專利名稱：大宗化學品的生物合成的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及使用重組微生物和化學/酶體系來講醛和/或酮轉化為各種大宗化學品或生物燃料，例如，異辛烷。
背景技術：
目前面臨的問題是，石油的全球儲量下降并且石油促使溫室氣體的排放超過 30%，從而導致全球變暖。全球每年消耗8000億桶燃料油。采油機和噴氣機燃料占全球燃料油的50%以上。已通過了重要法案，要求燃料生產商限制或降低燃料油的生產和使用中的碳排放量。燃料生產商正在尋找基本上類似的、低碳燃料，其可以混合并且通過現有的基礎設施 (例如，精煉廠、管線、油輪)來分配。由于石油成本的增加并且依賴于石油化工原料，化工廠也在尋找改善利潤和價格穩定性同時降低其環境足跡的方法。化工廠正在致力于發展更加綠色的產品，其比現有的產品更具有能量、水和co2。由生物來源產生的燃料(例如，生物質)表現出上述進程中的一個方面。用于將生物質轉換為生物燃料的許多現有方法主要是使用木質纖維素生物質 (lignocellulolic biomass) 0然而，使用這種方法產生了許多相關問題。木質纖維素生物質的大量種植需要相當大量的種植土地，這僅僅可通過以生產能源作物來代替生產糧食作物、砍伐森林以及通過復墾現在未開墾土地來實現。其他問題包括水的可利用性和品質降低并且殺蟲劑和肥料的使用增加。使用生物體系使木質纖維素生物質降解表現出相當大的挑戰，因為木質纖維素生物質的非常大的機械強度和復雜的化學組分。需要大約三十種不同的酶使木質纖維素完全轉化為單糖。這種復雜方法唯一可利用的代替方法需要相當大量的熱量、壓力和強酸。因此，本領域技術人員需要經濟且技術上簡單的方法用于將生物質轉化為烴，從而用作生物燃料或生物石油。美國申請第12Λ45，537號和第12/M5，540號描述了使用重組微生物從生物質生產各種生物燃料并且還描述了使用這些重組微生物從源自生物質的糖類來生產各種醛，例如，丁醛和異丁醛。2，2，4_三甲基戊烷(也稱為異辛烷)是辛烷的異構體，其限定了辛烷等級量表上的100點。異辛烷代表汽油中的重要成分。在石油工業中大規模生產異辛烷，通常作為與相關烴類的混合物。石油工業通常依賴于烷基化工藝來生產異辛烷，所述工藝使用強酸性催化劑用異丁烯烷基化異丁烷。而且，現有的石油儲備對于汽油而言越來越沒有用，因為辛烷含量很低，并且添加辛烷的能力可增加現有石油儲備的有用性。因此，本領域技術人員需要環境友好地且技術簡單的方法用于生產異辛烷以及其他相關生物燃料。
圖1表示異丁醛可在體內轉化為2，4，4-三甲基-1，3-戊二醇的示范性的路徑。圖2表示從含有pTrcTM1559的DHlOB菌株(A)的3-羥基-2，2，4-三甲基戊醛的制備及其對照質粒(B)，通過GC-MS來測量。圖3表示含有pTrcTM1559的DHlOB菌株(A)的2-乙基-2-己烯-1-醛的制備及其對照質粒(B)，通過GC-MS來測量。圖4表示含有pTrcTM1559的DHlOB菌株(A)的2- 丁基-2-辛烯-1-醛的制備及其對照質粒(B)，通過GC-MS來測量。發明概述本發明的實施方式總體上涉及制備大宗化學品或其中間體的方法，所述方法包括用醛、酮或這兩者的來源來使重組微生物生長，其中所述重組微生物包括(i)至少一種編碼且表達具有醛縮酶活性的多肽的外源性多核苷酸；和(ii)至少一種編碼且表達具有醛脫氫酶活性的多肽的外源性多核苷酸，其中所述多核苷酸中的至少一種是外源性的，從而制備大宗化學品或其中間體。在一些實施方式中，所述大宗化學品或其中間體選自下列通式
權利要求
1.一種制備大宗化學品或其中間體的方法，所述方法包括用醛、酮或這兩者的來源使重組微生物生長，其中，所述重組微生物包括(i)至少一種編碼且表達具有醛縮酶活性的多肽的多核苷酸；和(ii)至少一種編碼且表達具有醇脫氫酶活性的多肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸中的至少一種是外源性的，從而制備所述大宗化學品或其中間體。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述大宗化學品或其中間體選自下列通式 OH
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述大宗化學品進一步酶或化學地轉化為其相應的烷烴。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述大宗化學品選自3-羥基-2，2，4-三甲基戊醛和2，2，4_三甲基-1，3-戊二醇。
