/ ED500優選表現出較大治療指數的多肽或其他化合物。由細胞培養分析和進一步的動物研究獲得的數據可以用于制定給人使用的劑量 范圍。優選這類化合物的劑量落在這樣的循環濃度范圍內，該范圍包含ED5tl，只有很少的或 者沒有毒性，并且對人的聽力有小的或者沒有副作用。根據所采用的劑量形式和給藥途徑， 劑量可能在該范圍內變化。對于本文描述的方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以 首先由細胞培養分析來估計。可以在動物模型中制定出劑量從而達到包含細胞培養中確 定出來的IC5(I(即實現癥狀最大抑制的一半時的測試化合物濃度)的循環血漿濃度范圍。可以利用這樣的信息更準確地確定人使用的劑量。示范性的分化劑劑量是至少每天大約 0. 01 到 3000mg，例如每天每公斤體重至少大約 0. 00001,0. 0001,0. 001,0. 01,0. 1、1、2、5、 10、25、50、100、200、500、1000、2000 或 3000mg 或者更多。可以針對要治療的疾病或病癥以及被治療的具體人來決定劑型和給藥途徑。受試 對象可以在一周、一個月、六個月、一年或更長時間內每天接受一個或兩個或更多個藥劑劑 量。治療可以持續無限期，比如人的一生。可以按照規律或不規律的間隔(每兩天一次或 者每周兩次)給予治療，給藥劑量和時機在治療期間可以調整。劑量在治療方案期間可以 保持不變，或者在治療期間可以降低或提高。通常劑量在預防和治療方面均達到預期目的，而沒有不希望的副作用，比如毒 性、有刺激或過敏反應。雖然受試對象需求可能不同，確定制劑的最佳有效量范圍是本 領域常規技術。人劑量可以容易地由動物研究推出(Katocs et al. , Chapter 27 In: ReminRton' s Pharmaceutical Sciences,18th Ed. ,Gennaro,ed. ,Mack Publishing Co.， Easton, Pa.，1990)。通常，提供有效量制劑所需的用藥量(本領域技術人員可以對其進行 調節)可能根據多種因素而變化，這些因素包括受體的年齡、健康和身體狀況、體重、疾病 或病癥的類型和程度、治療頻率、可能同時進行的治療的性質以及預期效果的性質和范圍 (Nies et al. , Chapter 3, In Goodman & Gilman' s “The Pharmacological Basis of Therapeutics，，,9th Ed. , Hardman et al. , eds. , McGraw-Hi 11, New York, N. Y. , 1996)。治療的評價/驗證在一些實施方案中，本文描述的方法可以包括在治療后評價受試對象體內BAT的 量或活性并記錄這些觀察數據。這些治療后觀察數據可以與挑選受試對象期間做的觀察進 行比較。在一些實施方案中，受試對象具有提高的BAT水平和/或活性。在一些實施方案 中，受試對象會表現出減少的癥狀。一些實施方案中，評估可以包括確定治療前和/或后受試對象的體重或BMI，并對 受試對象治療前的體重或BMI與治療后的體重或BMI進行比較。觀察到體重或BMI下降即 指示著成功。在一些實施方案中，另外給予治療一或多次直至實現目標體重或BMI。替代 地，可以使用圍長的測量值，例如腰圍、胸圍、臀圍、大腿圍或者臂圍。這些評估可以用于給受試對象確定將來的療程。例如治療可能沒有變化地繼續、 做改變(例如附加的治療或者更激進的治療)后繼續，或者可以終止治療。在一些實施方案中，方法包括另外的一或多輪植入BMP活化細胞從而提高例如褐 色脂肪組織形成，以便例如維持或進一步減輕受試對象的肥胖。篩選方法在一些實施方案中，本文描述的方法包括鑒定BAT祖細胞的篩選方法。這些方法 包括獲取ka-Ι+祖細胞。在一些實施方案中，這些細胞將被通過評估細胞表面標記物表 達、RNA和DNA特性以及蛋白組學進行表征。替代地或者此外，可以利用文中描述的分化方 法來處理細胞。在一些實施方案中，可以單獨用BMP-7或者與一或多種分化誘導混合液組 合來處理ka-Ι+細胞。然后可以對細胞進行評價來確認細胞群包含一或多種成熟BAT細 胞或者具有BAT細胞特征的細胞。這些成熟BAT細胞或者具有BAT細胞特征的細胞然后可 以被分離，并通過例如評估細胞表面標記物表達、RNA和DNA特性以及蛋白組學進行表征。 所做觀察將被記錄并與用類似處理的ka-Ι+細胞得到的觀察進行比較。在一些實施方案中，所做觀察與利用未處理祖細胞得到的觀察進行比較從而確定分化前和后存在哪些標記 物。然后可以確定經常出現的觀察結果，并用于給能夠分化為BAT細胞系或者向該譜系分 化的細胞建立譜(profile)。然后可以利用該譜從異質細胞群中挑選出BAT祖細胞。試劑盒本發明提供了試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒可以包括(1) 一或多種ka-1+ 祖細胞；⑵一或多種BMP，其能夠促進所述一或多種ka-Ι+祖細胞分化為成熟BAT細胞系 或者向該譜系分化；C3)用于將細胞給予受試對象的裝置；(4)給藥說明；以及任選的(5) 一或多種分化誘導混合液。一些實施方案中，試劑盒可以包含(1) 一或多種BMP處理的ka-Ι+細胞；(2)用 于將細胞給予受試對象的裝置；和( 給藥說明。