包含血紅蛋白受體的腦膜炎球菌疫苗的制作方法

專利名稱：包含血紅蛋白受體的腦膜炎球菌疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及腦膜炎球菌疫苗的領域。
背景技術：
目前正在研究針對血清群B腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis) (“Men-B “)的各種疫苗。一些疫苗基于外膜囊泡(OMV)，例如諾華疫苗(Novartis Vaccines)的 MENZB 產品、芬雷研究院(Finlay Institute)的 VA-MENGOC-BC 產品、挪威公共衛生研究院(Norwegian Institute of Public Health)的 MENBVAC 產品。其它疫苗基于重組蛋白，例如參考文獻1中諾華疫苗報道的“血清群B腦膜炎球菌通用疫苗”。

發明內容
本發明考慮使用腦膜炎球菌血紅蛋白受體，HmbR作為疫苗抗原。然而，與參考文獻2不同，HmbR不是作為唯一抗原包含在疫苗中。其與一種或多種其它腦膜炎球菌抗原聯合包含以便提供更寬和更好的免疫應答。本發明提供包含腦膜炎球菌HmbR抗原和腦膜炎球菌外膜囊泡的免疫原性組合物。本發明還提供⑴超表達HmbR的腦膜炎球菌細菌，和(ii)從此類細菌制備的外膜囊泡，和(iii)從此類細菌產生囊泡的方法。本發明還提供包含hmbR基因的腦膜炎球菌，該基因的表達非相可變(phase variable) 0本發明還提供組成型表達HmbR的腦膜炎球菌。本發明還提供包含在誘導型啟動子控制下的hmbR基因的腦膜炎球菌。本發明還提供⑴從此類細菌制備的外膜囊泡，和 ( )從此類細菌產生囊泡的方法。本發明還提供包含腦膜炎球菌HmbR抗原和一種或多種以下腦膜炎球菌抗原的免疫原性組合物fHBP ；287 ；NadA ；NspA ；NhhA ；App ；0mp85 和 / 或 L0S。本發明還提供⑴表達腦膜炎球菌HmbR的非腦膜炎球菌細菌，和(ii)從此類非腦膜炎球菌細菌制備的外膜囊泡，和(iii)從此類細菌產生囊泡的方法。本發明提供包含腦膜炎球菌HmbR抗原和偶聯的腦膜炎球菌莢膜糖的免疫原性組合物。本發明還提供包含下式所示氨基酸序列的雜交多肽-A-[-X-L-Jn-B-式中X是包含腦膜炎球菌抗原序列的氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A 是任選的N-末端氨基酸序列，B是任選的C-末端氨基酸序列，η是大于1的整數，條件是至少一個X部分是HmbR抗原。優選的非HmbR X部分是fHBP ；287 ；NadA ；NspA ；NhhA ；App和/或0mp85。這些雜交多肽可形成免疫原性組合物的一部分。本發明還提供包含以下的混合物的免疫原性組合物(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO 4的多肽；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO 5的多肽；(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO 6的多肽；和(iv)HmbR抗原。參考文獻1和3公開了⑴和(ii)和(iii)的混合物。本發明還提供包含氨基酸序列SEQ ID NO :20的多肽，條件是所述多肽長度短于 500 個氨基酸,例如< 400aa、< 300aa、< 200aa。本發明還提供包含氨基酸序列SEQ ID NO :21的多肽，條件是所述多肽長度短于 750個氨基酸，例如< 750aa、< 700aa。本發明還提供包含氨基酸序列SEQ ID NO 22的多肽，條件是所述多肽不包括(i) 位于所述多肽中SEQ ID NO 22上游和(ii)與SEQ ID NO 19的氨基酸1_23相同的序列。HmbR本發明組合物包含腦膜炎球菌HmbR抗原。全長HmbR序列包含在腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因組序列中[109]，作為基因NMB1668(本文的SEQ ID NO :7)。參考文獻2報道了不同菌株的HmbR序列(本文的SEQ ID NO :8)。本文的實施例報道了從菌株 NZ05/33克隆SEQ ID NO :19。SEQ ID NO 7和8的長度相差1個氨基酸，二者具有94. 2% 相同性。SEQ ID NO 19比SEQ ID NO 7短1個氨基酸，CLUSTALW檢測到它們具有99%相同性(一處插入，7處不同)。本發明可利用任何此類HmbR多肽。本發明可利用包含全長HmbR序列的多肽，但常利用包含部分HmbR序列的多肽。因此，在一些實施方式中，本發明所用的HmbR序列可包含與SEQ ID NO 7具有至少i %序列相同性的氨基酸序列，其中i的數值為50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它實施方式中， 本發明所用的HmbR序列可包含SEQ ID NO 7的至少j個毗連氨基酸的片段，其中j的數值為 7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高。在其它實施方式中，本發明所用的HmbR序列可包含以下氨基酸序列(i)與SEQ ID NO :7具有至少序列相同性和/或(ii)包含SEQ ID NO 7的至少j個毗連氨基酸的片段。j個氨基酸的優選片段包含SEQ ID NO :7的表位。此類表位通常包含位于HmbR 表面上的氨基酸。有用的表位包括含有參與HmbR結合血紅蛋白的氨基酸的那些表位，因為結合這些表位的抗體可阻斷細菌結合宿主血紅蛋白的能力。參考文獻4研究了 HmbR的拓撲學特征及其關鍵的功能殘基。保留跨膜序列的片段是有用的，因為它們可展示在細菌表面，例如囊泡中。HmbR的長片段的例子對應于SEQ ID NO :21和22。然而，如果利用可溶性 HmbR，可利用省去跨膜序列的序列，但通常保留胞外部分的表位。本發明的最有用的HmbR抗原可引發抗體，給予對象后，其能結合氨基酸序列SEQ ID NO :7構成的腦膜炎球菌多肽。本發明優選利用的HmbR抗原在給予對象后能引發殺菌性抗-腦膜炎球菌抗體。與參考文獻5不同，本發明的HmbR抗原通常不與莢膜糖抗原偶聯。外膜囊泡和合適的產囊泡腦膜炎球菌菌株本發明的一個實施方式提供包含(a)腦膜炎球菌HmbR抗原和(b)腦膜炎球菌外膜囊泡的免疫原性組合物。可以分別制備這兩種組分(a)和(b)，然后混合得到免疫原性組合物[21]。本發明的另一實施方式提供從超表達腦膜炎球菌HmbR抗原的腦膜炎球菌細菌制備的外膜囊泡。還提供此類超表達菌株[21]。從這些菌株制備的囊泡優選包含HmbR抗原，其應采取囊泡中的免疫可接近形式，即，抗-HmbR抗體應能結合囊泡中存在的HmbR。這些外膜囊泡包括由腦膜炎球菌外膜的破壞或發泡形成包含外膜蛋白組分的囊泡而獲得的任何脂蛋白體囊泡。因此該術語包括OMV(有時稱為“小泡”)、微囊泡(MVW]) 和“天然 OMV” ( “N0MV” [7]))。MV和NOMV是天然產生的膜囊泡，在細菌生長期間自發形成，并釋放到培養基中。 MV可通過以下方法獲得在肉湯培養基中培養奈瑟球菌(Neisseria)，將全細胞與肉湯培養基中較小的MV分離(例如，通過過濾或低速離心，只沉淀細胞而不沉淀較小囊泡)，然后從細胞耗盡的培養基中收集MV(例如，通過過濾、差速離心或MV聚集，通過高速離心以沉淀 MV)。一般可以根據培養基中產生的MV的量來選擇用于生產MV的菌株，例如，參考文獻8 和9描述了具有高MV產量的奈瑟球菌。從細菌人工制備0MV，可以利用去污劑處理(例如用脫氧膽酸鹽)或通過非去污劑方式(例如參見參考文獻10)進行制備。形成OMV的技術包括用膽酸鹽去污劑(例如，石膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、烏索膽酸等的鹽，優選用脫氧膽酸鈉[11 和12]處理奈瑟球菌)在不會沉淀去污劑的充分高的pH下[13]處理細菌。其它技術基本可以在沒有去污劑存在下[10]利用如超聲、均化、微流化、空化、滲透壓休克、研磨、弗氏壓碎器、混合等技術進行。不使用或使用低去污劑的方法可以保留有用的抗原，如NspA[10]。 因此一種方法可以使用含有約0. 5%或更低如約0. 2%、約0. 1%、< 0. 05%或0濃度的脫氧膽酸鹽的OMV提取緩沖液。參考文獻14描述了制備OMV的有用方法，包括超濾粗制0MV，而非高速離心。該過程可以包括在超濾后進行超離心的步驟。本發明所用的囊泡可以從任何腦膜炎球菌菌株制備。所述囊泡通常來自血清群B 菌株，但是也可能從除B以外的血清群制備(例如，參考文獻13公開了血清群A的方法)， 如A、C、W135或Y。