5.如權利要求4所述的方法，其中，2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇進一步酶或化學地轉化為2，2，4_三甲基戊烷。
6.如權利要求1所述的方法，其中，所述大宗化學品選自3-羥基-2-乙基己醛，2-乙基-2-己烯-1-醛，2-乙基己醛和2-乙基己醇。
7.如權利要求6所述的方法，其中，2-乙基己醇進一步酶或化學地轉化為2-乙基己焼。
8.如權利要求1所述的方法，其中，所述大宗化學品選自3-羥基-2-丁基-1-辛醇， 2- 丁基-2-辛烯-1-醛，2- 丁基-辛醛和2- 丁基-辛醇。
9.如權利要求8所述的方法，其中，2-丁基-辛醇進一步酶或化學地轉化為2- 丁基—羊焼。
10.如權利要求1所述的方法，其中，所述醛、酮或這兩者的來源是包括醛和/或酮生物合成路徑的重組微生物，所述生物合成路徑選自乙醛、丙醛、戊二醛、丁醛、異丁醛、2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛、4-甲基-戊醛、己醛、辛醛、苯基乙醛、2-苯基乙醛、2-(4-羥基苯基)乙醛、2-吲哚-3-乙醛、5-氨基-戊醛、琥珀酸半醛、和琥珀酸4-羥基苯基乙醛生物合成路徑、及其組合。
11.如權利要求10所述的方法，其中，所述包括醛和/或酮生物合成路徑的重組微生物與權利要求1所述的重組微生物相同。
12.如權利要求10所述的方法，其中，所述包括醛和/或酮生物合成路徑的重組微生物與權利要求1所述的重組微生物不同。
13.如權利要求10所述的方法，其中，所述醛和/或酮生物合成路徑包括異丁醛生物合成路徑，并且其中所述醛是異丁醛。
14.如權利要求10所述的方法，其中所述醛和/或酮生物合成路徑包括丁醛生物合成路徑，并且其中所述醛是丁醛。
15.如權利要求1所述的方法，其中，所述至少一種編碼且表達具有醛縮酶活性的多肽的多核苷酸包括(i)與SEQ ID NOS :51-82中所列舉的至少一種核苷酸序列具有至少 80%，90%，95%，98%或99%同源性的核苷酸序列，或(ii)在中等嚴格條件下，與SEQ ID NOS :51-82中所列舉的至少一種核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
16.如權利要求1所述的方法，其中，所述具有醛縮酶活性的多肽包括至少一種生物活性模體，所述生物活性模體選自SEQ ID NOS =223-244,255-260中所列舉的氨基酸序列。
17.如權利要求1所述的方法，其中所述至少一種編碼且表達具有醇脫氫酶活性的多肽的多核苷酸包括⑴與 SEQ ID NOS :1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，30， 31，33或83-96中所列舉的核苷酸序列具有至少80 %，90 %，95 %，98 %或99 %同源性的核苷酸序列，或( )在中等嚴格條件下，與 SEQ ID NOS 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23， 25，27，四，30，31，33或83-96中所列舉的至少一種核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
18.如權利要求1所述的方法，其中，所述具有醇脫氫酶活性的多肽包括煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、煙堿腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADP+)或NADPH結合模體中的至少一種。
19.如權利要求18所述的方法，其中，所述NAD+，NADH,NADP+或NADPH 結合模體選自Y-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO :245)，Y-X-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO :246)， Y-X-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO 247),Y-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO :248)，Y-X-X-G-G-X-X-Y(SEQ ID NO 249), Y-X-X-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO 250)，Y-X-G-X-Y(SEQ ID NO :251)， Y-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO :252)，Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO 253)和 Y-X-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO 254)；其中，Y獨立地選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，其中，G是甘氨酸，并且其中，X獨立地選自基因編碼的氨基酸。
20.如權利要求1所述的方法，其中所述重組微生物進一步包括至少一種編碼且表達具有雙鍵還原酶活性的多肽的多核苷酸、和/或至少一種編碼且表達具有脫水酶活性的多肽的多核苷酸。
21.如權利要求20所述的方法，其中，所述至少一種編碼且表達具有雙鍵還原酶活性的多肽的多核苷酸包括(i)與SEQ ID NOS :35-50中所列舉的多核苷酸序列具有至少80%， 90%，95%，98%或99%同源性的核苷酸序列，或(ii)在中等嚴格條件下，與SEQ ID NOS 35-50中所列舉的至少一種核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
22.—種重組微生物，包含(i)至少一種編碼且表達具有醛縮酶活性的多肽的多核苷酸；和(ii)至少一種編碼且表達具有醇脫氫酶活性的多肽的多核苷酸。
23.如權利要求22所述的重組微生物，其中，所述微生物能夠將醛、酮或這兩者的來源轉化為大宗化學品或其中間體，其中所述大宗化學品或其中間體選自下述通式
24.如權利要求22所述的重組微生物，進一步包括(iii)至少一種編碼且表達醛和/ 或酮生物合成路徑的多核苷酸。
25.如權利要求M所述的重組微生物，其中，所述微生物能夠將合適的單糖或合適的寡糖轉化為大宗化學品或其中間體，其中所述大宗化學品或其中間體選自下列通式 OHRI^Y^O — RI^Y^O — RI^^^O — RI^^OH R2R2R2R2其中 Rl 選自下組H，CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3)，CH3 (CH2)nCH2, CH3CH(CH3) (CH2)nCH2 和 CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2 ；以及其中 R2 選自下組H，CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2)nCH2, CH3CH(CH3) (CH2)nCH2, CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2,其中 η = 0-30。
26.如權利要求22所述的重組微生物，其中所述至少一種編碼且表達醛和/或酮生物合成路徑的多核苷酸包括選自下列的路徑乙醛、丙醛、戊二醛、丁醛、異丁醛、2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛、4-甲基戊醛、己醛、辛醛、苯基乙醛、2-苯基乙醛、2-(4-羥基苯基)乙醛、 2-吲哚-3-乙醛、5-氨基-戊醛、琥珀酸半醛以及琥珀酸4-羥基苯基乙醛生物合成路徑、 及其組合。
27.如權利要求沈所述的重組微生物，其中，所述醛和/或酮生物合成路徑包括異丁醛生物合成路徑，并且其中所述醛是異丁醛。
28.如權利要求6所述的重組微生物，其中所述醛和/或酮生物合成路徑包括丁醛生物合成路徑，并且其中所述醛是丁醛。
29.如權利要求6所述的重組微生物，其中所述醛和/或酮生物合成路徑包括己醛生物合成路徑，并且其中所述醛是己醛。
30.如權利要求22所述的重組微生物，其中，所述至少一種編碼且表達具有醛縮酶活性的多肽的多核苷酸包括(i)與SEQ ID NOS :51-82中所列舉的至少一種核苷酸序列具有至少80 %，90 %，95 %，98 %或99 %同源性的核苷酸序列，或(i i)在中等嚴格條件下，與SEQ ID NOS :51-82中所列舉的至少一種核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
31.如權利要求22所述的重組微生物，其中具有醛縮酶活性的多肽包括至少一種生物活性模體，所述模體選自SEQ ID NOS :223-對4，255460中所列舉的氨基酸序列。