也包括相同容器中含有兩種或多種(包 括全部)成分的實施方案。提供試劑盒時，組合物的不同成分可以包裝在獨立的容器內并在臨用前混合。成 分的這種獨立包裝可以保證長期保存而不喪失活性成分的功能。當具體試劑盒中包含一種 以上生物活性劑時，所述生物活性劑可以(1)分別包裝，在臨用前用合適的(類似于不同 的，但是相容的)助劑或賦形劑混合，(2)包裝在一起，在臨用前一起混合，或者C3)分別包 裝，在臨用前一起混合。如果選定的化合物在混合后仍保持穩定，化合物可以在使用前的一 個時間，包括例如使用前幾分鐘、幾小時、幾天、幾個月、幾年和生產時混合，而不需在臨用 前混合。包含在本發明的具體試劑盒中的組合物可以放在任何類型的容器中提供，使得不 同成分的壽命可以得到最佳保存，并且不會被容器材料所吸收后改變。容器的合適材料可 以包括，例如玻璃、有機聚合物(例如聚碳酸酯和聚苯乙烯)、瓷、金屬(例如，鋁)、合金或 任何其他常用于盛放類似化學劑的材料。示范性的容器可以包括，但不限于試管、小瓶、三 角瓶、瓶子、注射器等。正如以上的陳述，試劑盒中還可以提供說明材料。這些說明可以是印刷的和/或 不限于作為電子可讀介質提供，比如軟盤、⑶-ROM、DVD、Zip盤、錄像帶、錄音帶和閃存裝置 (flash memory device)。替代地，說明可以是公開在互聯網址或者以電子郵件發送給使用
者ο所述試劑盒還包括用于治療或預防體重相關疾病和肥胖癥的試劑盒。通過以下實施例進一步描述本發明，這些實施例并不限制權利要求中描述的發明 范圍。
實施例實施例1 在無化學和/或激素的分化誘導劑的情況下，骨形態發生蛋白的處理促 進BAT分化按照以下方法分析用骨形態發生蛋白BMP-2、_4、_5、_6和_7處理野生型褐色前 脂肪細胞和3T3-L1白色前脂肪細胞的效果。次融匯狀態細胞在補充有10%胎牛血清以及BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6 或BMP-7的Duibecco，s Modified Eagles Medium(DMEM)中培養。對照細胞培養基不含 BMP。細胞不與化學或激素的分化誘導劑或噻唑烷二酮接觸。將細胞培養8天。然后收集細胞進行油紅0染色和RNA提取。脂質累積利用油紅0染色分析。簡而言之，細胞在室溫下用過濾過的油紅0溶液 (溶于異丙醇的0. 5%油紅O(Sigma-Aldrich))染色2個小時。如圖IA所示，與對照細胞群相比，BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7導致野生型褐色 前脂肪細胞中脂質積累顯著增加，因為油紅0積累增加這些細胞表現出更深的顏色表明了 這一點。相反，如圖IB所示，3T3-L1白色前脂肪細胞中未觀察到脂質積累增加。這些數據表明，即使在不含化學或激素性分化誘導劑的生長培養基中，多種 BMP (BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7)均能夠促進褐色前脂肪細胞中脂質累積的增加。因為脂 質累積與這些細胞向BAT表現型分化是一致的，這些結果表明BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7 能夠促進BAT祖細胞分化為BAT細胞系或者向該譜系分化。解偶聯蛋白-(UCP-I)和誘導細胞死亡DFF45樣效應因子A(CIDEA)是常用于確 認 BAT 分化的特異標記物(Zhou et al.，Nat. Genet. ,35 49-56，2003)。為 了分析 BMP-2、 BMP-4、BMP-6和BMP-7是否促進褐色前脂肪細胞分化為成熟BAT細胞，用如上制備的細胞 進行了定量RT-PCR來評估UCP-I和CIDEA的表達。野生型褐色前脂肪細胞在有各種BMP存在的情況下培養8天。然后收集細胞，用 QIAzol裂解試劑Oliagen，Valencia, CA)分離RNA。用于擴增UCP-I的有義和反義引物購 自 SuperArray (產品目錄 No. PPM05164A)。用于擴增CIDEA的有義和反義引物分別是5，-ATCACAACTGGCCTGGTTACG-3，SEQ ID NO 6 ；禾口5，-TACTACCCGGTGTCCATTTCT-3，SEQ ID NO :7。按照生產商的使用說明(BDBiosciences, Palo Al to，CA)，利用 Advantage RT-PCR試劑盒由1 μ g RNA制備cDNA，并稀釋至終體積250 μ 1。5 μ 1稀釋的cDNA用在含有 SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)的 20 μ 1 PCR 反應中。每 種引物使用濃度為300ηΜ。每個樣品的PCR反應一式兩份，利用ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)進行定量。如圖2A所示，BMP-7處理的細胞與對照細胞群相比，表現出顯著增加的UCP-I和 CIDEA表達。BMP-2處理的細胞中也觀察到CIDEA表達增加。這些結果表明BMP-2和BMP-7促進野生型褐色前脂肪細胞分化為BAT。