所述菌株可以屬于任何血清型(例如，1、2￡1、沘、4、14、15、16等)、任何血清亞型和任何免疫型(例如，Ll ；L2 ；L3 ；L3，3，7 ;L10等)。腦膜炎球菌可以來自任何合適的譜系，包括超侵襲性和超毒力譜系，例如以下7種超毒力譜系中的任一種亞群I ；亞群 III ；亞群IV-I ；ET-5復合體；ET-37復合體；A4簇；譜系3。通過多基因座酶電泳(MLEE)對這些譜系進行測定，但是也可以采用多基因座序列分型(MLST)對腦膜炎球菌分類[參考文獻15]，例如通過MLST將ET-37復合體分類為ST-Il復合體，ET-5復合體是ST-32 (ET-5)， 譜系3是ST-41/44，等等。可從具有以下亞型中一種的譜系制備囊泡:P1.2 ;P1.2,5 ;P1.4 ； PI. 5 ；PI. 5,2 ；PI. 5，c ；PI. 5c, 10 ；PI. 7，16 ；PI. 7，16b ；PI. 7h，4 ；PI. 9 ；PI. 15 ；PI. 9，15 ； PL 12，13 ；PL 13 ；PL 14 ；PL 21，16 ；PL 22，14。可從野生型腦膜炎球菌菌株或突變型腦膜炎球菌菌株(包括經工程改造超表達腦膜炎球菌HmbR抗原的菌株)制備本發明所用的囊泡。例如，參考文獻16公開了從含有修飾的fur基因的腦膜炎奈瑟球菌獲得囊泡。參考文獻25教導了應通過同時敲除porA和 cps上調nspA的表達。參考文獻25-27公開了用于OMV產生的腦膜炎奈瑟球菌的其它敲除突變體。參考文獻17公開了其中fHBP上調的囊泡。參考文獻18公開了從經修飾表達6 種不同PorA亞型的菌株構建囊泡。還可利用通過敲除參與LPS生物合成的酶獲得的內毒素水平低的突變型奈瑟球菌[19、20]。這些或其它突變體均可用于本發明。因此，在一些實施方式中，本發明所用的菌株表達一種以上PorA亞型。之前構建
5了 6-價和9-價PorA菌株。該菌株可表達2、3、4、5、6、7、8或9種PorA亞型P1. 7，16 ； Pl. 5-1,2-2 ；Pl. 19，15-1 ；Pl. 5-2,10 ；Pl. 12-1,13 ；Pl. 7-2,4 ；Pl. 22，14 ；Pl. 7-1,1 和 / 或 Pl. 18-1,3,6.在其它實施方式中，可下調菌株的PorA表達，例如，PorA的量相對于野生型水平(例如相對于參考文獻四公開的H44/76菌株)減少了至少20% (例如，^ 30%, 彡40%、彡50%、彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%等)，或甚至被敲除。在一些實施方式中，菌株可以超表達(相對于相應的野生型菌株)某些蛋白質。 例如，菌株可以超表達NspA、蛋白287 [21]、fHBP[17]、TbpA和/或TbpB [22]、Cu、Zn-超氧化物歧化酶[22]等。如上所述，在一些實施方式中，腦膜炎球菌超表達(相對于相應的野生型菌株)HmbR抗原。因此，可將HmbR的編碼基因置于導致表達超過野生型菌株的啟動子的啟動子控制下，或者可給菌株提供非天然HmbR編碼序列，例如通過整合入染色體或質粒內。對于囊泡生產，優選對腦膜炎球菌進行遺傳工程改造以確保具有不會發生相變異的hmbR基因。參考文獻23公開了減少或消除腦膜炎球菌中基因表達相變異的方法。例如，可將hmbR基因置于組成型或誘導型啟動子的控制下，或通過去除或取代負責其相變異的DNA基序。在一些實施方式中，菌株可以包括一個或多個敲除和/或參考文獻M-27公開的超表達突變。要下調和/或敲除的優選基因包括(a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB、LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC、PorB, SiaA, SiaB, SiaC、SiaD, TbpA 和 / 或 TbpB [24] ； (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB、LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB[25] ； (c)ExbB,ExbD, rmpM、CtrA> CtrB> CtrD> GalE、LbpA> LpbB> Opa> Opc> PilC、PorB> SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、 TbpA 和 / 或 TbpB[26]；禾口 (d)CtrA、CtrB, CtrD, FrpB, OpA、OpC, PilC、PorB, SiaD、SynA、 SynB 和 / 或 SynC [27]。在一些實施方式中，使用突變型菌株時，其可具有一個或多個或全部的以下特征 ⑴LgtB和/或GalE下調或敲除，以截短腦膜炎球菌LOS ； (ii) TbpA上調；(iii) NhhA上調； (iv)0mp85 上調；(V)LbpA 上調；(vi)NspA 上調；(vii)PorA 敲除；(viii)FrpB 下調或敲除； (ix) Opa下調或敲除；(X)Opc下調或敲除；(xii) cps基因復合體缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以為半乳糖缺陷型L0S。所述LOS可以沒有 α鏈。根據用于制備囊泡的腦膜炎球菌菌株，其可以包含或不包含菌株的天然HmbR抗原[28]。本發明可用含有HmbR或不含HmbR的囊泡，但如果所述囊泡是從超表達HmbR的菌株制得，其目的是為確保該囊泡含有HmbR。如果LOS存在于囊泡中，可以對囊泡進行處理，以連接其LOS與蛋白質組分(“內泡”偶聯[27])。本發明可利用不同菌株的囊泡的混合物。例如，參考文獻四公開了包含多價腦膜炎球菌囊泡組合物的疫苗，其包含衍生自在使用國度流行的血清亞型的腦膜炎球菌菌株的第一囊泡和衍生自無需具有在使用國度流行的血清亞型的菌株的第二囊泡。參考文獻30 公開了不同囊泡的有用組合。一些實施方式可利用L2和L3免疫型中各自菌株的囊泡組合。用于工程改造HmbR-超表達菌株的三種有用的背景菌株是MC58、NZ05/33和GB013。MC58具有PorA血清亞型1. 7，16 ；NZ05/33具有血清亞型1. 7-2, 4 ；GB013具有血清亞型 1. 22,9,fHBP(H因子結合蛋白)本發明組合物可包含fHBP抗原，其可以是從純化HmbR抗原分離的純化多肽或是與HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作為雜交多肽的一部分)。現已對fHBP作了詳細表征。其還稱為蛋白質'741'[參考文獻40的SEQ ID 2535 和 2536]、 ‘NMB1870，、 ‘GNA1870，[參考文獻 31-33]、 ‘P2086，、 ‘LP2086，或 ‘0RF2086’ [34-36]。它天然是一種脂蛋白，在所有腦膜炎球菌血清群中均有表達。通過 NMR測定了 fHbp的C-末端免疫顯性結構域(‘fHbpC’)的結構[37]。蛋白質的該部分形成8-鏈β-筒(eight-stranded β-barrel)，其鏈通過長度各異的環連接。該筒之前是短 α -螺旋和柔韌的N-末端尾。fHBP抗原有三種不同變體[38]，發現針對給定家族產生的血清在同一家族內具有殺菌性，但對表達其它兩個家族之一的菌株無活性，即，具有家族內交叉保護作用，但沒有家族間交叉保護作用。本發明可利用一種fHBP變體，但有用地包含來自兩或三種變體的 fHBP。因此，可利用兩種或三種不同fHBP的組合，其選自(a)第一蛋白，包含與SEQ ID NO 1有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO 1的至少χ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列；(b)第二蛋白，包含與SEQ ID NO 2有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO 2的至少y個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列；和 /或(c)第三蛋白，包含與SEQ ID NO :3有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由 SEQ ID NO 3的至少ζ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列。a 的值至少是 85，例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更高。b 的值至少是 85，例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更高。 c 的值至少是 85，例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5 或更高。a、b