32.如權利要求22所述的重組微生物，其中，所述至少一種編碼且表達具有醇脫氫酶活性的多肽的多核苷酸包括(i)與 SEQ ID NOS :1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25， 27，29，30，31，33或83-96中所列舉的核苷酸序列具有至少80%，90%，95%，98%或99%同源性的核苷酸序列，或( )在中等嚴格條件下，與SEQ ID NOS 1，3，5，7，9，11，13，15，17， 19，21，23，25，27，29，30，31，33或83-96中所列舉的至少一種核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
33.如權利要求22所述的重組微生物，其中，具有醇脫氫酶活性的多肽包括煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、煙堿腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADP+)或NADPH結合模體中的至少一種。
34.如權利要求33所述的重組微生物，其中，所述NAD+，NADH,NADP+或NADPH結合模體選自下組Y-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO :245)，Y-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO :246)， Y-X-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO 247),Y-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO :248)，Y-X-X-G-G-X-X-Y(SEQ ID NO 249), Y-X-X-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO :250)，Y-X-G-X-Y(SEQ ID NO :251)， Y-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO :252)，Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO :253)和 Y-X-X-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO 254)；其中，Y獨立地選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，其中G是甘氨酸，并且其中X獨立地選自基因編碼的氨基酸。
35.如權利要求22所述的重組微生物，所述微生物進一步包括至少一種編碼且表達具有雙鍵還原酶活性的多肽的多核苷酸和/或至少一種編碼且表達具有脫水酶活性的多肽的多核苷酸。
36.如權利要求35所述的重組微生物，其中，所述至少一種編碼且表達具有雙鍵還原酶活性的多肽的多核苷酸包括(i)與SEQ ID NOS :35-50中所列舉的核苷酸序列具有至少 80%，90%，95%，98%或99%同源性的核苷酸序列，或(ii)在中等嚴格條件下，與SEQ ID NOS :35-50中所列舉的至少一種核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
37.一種制備大宗化學品或其中間體的方法，所述方法包括用合適的單糖或寡糖的來源使第一重組微生物生長，其中所述第一重組微生物包括(i)醛或酮生物合成路徑，(ii) 至少一種編碼且表達具有醛縮酶活性的多肽的多核苷酸；以及(iii)至少一種編碼且表達具有醇脫氫酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸中的至少一種是外源性的，從而生成所述大宗化學品或其中間體。
38.如權利要求37所述的方法，其中，所述合適的單糖或寡糖的來源包括第二重組微生物，所述第二重組微生物能夠在源自生物質的多糖上生長作為單一的碳來源。
39.如權利要求38所述的方法，其中，所述源自生物質的多糖選自藻酸鹽和膠質。
40.一種制備大宗化學品或其中間體的方法，所述方法包括用源自生物質的多糖使重組微生物生長，其中，所述重組微生物能夠在源自生物質的多糖上生長作為單一的碳來源， 并且其中，所述重組微生物包括(i)醛或酮生物合成路徑，(ii)至少一種編碼且表達具有醛縮酶活性的多肽的多核苷酸；以及(iii)至少一種編碼且表達具有醇脫氫酶活性的多肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸中的至少一種是外源性的，從而生成所述大宗化學品或其中間體。