利用Wfestern Blotting也證實了以上觀察結果。簡單地說，次融匯狀態褐色和白 色前脂肪細胞在對照培養基和補充有3. 3nM BMP-6或BMP-7的培養基中培養13天。由BMP-6、BMP-7和對照處理的褐色和白色前脂肪細胞獲得的蛋白提取物經 SDS-PAGE分離，并利用Western印跡分析。膜在剝離前首先用抗UCP的特異抗體(Santa Cruz, CA)檢測，再用抗微管蛋白的特異抗體再次檢測作為上樣對照。如圖2Β所示，接觸ΒΜΡ-7的褐色細胞群中，UCP-I被特異上調。UCP-I上調現象在 接觸ΒΜΡ-7的白色細胞群、或者ΒΜΡ-6或對照處理的褐色和白色細胞中未觀察到。除了以上描述的觀察結果，ΒΜΡ-7還促進線粒體生物發生的增加。這些數據表明，ΒΜΡ-7是一種重要的褐色脂肪形成因子和產熱調節劑。實施例2 干細胞抗原-1陽性褐色脂肪細胞祖細胞的分離和表征候選褐色脂肪祖細胞分離自成年小鼠骨骼肌。然后通過與ΒΜΡ-7接觸，考察這些分離細胞分化為BAT細胞的能力。來自小鼠四肢肌纖維相關間質細胞的干細胞抗原-1陽性(Sca-Ι+)和CD45/ Mac-I陰性(Sca-Ι+/⑶45-/Mac-l-)非肌原祖細胞群通過熒光活化細胞分選(FACS)純化。 簡單來說，用二氧化碳將動物處死，然后頸椎脫白。從前后肢解剖肌肉組織，收集到15ml Digestion Buffer I (DMEM、0. 2%膠原酶 II 型，Invitrogen # 17101-015)中。將樣品在 37°C水浴中輕柔震蕩消化90分鐘。加入3ml胎牛血清(FBS)終止消化反應。分離組織片， 用F10+20%FBS培養基清洗兩次，磷酸鹽緩沖液(PBQ洗一次，不能破壞組織片。將組織在 PBS中切碎獲得完整的肌肉纖維。然后通過沉淀3到4次清洗肌肉纖維以除去間質細胞。初步清洗后，除去上清，使 終體積為 3_5ml，然后加入 5-6ml Digestion Buffer II (F10、0. 0125%膠原酶 II 型、0. 05% 分散酶，Invitrogen # 17105-041)。樣品然后在輕柔震蕩下于37°C溫育30分鐘。然后向溶液加入1. 5ml FBS終止消 化。通過將樣品上下吸放大約4次使樣品中存在的肌纖維相關細胞釋放出來。樣品然后低 速離心1分鐘除去未消化的組織片。將上清經70 μ m細胞過濾網過濾。離心收集細胞并重 懸于小體積分選培養基(溶于Hanks緩沖鹽溶液HBSS的2% FBS)中進行抗體染色。在分選培養基中完成一個清洗步驟后，細胞經gauge net過濾。加入活性選擇標記 物-碘化丙啶(用于檢測死細胞)和鈣熒光素藍(calcein blue)(用于檢測活細胞)后，對 細胞進行熒光活化細胞分選(FACS)，陰性選擇PE (表達Mac-I和⑶45)，陽性選擇APC (表 達^^-1)。所有抗體以1 200稀釋度加入細胞懸液，在冰上孵育20分鐘。所用抗體包 括抗 ka-l(APC-標記的；eBioscience # 17-5981-82)、Mac_l (PE-標記的；eBioscience # 12-0112-82)和 CD45(PE-標記的；eBioscience # 12-0451-82)的抗體。然后將細胞重懸于生長培養基(含有10% FBS和谷胱氨酰的F10)并以每孔 25. 000個細胞的密度接種在包被層粘連蛋白/膠原蛋白的M孔細胞培養板上。生長期間， 細胞每天補充加入5ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Sigma-Aldrich # F(^91)。Sca-1+/CD45-/Mac_l-祖細胞然后與補充有10%胎牛血清和3. 3nM BMP-7的DMEM 接觸3天。對照細胞與補充10%胎牛血清、沒有BMP-7的DMEM接觸。然后細胞與脂肪細 胞誘導培養基接觸4天。具體來說，脂肪細胞分化的誘導是通過將融匯細胞在補充了 20nM 胰島素和InM三碘甲腺原氨酸(Τ3)、0.5μΜ異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、5mM地塞米松和 0. 125mM吲哚美辛的培養基中處理48小時。這一誘導期(第二天)之后，將細胞放回補充 有胰島素和T3的生長培養基，然后該培養基被每兩天換一次。然后固定細胞進行油紅0染 色并分離RNA進行定量RT-PCR。如實施例1所述進行油紅0染色。如圖3A和;3B所示，BMP-7處理的ka-l+/CD45-/Mac_l-與相應對照細胞群相比， 表現出顯著增加的脂質累積。然后進行定量RT-PCR來確定脂肪形成標記物和褐色脂肪細胞特異的脂肪形成標 記物的表達水平。所分析的脂肪形成標記物是過氧化物酶體增殖物激活受體Y(PPARY)、 脂肪酸結合蛋白4(FABA4，aP2)和脂肪酸合成酶(FAQ。褐色脂肪細胞特異的脂肪形成標 記物是 UCP-I、CIDEA、PPAR γ 共活化劑(PGC)-I α 和 PGC-I β。定量RT-PCR如實施例1所述進行。用于擴增PPAR γ的有義和反義標記物分別是5，-TCAGCTCTGTGGACCTCTCC-3，SEQ ID NO 8 ；禾口5，-ACCCTTGCATCCTTCACAAG-3，SEQ ID NO :9。