和c的值彼此無關。χ 的值至少是 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y的值至少是 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。ζ 的值至少是 7， 例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、 45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y 和 ζ 的值彼此無關。如果本發明利用一種fHBP變體，組合物可包含含有以下氨基酸序列的多肽(a) 包含與SEQ ID NO 1有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO 1的至少χ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列；或(b)包含與SEQ ID NO 2有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO :2的至少y個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列；或(c)包含與SEQ ID NO 3有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO 3的至少ζ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列。如果本發明利用兩種或三種變體的fHBP，組合物可包含兩種或三種不同fHBP的組合，其選自(a)第一多肽，包含與SEQ ID NO :1有至少序列相同性的氨基酸序列和/ 或包含由SEQ ID NO :1的至少χ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列；(b)第二多肽，包含與SEQ ID NO 2有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO 2的至少 y個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列；和/或(c)第三多肽，包含與SEQ ID NO :3有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO 3的至少ζ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列。第一、第二和第三多肽具有不同的氨基酸序列。如果本發明利用兩種變體的fHBP，組合物可同時包含(a)第一多肽，包含與SEQ ID NO 1有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO 1的至少χ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列；和(b)第二多肽，包含與SEQ ID NO :2有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO :2的至少y個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序列。如果本發明利用兩種變體的fHBP，組合物可同時包含(a)第一多肽，包含與SEQ ID NO 1有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO 1的至少χ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列；(b)第二多肽，包含與SEQ ID NO 3有至少序列相同性的氨基酸序列和/或包含由SEQ ID NO :3的至少ζ個毗連氨基酸的片段構成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序列。在一些實施方式中，fHBP蛋白質可脂質化，例如在N-末端半胱氨酸處。在其它實施方式中，它們未脂質化。287本發明的組合物可包含287抗原，其可以是從純化HmbR抗原分離的純化多肽或是與HmbR抗原的相同多肽的一部分(S卩，作為雜交多肽的一部分)。287抗原包含在腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因組序列中[109]，作為基因NMB2132 (GenBank登錄號GI :7227388 ；本文的SEQ ID NO 9)。其后公開了許多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式可見于參考文獻39的圖5和15，參考文獻40 的實施例13和圖21 (其中的SEQ ID 3179到3184)。還報道了 287抗原的各種免疫原性片段。本發明所用的優選287抗原包含下述氨基酸序列(a)與SEQ ID NO :9有50%或更高相同性(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(13)包含 SEQ ID NO :9 的至少，η，個毗連氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的優選片段包含SEQ ID NO :9的表位。本發明的最有用觀7抗原可引發抗體，給予對象后，其能結合氨基酸序列SEQ ID NO 9構成的腦膜炎球菌多肽。本發明所用的優選287抗原在給予對象后可引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。NadA (奈瑟球菌粘附素A)本發明的組合物可包含NadA抗原，其可以是從純化HmbR抗原分離的純化多肽或是與HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作為雜交多肽的一部分)。NadA抗原包含在腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因組序列中[109]，作為基因NMB1994 (GenBank登錄號GI :7227256 ；本文的SEQ ID N0:10)。其后公開了許多菌株的NadA抗原序列，奈瑟球菌粘附素的蛋白質活性也有充分記錄。還報道了 NadA的各種免疫原性片段。
本發明所用的優選NadA抗原包含下述氨基酸序列(a)與SEQ ID NO 10有50% 或更高相同性(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)包含 SEQ ID NO :10 的至少，η， 個毗連氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的優選片段包含 SEQ ID NO: 10 的表位。本發明的最有用NadA抗原可引發抗體，給予對象后，其能結合氨基酸序列SEQ ID NO 10構成的腦膜炎球菌多肽。本發明所用的優選NadA抗原在給予對象后可引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。SEQ ID NO 6是一種此類片段。NspA (奈瑟球菌表面蛋白A)本發明的組合物可包含NspA抗原，其可以是從純化HmbR抗原分離的純化多肽或是與HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作為雜交多肽的一部分)。NspA抗原包含在腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因組序列中[109]，作為基因NMB0663 (GenBank登錄號GI :7225888 ；本文的SEQ ID N0:11)。之前從參考文獻41 和42已知該抗原。其后公開了許多菌株的NspA抗原序列。還報道了 NspA的各種免疫原性片段。本發明所用的優選NspA抗原包含下述氨基酸序列(a)與SEQ ID NO :11有50% 或更高相同性(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)包含 SEQ ID N0:11 的至少，η， 個毗連氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的優選片段包含 SEQ ID NO :11 的表位。