41.如權利要求40所述的方法，其中，所述源自生物質的多糖選自藻酸鹽和膠質。
42.一種重組微生物，所述重組微生物包括(i)醛或酮生物合成路徑，(ii)至少一種編碼且表達具有醛縮酶活性的多肽的多核苷酸；以及(iii)至少一種編碼且表達具有醇脫氫酶活性的多肽的多核苷酸。
43.如權利要求42所述的重組微生物，其中所述重組微生物能夠在源自生物質的多糖上生長作為單一的碳來源。
44.如權利要求1-40任一項所述的重組微生物，其中所述微生物選自醋酸桿菌、無色菌、嗜酸化能異養菌、不動桿菌、馬杜拉放線菌、游動放線菌、超嗜熱古菌、土壤桿菌、產堿桿菌、菠蘿(M)、土壤細菌、黑曲霉、華麗曲霉、蜂蜜曲霉、粉狀曲霉、佐氏曲霉、醬油曲霉、宇佐美曲霉、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、 遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、軟化芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、短短芽孢桿菌、洋蔥伯克霍爾德桿菌、柱狀念珠菌、皺褶念珠菌、番木瓜(L)、纖維菌屬、 假頭狀孢子頭、毛殼菌、細麗毛殼、梭狀芽胞桿菌、酪酸梭狀芽孢桿菌、丙酮丁醇貝氏梭狀芽胞桿菌、熱纖梭狀芽孢桿菌、棒狀桿菌(谷氨酸棒桿菌)、Corynebacterium efficiens, 大腸桿菌、腸球菌、菊歐氏桿菌、Gliconobacter、木葡糖醋酸桿菌、嗜鹽古細菌、特異腐質酶、Humicola nsolens、西唐北里孢菌、克雷伯氏菌、奧克西托克雷白桿菌、克魯維酵母菌、 脆壁克魯維酵母菌、乳酸克魯維酵母菌、考克氏菌、Lactlactis、乳酸菌、發酵乳酸菌、清酒乳酸菌、乳球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、甲基孢囊菌、西西里甲烷葉菌、嗜器官產甲烷菌、布氏甲烷桿菌、蛾微桿菌、溶壁微球菌、小月菌、爪哇毛霉菌、分支桿菌、漆斑菌、消化桿菌、亞硝化單胞菌、諾卡氏菌、番木瓜、足球菌、嗜鹽片球菌、青霉菌、沙門柏干酪青霉菌、橘青霉、 Penicillium emersonii、藍酪青霉菌、淡紫青霉菌、多色青霉菌、異養硝化-好氧反硝化菌、 丙酸桿菌、假單胞菌、熒光假單胞菌、脫氮假單胞菌、火球菌、嗜熱古細菌、掘越氏熱球菌、根瘤菌、米赫根毛霉、微小根毛霉、根霉、德氏根霉、日本根霉、雪白根霉、稻根霉、少孢根霉、紅球菌、釀酒酵母菌、核盤菌、多食鞘氨醇桿菌、鞘氨醇菌、鞘氨醇單胞菌、鏈球菌、Y-I嗜熱鏈球菌、鏈霉菌、灰色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、鼠灰鏈霉菌、銹棕色鏈霉菌、紫紅色鏈霉菌、茂原鏈輪絲菌、四聯球菌、棲熱菌、泛養球硫細菌、栓菌屬、木霉、長梗木霉、里氏木霉、綠色木霉、 青霉毛孢子菌、溶藻孤菌、黃單胞菌、酵母菌、魯氏酵母、發酵單胞菌、運動發酵單胞菌。
45.一種由權利要求1、37或40中的任一項所述的方法制備的大宗化學品。
46.一種混合的大宗化學品，所述大宗化學品包括權利要求45所述的大宗化學品和精煉制備的石油產品。
47.如權利要求46所述的混合的大宗化學品，其中，所述大宗化學品選自異辛烷，2-乙基己烷和2-丁基辛烷。
48.如權利要求46所述的混合的大宗化學品，其中所述精煉制備的石油產品選自汽油、噴氣機燃料和柴油燃料。
49.一種制備富含精煉制備的石油產品的大宗化學品的方法，所述方法包括(a)將精煉制備的石油產品與由權利要求1、37或40任一項所述的方法制備的大宗化學品混合；從而制備富含精煉制備的石油產品的大宗化學品。
全文摘要
本發明提供用于將合適的單糖或寡糖(例如源自生物質的那些單糖或寡糖)以及各種醛和/或酮轉化為大宗化學品(例如生物燃料)的方法、酶、重組微生物和微生物體系。本發明還提供由本文所述的方法制備的大宗化學品。本發明還提供富含精煉制備的石油產品的大宗化學品及其制備方法。
文檔編號C12P7/04GK102245779SQ200980150817
公開日2011年11月16日 申請日期2009年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者A·J·沃加奇, A·赫爾曼, 吉國靖雄 申請人:生物結構實驗室公司