用于擴增FABA，aP2的有義和反義標記物分別是5，-GATGCCTTTGTGGGAACCT-3，SEQ ID NO 10 ；禾口5，-CTGTCGTCTGCGGTGATTT-3，SEQ ID NO :11。用于擴增FAS的有義和反義標記物分別是5，-GAGGACACTCAAGTGGCTGA-3，SEQ ID NO 12 ；禾口5，-GTGAGGTTGCTGTCGTCTGT-3，SEQ ID NO :13。用于擴增PGC-I α的有義和反義標記物分別是5，-GTCAACAGCAAAAGCCACAA—3 ‘ SEQ ID NO 14 ；禾口5，-TCTGGGGTCAGAGGAAGAGA-3，SEQ ID NO :15。用于擴增PGC-I β的有義和反義標記物分別是5，-CTTGCTTTTCCCAGATGAGG-3，SEQ ID NO 16 ；禾口5，-CCCTGTCCGTGAGGAACG-3，SEQ ID NO :17。如圖4Α所示，ΒΜΡ-7處理導致脂肪形成標記物(PPAR y、FABP4、aP2和FAS)和褐 色脂肪選擇性標記物(UCP-1和CIDEA)均有顯著增加。觀察到的最低誘導是PPAR Y，相對 對照有2倍增加。其他所有標記物相對對照均有2倍以上增加。增加最大的是CIDEA，其相 對對照有3. 5倍增加。這些觀察結果表明，BMP-7處理促進⑶45-/Mac-l-祖細胞分化為真正的 BAT細胞。為了進一步證實BMP-7處理的⑶45-/Mac_l-細胞已分化為能夠產熱的 成熟褐色脂肪細胞，將BMP-7處理的ka-Ι+/⑶45-/Mac-l-細胞和未處理對照細胞與環化 AMP(cAMP)類似物二丁酰cAMP (Sigma)或β 3-腎上腺素能激動劑CL316249 (Sigma)接觸。 這兩種化合物均能模擬誘發冷引發的產熱，因此啟動參與產熱的基因的表達，而這專門發 生在成熟褐色脂肪細胞中。這兩種化合物常用于褐色脂肪細胞的功能表征，以及將褐色脂 肪細胞與白色脂肪細胞區分開來。處理后，利用定量RT-PCR如上所述分析UCP-I的表達。如圖4B所示，與對照細胞群細胞，BMP-7處理的ka-l+/CD45-/Mac_l-細胞群在 cAMP之后顯示UCP-I表達增加大約300倍。這一觀察結果表明接觸了 BMP-7的Sca-I+/ CD45-/Mac-1-祖細胞分化為了真正的褐色脂肪細胞，完全能夠應答兒荼酚胺刺激從而開啟
產熱程序。這些數據一起強烈提示，BMP-7能夠誘導ka-Ι+祖細胞，特別是ka-l+/CD45-/ Mac-I-祖細胞分化為真正的褐色脂肪細胞。實施例3 新的褐色脂肪細胞祖細胞的鑒定文中給出的結果顯示，BMP能夠在ka-Ι+間充質祖細胞群中限定褐色還是白色脂 肪的命運。Sca-I表達代表了異質前體集合。為了鑒定實施例1和2中描述的之外的ka-1+ 細胞來源，以及可以用于鑒定或純化這些細胞的褐色脂肪細胞祖細胞表面上的ka-Ι之 外的標記物，通過FACS從各種來源分離ka-Ι+祖細胞，所述來源包括肌肉以及包括肩胛間BAT、皮下白色脂肪組織和內臟白色脂肪組織的脂肪組織。然后將分離的ka-Ι+細胞與 BMP7接觸來評估細胞分化為成熟褐色脂肪細胞的能力。然后確定能夠分化為褐色脂肪細胞 的細胞的細胞表面標記物。這些另外的BAT祖細胞特異細胞表面標記物可以用于鑒定褐色 脂肪細胞祖細胞。更具體地說，按照以下程序，從骨骼肌、骨髓以及包括肩胛間BAT、皮下白色脂肪組 織和內臟白色脂肪組織的脂肪組織和儲存中分離非造血ka-Ι+祖細胞骨骼肌來源的ka-Ι+細胞按照實施例1和2中使用的方法分離并培養ka-Ι+細胞。具體來說，用二氧化碳 將動物處死，然后做頸椎脫白。從前后肢解剖肌肉組織并收集在15ml的Digestion Buffer I (DMEM，0· 2%膠原酶 II 型，Invitrogen # 17101-015)中。將樣品在37°C水浴中輕柔震蕩消化90分鐘后，加入3ml胎牛血清(FBQ終止消化 反應。分離組織片，用F10+20% FBS培養基清洗兩次，磷酸鹽緩沖液(PBQ洗一次，不能破 壞組織片。將組織在PBS中切碎獲得完整的肌肉纖維。然后通過沉淀3到4次清洗肌肉纖維以除去間質細胞。初步清洗后，除去上清，使 終體積為 3_5ml，然后加入5-6ml Digestion Buffer II (F10、0. 0125%膠原酶 II 型、0. 05% 分散酶，Invitrogen # 17105-041)。樣品然后在輕柔震蕩下于37°C溫育30分鐘。加入1. 5ml FBS終止消化。將樣品 上下吸放4次釋放肌纖維相關細胞后，樣品低速離心1分鐘除去未消化的組織片。然后將 上清經70 μ m細胞過濾網過濾。離心收集細胞并重懸于小體積分選培養基(溶于Hanks緩 沖鹽溶液HBSS的2% FBS)中進行抗體染色。所有抗體以1 200稀釋度加入細胞懸液，在冰上孵育20分鐘。抗體(APC 標記的；eBioscience # 17-5981-82)、Mac-1 (PE 標記的；eBioscience # 12-0112-82)和 CD45(PE標記的；eBioscience # 12-0451-8 的抗體。在分選培養基中完成一個清洗步驟 后，細胞經gauge net過濾。