本發明最有用的NspA抗原可引發抗體，給予對象后，其能結合氨基酸序列SEQ ID NO 11構成的腦膜炎球菌多肽。本發明所用的優選NspA抗原在給予對象后可引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。NhhA (奈瑟球菌hia同源物)本發明的組合物可包含NhhA抗原，其可以是從純化HmbR抗原分離的純化多肽或是與HmbR抗原的相同多肽的一部分(即，作為雜交多肽的一部分)。NhhA抗原包含在腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因組序列中[109]，作為基因NMB0992 (GenBank登錄號GI :7226232 ；本文的SEQ ID N0:12)。此后公開了許多菌株的NhhA抗原的序列，例如參考文獻39和43，還報道了 NhhA的各種免疫原性片段。其也稱為 Hsf。本發明所用的優選NhhA抗原包含下述氨基酸序列(a)與SEQ ID NO 12有50% 或更高相同性(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)包含 SEQ ID NO :12 的至少，η， 個毗連氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的優選片段包含 SEQ ID NO: 12 的表位。本發明的最有用NhhA抗原可引發抗體，給予對象后，其能結合氨基酸序列SEQ ID NO 12構成的腦膜炎球菌多肽。本發明所用的優選NhhA抗原在給予對象后可引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。App( 5 !^ 禾口白(penetration protein))
本發明的組合物可包含App抗原，其可以是從純化HmbR抗原分離的純化多肽或是與HmbR抗原的相同多肽的一部分(S卩，作為雜交多肽的一部分)。App抗原包含在腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因組序列中[109]，作為基因NMB1985 (GenBank登錄號GI :7227246 ；本文的SEQ ID N0:13)。此后公開了許多菌株的App抗原的序列。其也稱為“0RF1”和“Hap”。還報道了 App的各種免疫原性片段。本發明所用的優選App抗原包含下述氨基酸序列(a)與SEQ ID NO 13有50%或更高相同性(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高)；和 / 或(b)包含 SEQ ID NO 13 的至少，η，個毗連氨基酸的片段，其中'η'是 7 或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的優選片段包含 SEQ ID NO 13 的表位。本發明的最有用App抗原可引發抗體，給予對象后，其能結合氨基酸序列SEQ ID NO 13構成的腦膜炎球菌多肽。本發明所用的優選App抗原在給予對象后可引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。0mp85 (85kDa 外膜蛋白)本發明的組合物可包含0mp85抗原，其可以是從純化HmbR抗原分離的純化多肽或是與HmbR抗原的相同多肽的一部分(S卩，作為雜交多肽的一部分)。0mp85抗原包含在腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公布基因組序列中[109]，作為基因NMB0182 (GenBank登錄號GI =7225401 ；本文的SEQ ID N0:14)。此后公開了許多菌株的0mp85抗原的序列。0mp85的其它信息可見參考文獻44和45。還報道了 0mp85的各種免疫原性片段。本發明所用的優選0mp85抗原包含下述氨基酸序列(a)與SEQ ID NO 14有50% 或更高相同性(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和 / 或(b)包含 SEQ ID N0:14 的至少，η， 個毗連氨基酸的片段，其中'η'是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的優選片段包含 SEQ ID NO 14 的表位。
本發明的最有用0mp85抗原可引發抗體，給予對象后，其能結合氨基酸序列SEQ ID NO 14構成的腦膜炎球菌多肽。本發明所用的優選0mp85在給予對象后抗原可引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。雜交多肽在一些實施方式中，本發明提供包含式-A- [-X-L-] n-B-所示氨基酸序列的雜交多肽，式中x是包含腦膜炎球菌抗原序列的氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N-末端氨基酸序列，B是任選的C-末端氨基酸序列，η是大于1的整數(η通常是2或 3)。至少一個X部分是HmbR抗原，如上文所定義。理想地，至少一個其它X部分選自 fHBP ；287 ；NadA ；NspA ；NhhA ；App ；和 / 或 0mp85。將至少兩個(例如，2、3、4、5或更多)抗原表達成一條多肽鏈(“雜交”多肽)主要有兩個優點第一，本身不穩定或表達差的多肽可通過加入克服該問題的合適雜交伴侶來協助；第二，商業生產簡化成只需采用一次表達和純化即可產生可用作抗原的兩種多肽。如果-X-部分具有其野生形式的前導肽序列，雜交蛋白質中可包含或省去它。在一些實施方式中，除了位于雜交蛋白質的N-末端的-X-部分的前導肽，所述前導肽缺失， 即，X1的前導肽保留，而X2. . . Xn的前導肽省去。這相當于刪除所有前導肽，利用&的前導肽作為部分-A-。對于[-X-L-]的各種情況的n，接頭氨基酸序列-L-可以存在或不存在。例如， 當 η = 2 時，該雜交體可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH等。接頭氨基酸序列-L-通常較短(例如，20個或更少的氨基酸，即20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有助于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接頭(即，包含Glyn，其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)和組氨酸標簽 (即，Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。其它合適的接頭氨基酸序列是本領域技術人員顯而易見的。一種有用的接頭是GSGGGG (SEQ ID NO 15)或GSGSGGGG (SEQ ID NO: 16)，其中Gly-Ser 二肽從BamHI限制性位點形成，因而有助于克隆和操作，出17)4四肽是典型的聚-甘氨酸接頭。其它合適的接頭，特別是用作最終Ln的是Leu-Glu 二肽。-A-是任選的N-末端氨基酸序列。其通常較短(例如，40個或更少的氨基酸，即， 40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、 15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指導蛋白質運輸的前導序列或有助于克隆或純化的短肽序列(例如，組氨酸標簽，即見\，其中11 = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。 其它合適的N-末端氨基酸序列是本領域技術人員顯而易見的。如果\缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，優選-A-為提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，含1、2、3、4、5、6、7或8個氨基酸)，例如Met-Ala-Ser或單個Met殘基。-B-是任選的C-末端氨基酸序列。其通常較短(例如，40個或更少的氨基酸，即， 39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、 14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指導蛋白質運輸的前導序列，或有助于克隆或純化的短肽序列(例如，包含組氨酸標簽，即見\，其中11 = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高， 例如SEQ ID NO :17)，或增強蛋白質穩定性的序列。其它合適的C-末端氨基酸序列是本領域技術人員顯而易見的。LOS腦膜炎球菌HmbR抗原可與純化的腦膜炎球菌脂寡糖(LOQ聯用。LOS可以其本身使用，或偶聯于載體。偶聯時，偶聯可經LOS中的脂質A部分或通過任何合適的部分，例如 KDO殘基。如果LOS的脂質A部分不存在，則需要這種替代連接。本發明所用的LOS可來自任何免疫型，例如L2、L3、L7等。優選利用修飾形式，而非天然的L0S。可通過化學方法實現這些修飾，但敲除 Men-B中負責某些生物合成添加的酶更方便。例如，可修飾LOS以去除至少天然乳糖-N新四糖單位的末端fel，這種修飾可通過敲除一個或多個相關酶得以實現。可敲除負責在天然 LOS中加入兩個末端單糖(唾液酸和半乳糖)的酶，從而恰好消除末端Sia或消除Sia-Gal 二糖。例如，敲除IgtB基因去除了 Sia-Gal。敲除galE基因還提供有用的修飾LOS。可敲除脂質A脂肪轉移酶基因W6]。可從LOS中去除至少一個一級0-連接脂肪酸W7]。還可利用每個LOS分子的二級酰基鏈數量減少的LOS[48]。LOS可沒有α鏈。LOS可包含GlcNAc_!fei)2磷酸乙醇胺-KDO2-脂質從49]。