加入活性選擇標記物一碘化丙啶(用于檢測死細胞)和鈣熒 光素藍(calcein blue)(用于檢測活細胞)后，對細胞進行熒光活化細胞分選(FACS)，陰性 選擇PE (表達Mac-I和CD45)，陽性選擇APC (表達Sca-1)(參見圖6A)。然后將細胞重懸于生長培養基(發表在Calcif Tissue Int, 2008 Jan ； 82(1) :44-56) ο生長培養基由60%含有少量葡萄糖的Dulbecco，s Modified Eagle Medium(D-MEM) (Invitrogen, 11885-084)和 40% MCDB201 培養基(Sigma_Aldrich，M6770) 構成。培養基中補充有2%胎牛血清、青霉素/鏈霉素(Invitrogen，15140-155)、1ηΜ地 塞米松(Sigma-Aldrich，D-4902)、0. ImM L-抗壞血酸 2-磷酸(Sigma-Aldrich，A8960)、 Ix胰島素轉鐵因子硒(ITS)混合液(Sigma-Aldrich，13146)以及Ix亞油酸-白蛋白 (Sigma-Aldrich Aldrich,L9530)。細胞以每孔25. 000-50. 000個細胞的密度接種在包被基 質膠的M孔細胞培養板上。生長培養基還補充了以下生長因子10ng/ml EGF(PeproTech, 315-09) U0ng/ml LIF(購自 Millipore 的 ESGR0，ESG1107)、10ng/ml PDGF-BB (PeproTech, 315-18)和5ng/ml bFGF(Sigma-Aldrich, F0291)。每次隔天換培養基前加入新鮮配制 的生長因子。生長期間，細胞每天補充加入5ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF， Sigma-Aldrich#F0291)。這些分離細胞在用BMP7處理后，如下檢測它們產生褐色脂肪細胞的能力。簡單來說，如先前描述(Klein et al. , Τ. Biol. Chem. ,274 :34795-34802,1999 Hauner et al.， J. Clin. Invest. ,84 :1663-1670，1989)的，分離的細胞在有或沒有脂肪形成分化培 養基的情況下與BMP7接觸。更具體地說，在細胞90-95%融匯時或者分選后擴增7天后收 獲細胞。第二天向含有全部生長因子的生長培養基加入3. 3nM BMP-7開始預處理。此外， 與前面一樣每天補充bFGF。72小時后，誘導脂肪形成分化48小時。對于脂肪形成誘導混合液，使用了 不含生長因子的生長培養基。替代的，加入了以下化合物5yg/yl胰島素(Roche， 11376497001)、50μΜ 吲哚美辛(Sigma-Aldrich, 17378),0. 5μ M IBMX (Sigma-Aldrich, 15879)、1 μ M 地塞米松(Sigma-Aldrich, D-4902)禾Π InM Τ3 (Sigma-Aldrich, Τ6397)。脂 肪形成誘導2天后，將培養基換成含有5 μ g/μ 1胰島素和InM Τ3的培養基，最多再培養7 天。隨后利用油紅0染色和定量RT-PCR分析脂肪形成。如圖5A-5C所示，與圖1中顯示的數據一致，用ΒΜΡ7處理分離自小鼠后肢骨骼肌 的ka-Ι+細胞促進了脂質積累的顯著增加。在BMP7處理前，對這些骨骼肌來源的細胞進 行細胞表面標記物的分析。如圖6A所示，這些分離的骨骼肌細胞是^^-1陽性、⑶45陰性 和Mac-I陰性。如圖6B-6F所示，這些ka-1+BAT祖細胞對細胞表面標記物⑶29/整聯蛋 白β 1和⑶34也是陽性的。相反，細胞對細胞表面標記物⑶31/PECAM-1和⑶117/C_kit 是陰性的。這些觀察證明，Sca-1+BAT祖細胞可以從骨骼肌分離。觀察結果還支持了可以通 過陽性鑒定單獨的細胞表面標記物ka-Ι或者ka-Ι組合⑶四和⑶34中的一或多種來鑒 定和/或純化這類細胞。這類細胞可以通過它們沒有⑶45、Mac-l、⑶31和⑶117的細胞表
面表達來進一步鑒定。為了進一步證實這些ka-Ι+細胞分化為真正的褐色脂肪細胞的能力，如實施例1 和2中所述進行定量RT-PCR來分析這些骨骼肌源ka-Ι+細胞中脂肪形成標記物以及褐 色脂肪細胞特異的脂肪形成標記物的表達。除了實施例1和2中描述的標記物，還檢測了 PRDM-16,ATPase,Pref-UBMPR-11A,BMPR-1B,BMPR-2 和 ACVR-I 的表達水平。如上文所述， UCP-I是高度可靠的BAT標記物。類似地，PRDM-16是褐色脂肪細胞特異的脂肪形成標記 物，UCP-I是常用于鑒定BAT的標記物。MPR-11A、BMPR-1B、BMPR-2和ACVR-I是脂肪形成 標記物。I^ref-I是可以用于脂肪形成的確認的脂肪形成抑制劑。RT-PCR中使用的引物如 實施例2和以下所示。用于擴增UCP-I的有義和反義標記物分別是5，-CTGCCAGGACAGTACCCAAG-3，SEQ ID NO 185，-TCAGCTGTTCAAAGCACACA-3，SEQ ID NO 19用于擴增PRDM-16的有義和反義標記物分別是5，-CAGCACGGTGAAGCCATTC-3，SEQ ID NO 205，-GCGTGCATCCGCTTGTG-3，SEQ ID NO 21用于擴增AIPase的有義和反義標記物分別是5’ -ACCTATCCCAGCCTCGTCTC-3，SEQ ID NO 225' -AGGACTTGCCCACTTCTCTTT-3，SEQ ID NO 23用于擴增的有義和反義標記物分別是5’ -AGTACGAATGCTCCTGCACAC-3，SEQ ID NO 24
5’ -CTGGCCCTCATCATCCAC-3，SEQ ID NO 25用于擴增BMPR-IA的有義和反義標記物分別是5，-AATGCAAGGATTCACCGAAAGCCC-3，SEQ ID NO 265，-ACAGCCATGGAAATGAGCACAACC-3，SEQ ID NO 27用于擴增BMPR-IB的有義和反義標記物分別是5，-AGAAGAGCACAGAGGCCCAATTCT-3，SEQ ID NO 285，-TGCAAGGTACACAGCAGTGCTAGA-3，SEQ ID NO 29用于擴增BMPR-2的有義和反義標記物分別是5，-AGCAATCGCCCATCGAGACTTGAA-3，SEQ ID NO 305’ -TTCTGGAGGCATATAGCGCTTGGT-3，SEQ ID NO 31用于擴增ACVR-I的有義和反義標記物分別是5’ -TGCTAATGATGATGGCTTTCC-3，SEQ ID NO 325，-TTCACAGTGGTCCTCGTTCC-3，SEQ ID NO 33如圖7所示，ka-Ι+細胞的BMP7處理導致BAT特異標記物UCP-I的表達水平顯 著提高。此外，這些細胞中的UCP-I表達在試驗使用的整個12天期間繼續增加。還觀察到 BAT特異標記物PRDM-16、CIDEA、PGC-I α和PGC-I β的水平增加以及AIPase的表達水平 提高。脂肪形成標記物？ 々1 ^、沖2、 43、810^-認和810^-2的表達水平也觀察到增加。相 反，觀察到脂肪形成抑制劑I^ref-I的表達水平下降。這些觀察結果一起證明，接觸了細胞分化為脂肪細胞，而且是特異 分化為褐色脂肪細胞。細胞如實施例2所述還與cAMP進行了接觸，如圖8所示，這些細胞 中UCP-I的表達進一步顯著提高。這一觀察再次支持了 ka-Ι+細胞成為真正的褐色脂肪 細胞，完全能夠通過激活產熱程序應答兒荼酚胺刺激。脂肪組織來源的ka-Ι+細胞從脂肪組織，包括肩胛間BAT(BAT)、皮下白色脂肪組織(SQ-WAT)和內臟白色脂肪 組織(EPI-WAT)分離ka-Ι+細胞，并使用以上描述的用于骨骼肌源細胞的方法進 行培養。然后將分離的細胞與BMP7接觸。利用油紅0染色和RT-PCR確定細胞分化為BAT 的能力。如圖9所示，分離自BAT和SQ-WAT的細胞通過分化為BAT應答BMP7處理。 相反，分離自EPI-WAT的ka-Ι+細胞沒有。這些視覺觀察結果利用RT-PCR進行了證實。從來源于遺傳上易于肥胖的小鼠 C57B1/6 (B6)和肥胖抗性小鼠129_S6(129)的BAT (BAT)、皮下白色脂肪組織(SQ-WAT)和內 臟白色脂肪組織(EPI-WAT)中分離^^-1+。從這些小鼠分離的細胞按照上文對來源于肌肉 的細胞的描述與BMP7接觸，利用定量RT-PCR評估脂肪形成標記物FAS和BAT特異標記物 UCP-I。如圖IOA和IOB所示，從既有肥胖傾向也有肥胖抗性動物中獲得的BAT和SQ-WAT 分離的ka-Ι+細胞中FAS和UCP-I的水平均提高。相反，從來自兩種動物的EPI-WAT獲得 的ka-Ι+細胞中沒有觀察到FAS水平的增加，并且未能檢測到UCP-I。值得一提的是，從肥 胖抗性1 小鼠的BAT或SQ-WAT分離的ka-Ι+細胞中UCP-I表達水平更高，BMP-7預處 理進一步誘導了這些細胞中的UCP-I的表達。
這些觀察支持了 ka-1+BAT祖細胞可以從脂肪組織中分離，BMP-7可以誘導BAT標 記物的表達。實施例4 肥胖傾向相對于肥胖抗性動物模型中，存在于肌肉的ka-Ι+細胞的利 用度和功能利用FACS和實施例3中描述的細胞分離方法評估肥胖傾向和C57B1/6 (B6)肥胖 抗性129-S6(U9)小鼠中ka-Ι+細胞的數量。如圖11所示，B6和129中的細胞總數大體相同。這一觀察提示遺傳上易 于肥胖或對肥胖抗性并不影響ka-Ι+細胞數量。為了研究分離自B6和129小鼠的細胞應答BMP7的方式是否存在功能性差別，如 實施例3所述從每種動物中分離ka-Ι+細胞，培養并與BMP7接觸。利用RT-PCR評估BAT 特異的標記物UCP-I和脂肪形成標記物PPARK的水平。如圖12A和12B所示，BMP7處理使得分離自肥胖抗性小鼠(129)的Sca-I+細胞 UCP-I表達水平增長遠遠超過在肥胖傾向動物(B6)中觀察到的增長。UCP-I的基礎水平 在肥胖抗性小鼠(129)中也高于肥胖傾向動物(B6)。相反，PPARy水平在肥胖抗性小鼠 (129)和肥胖傾向動物(B6)中相當。這些觀察結果表明，遺傳背景是ka-Ι+細胞的褐色脂肪形成潛能的決定因素。實施例5 :BMP7處理的細胞分化為非脂肪細胞譜系的能力研究了在有骨生成和肌原性分化培養基的情況下，有或沒有BMP預處理，Sca-I+ 細胞分化為不同細胞譜系的能力。具體來說，分離自肌肉的ka-Ι+細胞在用含有激素和 化學物質的骨生成或肌原性誘導混合液誘導發生分化(Peister et al. , Blood 103(5) 1662-82003)之前，用BMP-7處理。