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腦膜炎球菌莢膜糖腦膜炎球菌HmbR抗原可與一種或多種腦膜炎球菌莢膜糖聯用，所述莢膜糖通常偶聯于載體蛋白。針對血清群C的偶聯單價疫苗已被批準用于人，其包括MENJUGATE 、MENINGITEC 和NEISVAC-C 。已知血清群A+C的偶聯物的混合物[50，51]，已報道了血清群A+C+W135+Y 的偶聯物的混合物[52-55]，2005年作為MENACTRA 產品得到批準。本發明組合物可包含腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中的1、2、3或4種的莢膜糖的一種或多種偶聯物，例如 A+C，A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, A+W135+Y, A+C+W135+Y，等等。理想的是包含血清群A、C、W135和Y所有四種的糖的組分。血清群A腦膜炎球菌的莢膜糖是(α 1 — 6)-連接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，其中C3和C4位有部分0-乙酰基化。C-3位的乙酰化可以是70-95%。用于純化糖的條件可導致脫-0-乙酰化(例如在堿性條件下)，但在該C-3位保留OAc是有用的。在一些實施方式中，血清群A糖中至少50% (例如，至少60%、70%、80%、90%、95% 或更多)的甘露糖胺殘基在C-3位被0-乙酰基化。乙酰基可被封閉基團取代以避免水解 [56]，這種改性的糖仍然是本發明涵義內的血清群A糖。血清群C莢膜糖是(α 2 — 9)-連接的唾液酸(N-乙酰基神經氨酸，或“NeuNAc”) 的均聚物。糖結構書寫為一9)_Neu ρ NAc 7/8 0Ac-(a2—。大多數血清群C菌株在唾液酸殘基的C-7和/或C-8位具有0-乙酰基團，但約15%的臨床分離物缺乏這些0-乙酰基[57，58]。OAc基團的存在與否產生獨特表位，抗體與糖結合的特異性可影響其對0-乙酰化(OAc+)和脫-0-乙酰化(OAc-)菌株的殺菌活性[59-61]。本發明所用的血清群C糖可以從OAc+或OAc-菌株獲得。許可的MenC偶聯物疫苗同時包含OAc-(NEISVAC-C )和 OAc+ (MENJUGATE 和MENINGITEC )糖。在一些實施方式中，用于制備血清群C偶聯物的菌株是例如血清型16，血清亞型PL 7a, 1等的OAc+菌株，。因此，可使用C: 16:P1. 7a, IOAc+ 菌株。也可使用血清亞型Pl. 1的OAc+菌株，例如Cll菌株。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖單元的聚合物。與血清群C糖一樣，其具有可變的0-乙酰化，但位于唾液酸7和9位W2]。結構書寫為一4) -D"Neup5Ac (7/90Ac)-α -(2 — 6)-D-Gal-α -(1 —。血清群Y糖類似于血清群W135糖，只是二糖重復單元包括葡萄糖而非半乳糖。與血清群W135 —樣，其在唾液酸7和9位具有可變的0-乙酰化W2]。血清群Y的結構書寫為―4)-D_Neup5Ac (7/90Ac) - α - (2 — 6)-D-Glc-α - (1 —。本發明所用的糖可以如上所述0-乙酰化(例如，與在天然莢膜糖中所見相同的0 乙酰化模式)，或者可以在糖環的一個或多個位置部分或完全脫-0-乙酰化，或者可相對于天然莢膜糖超-0-乙酰化。偶聯物中的糖部分可包含由腦膜炎球菌制備的全長糖，和/或可包含全長糖的片段，即所述糖可短于細菌中所見的天然莢膜糖。因此，糖可以解聚，解聚發生在糖純化期間或者之后、但在偶聯之前。解聚降低糖的鏈長度。一種解聚方法包括使用過氧化氫[52]。將過氧化氫加入糖中(例如，使H2O2終濃度為)，然后溫育混合物(例如在約55°C )直到實現所需的鏈長降低。另一種解聚方法包括酸水解[53]。其它解聚方法是本領域已知的。用于制備本發明所用偶聯物的糖可以通過這些解聚方法中的任一種獲得。可利用解聚提供對于免疫原性最佳的鏈長和/或為達到糖的物理可操作性而降低鏈長。在一些實施方式中， 糖具有以下平均聚合度(Dp)范圍A = 10-20 ；C = 12-22 ；W135 = 15-25 ；Y = 15-25。在分子量而非Dp方面，對于所有血清群的有用范圍是< IOOkDa ；5kDa-75kDa ；7kDa_50kDa ； 8kDa-35kDa ； 12kDa-25kDa ； 15kDa_22kDa。在一些實施方式中，腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y各自的糖的平均分子量可超過 50kDa，例如彡 75kDa，彡 IOOkDa, ^ IlOkDa, ^ 120kDa，彡 130kDa，等等[63]，甚至最高達1500kDa，具體通過MALLS測定。例如MenA糖可以處于50_500kDa，如60_80kDa范圍； MenC糖可以處于100-210kDa范圍；Menffl35糖可以處于60_190kDa，如120_140kDa范圍； 和/或MenY糖可以處于60-190kDa，如150_160kDa范圍。組合物中每種血清群的腦膜炎球菌糖的質量通常在1微克(μ g)到20 μ g之間， 例如每種血清群2-10 μ g，或約4 μ g或約5 μ g或約10 μ g。如果包括來自多于一種血清群的偶聯物，它們可以基本上相等的質量存在，例如各血清群糖的質量在彼此的+10%內。作為相等比例的替代形式，可利用雙倍質量的血清群A的糖。因此，疫苗可包含IOyg MenA 糖以及各5 μ g的MenC、W135和Y糖。優選的載體蛋白是細菌毒素，如白喉毒素或破傷風毒素，或其類毒素或突變體。這些載體通常用于偶聯物疫苗。特別優選CRM197白喉毒素突變體W4]。其它合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白復合物[65]、合成肽W6，67]、熱激蛋白W8，69]、百日咳蛋白[70，71]、細胞因子[72]、淋巴因子[72]、激素[72]、生長因子[72]、含有各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細胞表位的人工蛋白[73]如W9[74]、流感嗜血桿菌(Hameophilus influenzae)的D蛋白[75-77]、肺炎球菌溶血素[78]或其無毒衍生物[79]、肺炎球菌表面蛋白PspA[80]、鐵攝取蛋白[81]、艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B[82]、重組銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA) [83]，等等。一種載體蛋白可攜帶多種不同血清群的糖[84]，但不優選這種配置。如果組合物包含多于一種腦膜炎球菌血清群的偶聯物，則各種偶聯物可利用不同載體蛋白(例如，一種血清群偶聯于CRM197，另一種偶聯于破傷風類毒素)或者它們可利用相同的載體蛋白(例如，兩種血清群的糖分別偶聯于 CRM197，然后混合)。可使用糖蛋白質比例(w/w)在1 5 (即蛋白質過量)和5 1(即糖過量)之間的偶聯物，例如比例在1 2到5 1之間，比例在1 1.25到1 2. 5之間。如參考文獻85所述，混合物中不同的腦膜炎球菌血清群偶聯物可具有不同的糖蛋白質比例，例如一種的比例在1 2到1 5之間，而另一種的比例在5 1到1 1.99之間。