與BMP7接觸過的分離自骨骼肌的細胞未進行向 骨生成或肌原性譜系的分化。這些觀察表明，BMP7特異地使ka-Ι+細胞分化為BAT細胞。 可以從這些數據得到的另外一個結論是ka-Ι+是可以分化為WAT或BAT的脂肪形成細胞， 但是用BMP7與這些細胞接觸使得細胞定向分化為功能性BAT譜系。實施例6 :BMP7處理的祖細胞的體內植入為了確定這些BMP處理的ka-Ι+祖細胞在體內向褐色還是白色脂肪細胞分化，從 基因工程化綠色熒光蛋白(GFP)小鼠分離的BMP7處理的^^-1+細胞被注射到相同遺傳背 景但不表達GFP的小鼠的后肢和/或胸骨區。利用這種方法，可以容易地跟蹤移植細胞的命運，從而確定細胞是否具備體內自 我更新和分化的能力。從表達GFP的小鼠分離細胞并用實施例3中描述的方法培養。然后如下移植這些 細胞。將大約切IO5細胞直接注射到非GFP受體C57BL/6小鼠的后肢肌肉和側腹周圍的 皮下白色脂肪中。植入10天后，通過落射熒光術測量表明BMP-7處理的ka-Γ細胞在兩 個注射部位均發展成GFP+脂肪墊。如圖13和圖14所示，植入后10天在SQ-WAT組織中檢測到植入的BMP7處理 Sca-I+細胞。并且，植入后30天仍可檢測到BMP7處理的細胞。這些數據表明BMP7處理的細胞經受了細胞植入，并且在植入后仍有活力。實施例7 :BMP3、BMP4 和 BMP7 處理細胞利用實施例3中描述的方法從骨骼肌中分離的ka-Ι+細胞與BMP3、BMP4或BMP7接觸。然后利用定量RT-PCR以及實施例2和3中描述的方法，評估了 UCP-I、CIDEA、PPAR γ、 FAS、肌細胞生成素和MyoD的水平，用于擴增肌細胞生成素的有義和反義標記物分別是5’ -CTACAGGCCTTGCTCAGCTC-3，SEQ ID NO 345’ -TGTGGGAGTTGCATTCACTG-3，SEQ ID NO 35用于擴增MyoD的有義和反義標記物分別是5，-TGGTTCTTCACGCCCAAAAG-3，SEQ ID NO 365，-TCTGGAAGAACGGCTTCGAA-3‘ SEQ ID NO 37用于擴增ACVR-I的有義和反義標記物分別是5’ -TGCTAATGATGATGGCTTTCC-3，SEQ ID NO 385，-TTCACAGTGGTCCTCGTTCC-3，SEQ ID NO 39如圖15所示，BMP7和BMP4促進了細胞中BAT特異標記物UCP-1和CIDEA 的表達增加。這些數據表明除了 BMP7，還可以使用BMP4來促進祖細胞分化為BAT。實施例8 細胞植入ka-Ι+細胞還可以包埋在支架、基質或細胞可以附著其上的其他結構以便協助植 入。得到的組織通過一般組織學和免疫組織化學來分析上文描述的褐色和白色特異性標記 物。密切監測體重、葡萄糖和脂質代謝以及與植入有關的整體能量平衡的改變。還將從其他組織分離ka-Ι+祖細胞來確定是否分化產生褐色脂肪細胞的能力是 組織特異性的，所述其他組織包括骨骼肌、前列腺、真皮、心血管系統、乳腺、肝、新生兒皮 膚、顱蓋。實施例9 表征定型的前脂肪細胞不同BMP引發多能祖細胞定型為褐色或白色脂肪細胞。具體來說，BMP-2和BMP-4 促進分化為白色脂肪細胞系，而BMP-7促進分化為褐色脂肪細胞系。利用全面的基因組和蛋白組方法對接觸了 BMP的ka-Ι+祖細胞進行表征，以便確 定分子標志物和細胞表面標記物，生成能夠區分定型的褐色前脂肪細胞、定型的白色前脂 肪細胞和未定型的干細胞的細胞譜。這些譜將被用于根據其產生褐色或白色脂肪細胞的能 力來鑒定和挑選細胞群。基因組學方法將包括利用Affymetric芯片進行表達譜研究以及細胞培養物的 穩定同位素標記(SILAC)用于蛋白組學分析。還將在BMP處理的ka-Ι+祖細胞中研究 MicroRNA。這樣，通過研究接觸過BMP的ka-Ι+祖細胞的DNA、RNA、蛋白和MicroRNA性質， 可以生成細胞譜，以便用于鑒定能夠分化為褐色或白色脂肪細胞譜系的祖細胞群。實施例10 分析褐色和白色祖細胞在糖尿病治療中的生理相關性將ka-Ι+祖細胞和由BMP-7處理這些細胞得到的成熟褐色脂肪細胞移植到肥胖 小鼠中。然后對動物進行研究評估其體重、代謝和/或糖尿病的變化。用文中描述的方法鑒定的細胞被注射到具有不同肥胖傾向性的試驗單位模型中。 合適的動物是肥胖抗性株Ugse/SvEvhc、肥胖傾向株C57BL/6、ob/ob小鼠和db/db小鼠， 后兩種小鼠分別是瘦素和瘦素受體缺陷的。還利用Rogers和WelDb描述的方法(RogersP. and Webb G. P.，Br. J. Nutr. 43 :83-86，1980)評估了體重增長和 / 或肥胖。然后進行試驗來評價以下各項的效果(1)含有不同量或比率脂肪、碳水化合物 或蛋白的飲食，(2)使用藥物制劑，包括抗糖尿病藥物羅格列酮(rosiglitazone)進行的治 療，和/或C3)對照動物(未接受細胞)和實驗動物(接受了移植細胞)進行的運動。然后在移植之前和之后以及整個測試過程中對對照和實驗動物進行評估。通過分 析動物在體重(通過將活體動物稱重)、血清葡萄糖(通過測量活體動物的血清葡萄糖水 平)和/或血清胰島素(通過測量血清胰島素水平)方面的變化來測試動物。然后處死 一些動物，用于進一步分析。其他動物用于長期研究。其他動物利用Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS, Columbus Instruments, Columbus, OH)用于代謝評估， 該監測系統能夠測量空間活動、食物和液體消耗、溫度、產尿、代謝率，以及氧氣和二氧化碳 交換。其他實施方案應當理解，盡管本發明是結合其詳盡說明書進行的描述，以上說明書是用于闡述 而非限制發明范圍，發明范圍由所附權利要求的范圍所限定。其他方面、改良和變化也包含 在以下權利要求的范圍內。
權利要求
1.增加體外細胞群中具有褐色脂肪組織(BAT)細胞特征的細胞的數量的方法，所述方 法包括獲得包含干細胞抗原-1陽性(Sca-Ι+)祖細胞的細胞群；以及將所述體外祖細胞群與有效量的能夠促進骨形態發生蛋白(BMP)-2、-4、-6或-7中一 或多種的表達增加的化合物接觸，接觸時間足以使所述細胞群中具有褐色脂肪組織(BAT) 細胞特征的細胞的數量增加；或者，對所述細胞群進行遺傳改造，使BMP-2、-4、-6或-7中一或多種的表達水平足以 將所述細胞群中具有BAT細胞特征的細胞數量增加。
2.權利要求1的方法，還包括在第一細胞生長培養基中培養所述祖細胞群，該培養基包含0. I-IOOnM胰島素和 0. I-IOnM三碘甲腺原氨酸(Τ3)、0· 1_5 μ M異丁基甲基黃嘌呤(IBMX) ,0. l_50mM地塞米松， 和0. Ol-IOmM吲哚美辛；禾口在包含胰島素和T3的第二細胞生長培養基中培養所述祖細胞群。
3.權利要求1或2的方法，還包括將所述祖細胞群與一或多種下列化合物接觸 BMP-U BMP-3、過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPAR(y )、類視黃醇X受體α (RxRa)、 胰島素、Τ3、噻唑烷二酮(TZD)、維生素Α、視黃酸、胰島素、糖皮質激素或其激動劑、無翅型 (Wnt)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、轉 化生長因子(TGF)-a、TGF-β、腫瘤壞死因子a (TNF a )、巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)、 血管內皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)。
4.權利要求1的方法，其中所述祖細胞群獲得自骨骼肌、前列腺組織、真皮組織、來自 心血管系統的組織、乳腺組織、肝組織、新生兒皮膚、顱蓋、骨髓、小腸組織、脂肪組織，以及 脂肪組織沉積物。
5.權利要求1的方法，其中所述祖細胞群從骨骼肌獲得。
6.權利要求1的方法，所述祖細胞群包含至少60%ka-Ι+祖細胞。
7.權利要求1的方法，其中所述化合物是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7激動劑中的一或 多種。
8.權利要求1的方法，其中所述化合物是BMP-7或BMP-4激動劑。
9.權利要求1的方法，其中所述具有BAT細胞特征的細胞與未處理的ka-Ι+祖細胞相 比，表達更高水平的解偶聯蛋白(UCP-I)和誘導細胞死亡的DFF45樣效應因子A(CIDEA)。
10.權利要求2的方法，其中第一細胞生長培養基包含20nM胰島素和InM三碘甲腺原 氨酸(T3)、0. 5 μ M異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、5mM地塞米松和0. 125mM吲哚美辛。
11.細胞群，通過權利要求1-10之一的方法制得。
12.藥物組合物，含權利要求11的細胞群和可藥用載體。
13.細胞遞送系統，包含儲存容器以及與該儲存容器有液相接觸的遞送裝置，所述儲存 容器含有存在于可藥用載體中的權利要求11所述的細胞群。
14.促進受試對象的褐色脂肪形成的方法，所述方法包括挑選需要治療的受試對象；將權利要求1-9之一的方法獲得的細胞群給予受試對象，其中所述方法有效地增加受 試對象中具有BAT細胞特征的細胞的數量。
15.權利要求14的方法，其中所述包含干細胞抗原-1陽性(Sca-Ι+)祖細胞的細胞群 從挑選接受治療的受試對象獲得。
16.權利要求14的方法，其中所述受試對象需要治療肥胖癥或與體重相關的疾病。
17.權利要求14的方法，其中所述受試對象需要減少脂肪儲存、降低體重，和/或提高 對胰島素的敏感度。
18.權利要求14的方法，其中所述方法有效地增加受試對象中的褐色脂肪形成。
19.權利要求14的方法，其中所述受試對象是人。
20.權利要求14的方法，其中所述受試對象是食用性動物。全文摘要
治療肥胖癥及相關疾病的方法和組合物。所述方法包括使用經BMP-2、-4、-5、-6和/或-7處理過的Sca-1+祖細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102083969SQ200980126155
公開日2011年6月1日 申請日期2009年5月6日 優先權日2008年5月6日
發明者曾玉華, 蒂姆.J.舒爾茨 申請人:喬斯林糖尿病中心股份有限公司