載體分子可直接或經接頭共價偶聯于葡聚糖。已知各種接頭，例如，可通過將游離-NH2基團(例如通過胺化引入糖)偶聯于己二酸(采用，例如二酰亞胺活化)得到的己二酸接頭，然后將蛋白質偶聯于得到的糖-己二酸中間體[86，87]。另一優選的連接類型是羰基接頭，其可通過將修飾的葡聚糖的游離羥基與CDI反應得到[88，89]，然后與蛋白質反應形成氨基甲酸酯連接鍵。其它接頭包括丙酰胺基[90]、硝基苯基-乙基胺[91]、 鹵代酰基鹵化物[92]、糖苷鍵[93]、6_氨基己酸[94]、N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫代)_ 丙酸酯(SPDP) [95]、己二酸二酰胼(adipic acid dihydrazide)ADH[96]、C4-C12 部分 [97]等。也可采用碳二亞胺縮合反應[98]。如參考文獻99所述，混合物可包含一種糖/蛋白直接連接的偶聯物和另一種通過接頭連接的偶聯物。當使用來自不同腦膜炎球菌血清群的糖偶聯物時這種設置尤其適用， 例如MenA和MenC糖可通過接頭偶聯，而MenW135和MenY糖則直接偶聯于載體蛋白。如果組合物包含MenA、C、W和/或Y偶聯物中的一種或多種，在一些實施方式中，優選還包含Hib偶聯物(B型流感嗜血桿菌莢膜糖)。如果組合物包含來自多于一種的腦膜炎球菌血清群的糖，則每種血清群有平均糖質量。如果使用基本相等質量的各血清群，則平均質量與各單獨質量相同；如果使用不相等的質量，則平均質量不同，例如，對于 10 5 5 5μ g的MenACWY混合物，平均質量為每血清群6. 25μ g。如果還包含Hib糖， 則在一些實施方式中，其質量與每血清群的腦膜炎球菌糖的平均質量基本相同。在一些實施方式中，Hib糖的質量大于每血清群的腦膜炎球菌糖平均質量(例如，至少1.5倍)。在一些實施方式中，Hib糖的質量小于每血清群的腦膜炎球菌糖平均質量(例如，至少1.5倍)ο用于展示HmbR的非腦膜炎球菌細菌在本發明的一些實施方式中，腦膜炎球菌HmbR抗原由非腦膜炎球菌細菌，例如大腸桿菌細菌呈遞。因此，本發明提供表達腦膜炎球菌HmbR的非腦膜炎球菌細菌。該細菌通常是革蘭氏陰性細菌。理想的是大腸桿菌(Escherichia coli)細菌。所述細菌可組成型表達異源 HmbR抗原，或者hmbR基因可以處于誘導型啟動子的控制下。該菌株可具有缺陷型Tol-Pal系統，從而其在正常生長期間自發釋放囊泡，藉此避免對洗滌劑提取的任何需求，等等。大腸桿菌的此類Tol-Pal突變體公開于，例如參考文獻101和102，例如不表達功能性TolR蛋白質的菌株，如含有tolR敲除。本發明還提供從此類非腦膜炎球菌細菌制備的外膜囊泡以及從此類非腦膜炎球菌細菌產生囊泡的方法。藥物組合物可采用本發明制備給予患者的藥物組合物。這些藥物組合物通常包含藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體的充分討論見參考文獻103。可常規確定有效劑量體積，但該組合物的典型人用劑量是約0. 5ml的體積，例如以便肌內注射。通過肌內注射將0. 5ml體積的RIVM OMV疫苗給予大腿或上臂[104]。通過肌內注射將0.5ml的MeNZB 給予大腿前外側或手臂的三角肌區域。其它遞送途徑可采用類似劑量，例如霧化的鼻內OMV疫苗的體積是每次噴霧約100μ 1或約130μ 1，給予四次噴霧獲得的總劑量是約0. 5ml。本發明組合物的pH通常是6-8，更優選6.5-7.5(例如，約7)。RIVM OMV疫苗的 pH是7. 4 [105]，本發明組合物優選pH < 7. 5。利用IOmM Tris/HCl緩沖液維持RIVM OMV 疫苗的pH，可利用緩沖液，例如Tris緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液或組氨酸緩沖液維持本發明組合物的穩定PH。因此，本發明組合物通常包含緩沖液。組合物可以無菌和/或無熱原。本發明組合物對于人可以是等滲的。給予患者的本發明組合物是免疫原性的，更優選疫苗組合物。本發明疫苗可以是預防性(即，防止感染)或治療性的(即，治療感染)，但通常是預防性的。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫學有效量的抗原以及需要的任何其它組分。“免疫學有效量”表示將該用量以單劑量或作為一系列劑量的一部分給予個體對于治療或預防是有效的。該用量根據
14待治療個體的健康和身體條件、年齡、分類學組別(例如，非人靈長類、靈長類等)、該個體的免疫系統合成抗體的能力、所需保護程度、疫苗的配方、治療醫師對醫學狀況的評估和其它相關因素而有所不同。預計該用量落在通過常規試驗可確定的較寬范圍中。通常以每劑量的蛋白質含量表示本發明組合物的抗原含量。OMV鼻內疫苗的劑量通常是每毫升約0. 9 毫克蛋白質。本發明組合物可包含免疫學佐劑。因此，例如，它們可包含鋁鹽佐劑或水包油乳液 (例如，水包角鯊烯乳液)。合適的鋁鹽包括氫氧化物(例如，羥基氧化物)、磷酸鹽(例如， 羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)(例如，參見參考文獻106的第8和9章)，或它們的混合物。鹽可采取任何合適的形式(例如，凝膠、晶體、無定形等)，優選抗原吸附于鹽。給予患者的組合物中Al+++的濃度優選小于5mg/ml，例如，彡4mg/ml、彡3mg/ml、彡2mg/ml、彡lmg/ml等。優選范圍是0. 3-lmg/ml。優選最大值是0. 85mg/劑。氫氧化鋁佐劑尤其適用于腦膜炎球菌疫
田ο腦膜炎球菌影響身體的各個部分，因此本發明組合物可以制備成各種形式。例如， 可將所述組合物制備為溶液或懸浮液形式的注射劑。可利用細噴霧制備用于肺部給藥的組合物，例如通過吸入器。可制備組合物用于鼻、耳或眼部給藥，例如作為噴霧劑或滴劑。通常是肌內給藥的注射劑。本發明組合物可包含抗菌劑，特別是包裝成多劑量形式之時。疫苗中通常有抗菌劑，例如硫柳汞和2-苯氧基乙醇，但優選利用無汞防腐劑或完全不含防腐劑。本發明組合物可包含去污劑，例如吐溫(聚山梨醇酯)，如吐溫80。去污劑通常是低水平的，例如< 0.01%。本發明組合物可包含制備OMV的殘留去污劑(例如，脫氧膽酸鹽)。每μ gMen-B 蛋白的殘留去污劑含量優選低于0. 4 μ g (更優選低于0. 2μ g)。如果本發明組合物包含L0S，每μ g蛋白的LOS含量優選低于0. 12 μ g(更優選低于 0. 05 μ g)。本發明組合物可包含鈉鹽(例如，氯化鈉)以獲得張力。典型的濃度是10士2mg/ ml NaCl，例如約 9mg/ml。治療方法本發明還提供在哺乳動物中產生免疫應答的方法，包括將本發明的組合物給予該哺乳動物。免疫應答優選是保護性的，優選包括抗體。該方法可在已針對腦膜炎奈瑟球菌作過初免的患者中產生加強應答。哺乳動物優選人。如果疫苗是作預防性應用，則人優選兒童(例如，學步兒童或嬰兒)或青少年；如果疫苗是作治療性應用，則人優選成年人。打算用于兒童的疫苗也可給予成年人，例如以評估安全性、劑量、免疫原性等。本發明還提供用作藥物的本發明組合物。所述藥物優選用于在哺乳動物中產生免疫應答(即，其是免疫原性組合物)，更優選是疫苗。本發明還提供本發明組合物在制備在哺乳動物中產生免疫應答的藥物中的應用。 本發明還提供以下物質在制備在哺乳動物中產生免疫應答的藥物中的應用(i)腦膜炎球菌HmbR抗原；和(ii)腦膜炎球菌外膜囊泡。本發明還提供以下物質在制備在哺乳動物中產生免疫應答的藥物中的應用⑴腦膜炎球菌HmbR抗原；和(ii)以下腦膜炎球菌抗原中的一種或多種fHBP ；287 ；NadA ；NspA ；NhhA ；App ；0mp85 ；LOS。本發明還提供以下物質在制備在哺乳動物中產生免疫應答的藥物中的應用(i)腦膜炎球菌HmbR抗原；和(ii)腦膜炎球菌莢膜糖的偶聯糖。這些應用和方法優選用于預防和/或治療腦膜炎奈瑟球菌所致疾病，例如細菌性 (或者，更具體地說腦膜炎球菌性)腦膜炎或敗血癥。一種檢測治療性治療功效的方法包括給予本發明組合物后監測奈瑟菌感染。一種檢測預防性治療功效的方法包括給予組合物后監測針對抗原的免疫應答。本發明組合物的免疫原性可用以下方法測定將其給予測試對象(例如12-16月大的兒童或動物模型 [107])，然后檢測包括血清殺菌抗體(SBA)以及ELISA效價在內的標準參數(GMT)。這些免疫應答通常應在組合物給藥約4周后測定，并與該組合物給藥前測定的值相比較。優選SBA 提高至少4倍或8倍。如果給予多于一次劑量的組合物，可以進行多于一次的給藥后測定。本發明組合物通常在給予對象后能誘導血清殺菌抗體應答。這些應答不難在小鼠中檢測，并且是疫苗功效的標準指標。血清殺菌活性(SBA)衡量補體介導的細菌殺死作用， 可利用人或幼兔補體檢測。WHO標準要求疫苗在超過90%的受試者中誘導SBA升高至少 4-倍。給予第三劑量后4-6周，MeNZB 引發SBA升高4倍。優選組合物可以在人對象患者體內產生的抗體效價優于可接受百分比對象的血清保護力標準。抗原及相關抗體效價(高于其認為宿主對該抗原發生血清轉化)是眾所周知的，并且這些效價由例如WHO等組織公布。優選大于80%的具有統計學意義的對象樣品發生血清轉化，更優選大于90 %，還優選大于93 %，最優選96-100 %。本發明組合物通常直接給予患者。直接遞送可通過胃腸外注射(例如皮下、腹膜內、靜脈內、肌內或注射至組織間隙)，或通過任何其它合適途徑實現。本發明可用于引發全身性和/或粘膜免疫力。優選肌內給藥至大腿或上臂。注射可以通過針頭(例如皮下針頭)，但還可采用無針頭注射。典型的肌內劑量是0.5ml。 劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初次免疫方案和/或加強免疫方案。可以在初次劑量方案之后實施加強劑量方案。可常規確定初免劑量之間(例如4-16周之間)以及初免和加強之間的適當間隔時間。采用3-或4-劑量初免方案測試基于OMV的RIVM疫苗，在第0、2和8或0、1、2和8月接種。以6周間隔給予3劑量的MeNZB 。可利用本發明組合物誘導針對多于一種的腦膜炎球菌超毒力譜系的殺菌抗體應答。具體地說，它們可優選誘導針對以下三種超毒力譜系中2或3種的殺菌應答(i)簇 A4;(ii)ET5復合體；和(iii)譜系3。它們還可誘導針對超毒力譜系亞群I、亞群III、亞群IV-I或ET-37復合體中一種或多種以及針對其它譜系，例如超侵襲性譜系的殺菌抗體應答。這并不一定表示該組合物可誘導針對這些超毒力譜系內各腦膜炎球菌菌株的殺菌抗體；而是，例如對于任何給定的由特定超毒力譜系中的4種或更多腦膜炎球菌菌株構成的組而言，該組合物誘導的抗體針對該組的至少50 % (例如60 %、70 %、80 %、90 %或更高) 具有殺菌活性。優選的菌株組包括從以下至少4個國家分離的菌株GB、AU、CA、N0、IT、US、 NZ、NL、BR和CU。所述血清優選具有至少1024的殺菌效價(例如21(1、2"、212、213、214、215、 216、217、218或更高，優選至少214)，例如，所述血清在稀釋為1/1024時能夠殺死特定菌株至少50%的測試菌。有用組合物可誘導針對以下血清群B腦膜炎球菌菌株的殺菌應答(i)來自簇
16A4,菌株 961-5945 (B:2b:Pl. 21，16)和 / 或菌株 G2136(B:_) ； (ii)來自 ET-5 復合體，菌株 MC58(B:15:P1. 7，16b)和 / 或菌株 44/76 (B: 15:P1. 7，16) ； (iii)來自譜系 3 的，菌株 394/98 (B:4:P1. 4)和/或菌株BZ198 (B:NT:_)。更優選組合物可誘導對菌株961-5945、 44/76和394/98的殺菌應答。菌株961-5945和G2136都是奈瑟菌MLST參照菌株[參考文獻108中是638和 1002]。菌株MC58可廣泛獲得(例如，ATCC BAA-335)，在參考文獻109中對此菌株進行了測序。菌株44/76已被廣泛應用和鑒定(例如，參考文獻110)，其是奈瑟菌MLST對照菌株之一[參考文獻108中是237 ；參考文獻15中表2第32行]。菌株394/98最初于1998年在新西蘭分離得到，采用該菌株已發表了幾篇研究(例如，參考文獻111和112)。菌株BZ198 是另一種MLST對照菌株[參考文獻108中是409 ；參考文獻15中表2第41行]。其它抗原性組分除了含有腦膜炎奈瑟球菌的抗原，組合物可包含其它病原體的抗原。例如，所述組合物可包含以下其它抗原中的一種或多種-肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的抗原，例如糖(通常是偶聯的)；-乙型肝炎病毒的抗原，例如表面抗原HBsAg；-百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)的抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3聯用；-白喉抗原，如白喉類毒素；-破傷風抗原，例如破傷風類毒素；-流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)B (Hib)的糖抗原，通常是偶聯的；-滅活的脊髓灰質炎病毒抗原。白喉抗原包含在組合物中時，其還優選包含破傷風抗原和百日咳抗原。類似地，包含破傷風抗原時，也優選包含白喉和百日咳抗原。類似地，當包含百日咳抗原時，也優選包含白喉和破傷風抗原。因此，優選DTP組合。如果包含Hib糖(通常是偶聯物)，該糖部分可以是多糖(例如，從細菌純化的全長磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但也可能通過，例如水解將純化的糖斷裂以制備寡糖(例如，分子量約1-約5kDa)。組合物中Hib偶聯物的濃度通常處于0.5 μ g-50 μ g， 例如1-20μβ、10-15μβ、12-16μβ等等。在一些實施方式中，該含量可以是約15g，或約 12. 5 μ g0低于5μ g的含量可能是合適的[113]，例如處于1-5μ g、2-4y g或約2. 5μ g。如上所述，在包含Hib糖和腦膜炎球菌糖的組合中，可根據后者的劑量(具體地說，對于具有多種腦膜炎球菌血清群的情況而言，為它們的平均質量)選擇前者的劑量。Hib偶聯物的其它特征如上文腦膜炎球菌偶聯物所述，包括載體蛋白(例如，CRM197或破傷風類毒素)、連接鍵、比例等的選擇。如果包含肺炎鏈球菌抗原，其可以是多肽或糖。偶聯莢膜糖尤其可用于對肺炎球菌進行免疫。糖可以是具有從細菌純化糖期間產生的大小的多糖，或者其可以是通過將這種多糖斷裂獲得的寡糖。例如，在7-價PREVNAR 產品中，糖中的6種呈現為完整的多糖， 而一種(18C血清型)呈現為寡糖。組合物可包含以下肺炎球菌血清型中一種或多種的莢膜糖:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。組合物可包含多種血清型，例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23或更多種血清型。本領域已知7-價、9-價、10-價、11-價和13-價偶聯物組合，以及23-價未偶聯組合。例如，10-價組合可包含血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、 19F和23F的糖。11-價組合還可包含血清型3的糖。可將12-價組合加入10-價混合物 血清型 6A 禾口 19A ；6A 禾口 22F ； 19A 禾口 22F ；6A 禾口 15B ； 19A 禾口 15B ；r22F 禾口 15B ；可將 13-價組合加入11-價混合物血清型19A禾口 22F ；8禾口 12F ；8禾口 15B ；8禾口 19A ；8禾口 22F ； 12F禾口 15B ； 12F禾口 19A ； 12F和22F ； 15B禾口 19A ； 15B禾口 22F，等等。肺炎球菌偶聯物的其它特征如上文腦膜炎球菌偶聯物所述，包括載體蛋白(例如，CRM197或破傷風類毒素)、連接鍵、比例等的選擇。如果組合物包含多于一種的偶聯物，各偶聯物可利用相同或不同的載體蛋白。參考文獻114描述了在多價肺炎球菌偶聯物疫苗中利用不同載體蛋白時的潛在優勢。概要除非另有說明，實施本發明可采用本領域已知的化學、生物化學、分子生物學、免疫學和藥學的常規方法。文獻中完整描述了此類技術。參見，例如參考文獻115-121，等等。術語“包含”涵蓋“包括”以及“由......構成”，例如“包含” X的組合物可以僅由
X構成，或可以包括其它物質，例如X+Y。關于數值χ的術語“約”是任選的，表示，例如χ士 10%。如果本發明涉及“表位”，該表位可以是B-細胞表位和/或T-細胞表位，但通常是B-細胞表位。可憑經驗鑒定此類表位(例如，采用PEPSCAN[122、123]或類似的方法)，或者可預測它們(例如，采用Jameson-Wolf抗原性指數[124]、基質方法[125]、 MAPIT0PE[126]、TEPIT0PE[127、128]、神經網絡[129]、OptiMer&EpiMer [130、131]、 ADEPT[132]、Tsites[133]、親水性[134]、抗原性指數[135]或參考文獻136-140公開的方法，等等)。表位是抗體的抗原結合位點或T-細胞受體識別并結合的抗原諸部分，它們還稱為“抗原決定簇”。如果本發明利用“純化的”抗原，該抗原從其天然產生的環境中分離。例如，除了存在任何其它純化抗原外，該抗原基本上不含其它腦膜炎球菌組分。一般通過分別純化各抗原，然后重新混合它們來制備純化抗原的混合物，即便兩種抗原天然混合在一起。述及兩條氨基酸序列之間的序列相同性百分比表示比對時，兩條序列比較中相同的氨基酸百分比。可利用本領域已知的軟件程序測定該比對和同源性或序列相同性百分比，例如參考文獻141的7. 7. 18章描述的那些。通過Smith-Waterman同源性檢索算法，利用仿射空位檢索(affine gap search)測定優選的比對，其中空位罰分12，空位延伸罰分 2，BLOSUM矩陣62。參考文獻142公開了 Smith-Waterman同源性檢索算法。詞語“基本上”不排除“完全”，例如“基本上”不含Y的組合物可以完全不含Y。需要時，“基本上”這個詞可以從本發明的定義中省略。附圖簡述

圖1顯示在有(正方形)或沒有(菱形)去鐵胺存在下，MC58(圖1A)或M1239(圖 1B)培養物的生長曲線(0D相對以分鐘表示的培養時間)。圖2顯示利用抗-HmbR血清的蛋白質印跡。四條泳道從左至右是MC58、去鐵胺_ ； MC58、去鐵胺+ ；M1239、去鐵胺_ ；M1239、去鐵胺+。箭頭顯示HmbR。圖3同圖2，但血清是抗_Tbp2血清。箭頭顯示Tbp2。
圖4顯示MC58的FACS分析。從左至右的三列是不同標記的抗體免疫前； 抗-HmbR-2 ；抗-Tbp2。兩行是沒有(上)或有(下)去鐵胺存在下的細菌生長情況。圖5 與圖4相同，除了菌株是M1239。圖6是顯示以下情況中HmbR表達的蛋白質印跡(1和8)野生型MC58; (2)內源性hmbR基因敲除的MC58 ;(3-7)含IPTG-誘導型啟動子控制的外源性hmbR基因的敲除菌株，IPTG為0、0. 001、0.01、0.1或1福；(9)用去鐵胺培養的野生型MC58 ；和(10)野生型NZ菌株。圖7是顯示GB013菌株中HmbR表達的蛋白質印跡wt =野生型GB013 ；k/o = GB013AhmbR ；c = GB013 Δ hmbR-chmbR。分析各菌株的 0. 5 或 1 μ g 蛋白。圖8是各種菌株的外膜材料的蛋白質印跡。泳道1-3含有不同稀釋度的重組 HmbR-2。泳道5是含有異源腦膜炎球菌hmbR基因的大腸桿菌BL21菌株。泳道12是補體致活的GB013菌株。其它泳道是對照。圖9是大腸桿菌BL21菌株自身誘導生長后所得組分的蛋白質印跡。泳道2_6是 AtolR菌株；泳道8-12是DE3*菌株。泳道4、6、9和10顯示HmbR的強條帶。圖10顯示大腸桿菌Δ tolR菌株中HmbR表達的FACS分析。表達HmbR的菌株的峰在右側。圖11是各種菌株的囊泡的蛋白質印跡。泳道1-3含有不同稀釋度的重組HmbR-2。 泳道5、7和9是表達HmbR的大腸桿菌Δ tolR菌株，稀釋度降低。泳道11和12是不含TolR 修飾的BL21菌株。本發明實施方式許多腦膜炎球菌分離物不包含hmbR基因。此外，在hmbR+菌株中，基因表達經歷相變異[143]，這是DNA水平可逆改變導致相開啟和關閉之間的基因表達改變。相變異是許多病原體中控制表面暴露毒力因子表達的共有機制。在一組III譜系菌株中，12種菌株中有10種檢測到hmbR基因。在所有10種菌株中，該基因是MC58菌株保守性的。hmbR基因克隆自菌株NZ05/33。包括前導肽在內的編碼序列是2373bp加上終止 (序列)(SEQ ID NO 18)，編碼791個氨基酸的多肽(SEQ ID N0:19)。制備該序列的幾種衍生物以供表達⑴具有SEQ ID NO 19的氨基酸24-170的‘HmbR-塞(plug)，(即，SEQ ID NO :20)，融合于C-末端聚組氨酸標簽；(ii)具有SEQ ID NO 19的氨基酸171-191的 ‘HmbR-下(down) ’ ( BP, SEQ ID NO :21)，融合于C-末端聚組氨酸標簽；(iii)具有SEQ ID NO: 19的氨基酸24-791的‘HmbR-2，(即，SEQ ID NO :22)，省去前導肽，融合于C-末端聚組氨酸標簽；和(iv)具有SEQ ID NO 19的氨基酸1-791的‘HmbR-3，，融合于C-末端聚組氨酸標簽。將編碼這些多肽的載體轉化入大腸桿菌BL21細胞以供表達。純化表達的多肽，用于免疫小鼠。HmbR-塞具有可溶性，分子量為16kDa。HmbR-下(68kDa)不可溶，但可利用8M 脲溶解以供免疫。HmbR-2 (85kDa)不可溶，但可利用2M脲溶解以供免疫。聯用這3種純化的多肽和完全弗氏佐劑(FCA)免疫小鼠，通過SBA測試免疫血清。還如此測試了 HmbR-塞和HmbR-下的混合物。HmbR多肽無一能在小鼠中誘導殺菌抗體(所有SBA滴度效價< 16)。此外，血清不能檢測同源菌株NZ05/33中HmbR的表面暴露(FACS試驗)。但是在蛋白質提取物中，血清能檢測hmbR+菌株(除了 M01-240149)中的蛋白質。盡管缺乏SBA活性，仍進行了進一步的實驗。用在25 μ M去鐵胺存在下培養的細菌檢驗抗-HmbR抗血清，從而限制細菌對鐵的利用。培養了兩種菌株hmbR+菌株(MC58)和 hmbR"菌株(Ml239)。有去鐵胺存在下菌株生長情況差很多(圖IA和1B)。采用蛋白質印跡和FACS分析評估表達。為作比較，Tbp2用作陽性對照，因為之前報道該蛋白質表達在低鐵條件下誘導。蛋白質印跡分析顯示在低鐵條件下MC58中的HmbR表達升高，但M1239在任何條件下均未觀察到(圖2)。相比之下，在低鐵條件下，兩種菌株均表達Tbp2(圖3)。FACS分析確認在低鐵條件下，MC58中免疫可接近HmbR表達升高(圖4)，但M1239中不是(圖5)。與以上報道的SBA結果相反，當用在低鐵條件下生長的菌株檢驗血清時，觀察到殺菌效價升高。用沒有(0D 0.25的細菌)或有(0D 0. 16的細菌)去鐵胺存在下培養的 MC58檢驗抗-HmbR血清，與陽性對照殺菌抗血清相比，效價如下所示
權利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含(i)腦膜炎球菌HmbR抗原和(ii)腦膜炎球菌外膜囊泡。
2.一種工程改造的腦膜炎球菌細菌，該細菌超表達腦膜炎球菌HmbR抗原。
3.—種工程改造的腦膜炎球菌細菌，該細菌包含hmbR基因，其表達不是相可變的。
4.一種工程改造的腦膜炎球菌細菌，該細菌組成型表達HmbR。
5.一種工程改造的腦膜炎球菌細菌，該細菌包含誘導型啟動子控制下的hmbR基因。
6.從如權利要求2、3、4或5所述的細菌制備的外膜囊泡，其特征在于，所述囊泡包含腦膜炎球菌HmbR抗原。
7.一種制備腦膜炎球菌膜囊泡的方法，包括使如權利要求2、3、4或5所述的腦膜炎球菌破裂以提供囊泡的步驟。
8.一種免疫原性組合物，其包含(i)腦膜炎球菌HmbR抗原和(ii)選自下組的一種或多種腦膜炎球菌抗原fHBP ；287 ；NadA ；NspA ；NhhA ；App ；0mp85 ；和 L0S。
9.一種免疫原性組合物，其包含(i)腦膜炎球菌HmbR抗原和(ii) 一種或多種血清群 A、C、W135或Y的偶聯的腦膜炎球菌莢膜糖。
10.一種雜交多肽，其包含下式所示氨基酸序列 NH2-A- [-X-L-] n-B-C00H其中X是包含腦膜炎球菌抗原序列的氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N-末端氨基酸序列，B是任選的C-末端氨基酸序列，η是大于1的整數，條件是至少一個X部分是HmbR抗原。
11.如權利要求6所述的雜交多肽，其特征在于，X部分選自下組fHBP；287 ；NadA ； NspA ；NhhA ；App 禾口 0mp85o
12.一種免疫原性組合物，其包含以下的混合物(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO 4的多肽；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO 5的多肽；(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO 6的多肽；和(iv) HmbR抗原。
13.如以上權利要求中任一項所述的組合物、細菌、囊泡、方法或多肽，其特征在于，所述HmbR包含與SEQ ID NO 7有至少80%序列相同性的和/或包含SEQ ID NO 7的表位的氨基酸序列。
全文摘要
腦膜炎球菌血紅蛋白受體，HmbR與一種或多種其它抗原聯合用作疫苗抗原，例如與腦膜炎球菌外膜囊泡，另一純化的腦膜炎球菌抗原(例如，fHBP、287、NadA、NspA、NhhA、App、Omp85、LOS)，偶聯的腦膜炎球菌莢膜糖等聯合。
文檔編號C12N1/20GK102300585SQ200980156020
公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者B·阿科, M·斯卡塞利, R·拉普奧利 申請人:諾華有限公司