使用環糊精改進核酸擴增反應的特異性、靈敏度和產率的制作方法

專利名稱：使用環糊精改進核酸擴增反應的特異性、靈敏度和產率的制作方法
使用環糊精改進核酸擴增反應的特異性、靈敏度和產率本發明涉及用于核酸擴增的試劑盒、組合物和方法。更具體而言，其涉及改進PCR 方法和PCR方法的變型的特異性、靈敏度和產率。聚合酶鏈式反應(PCR)是一種廣泛用于分子生物學、遺傳學、診斷、臨床實驗室、 法醫學、環境科學、遺傳性研究、親子鑒定以及多種其他應用的技術。PCR技術的目的是從不可檢出量的起始材料擴增靶核酸。PCR是一種強力且靈敏的DNA擴增技術。PCR通過使用多個循環的三步驟過程指數擴增特定的DNA序列。首先，在高溫下使雙鏈DNA模板變性。然后將序列特異性引物退火至相對兩條鏈上目標序列側翼的位點。熱穩定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶延伸所述退火的引物，由此將原始DNA序列的量加倍。然后這種新合成的產物成為后續擴增循環的額外模板。將這三個步驟重復20到35個循環，使DNA濃度產生IO5-IO9倍的增加。盡管對于核酸擴增而言PCR方法和PCR相關方法是巨大的成功，仍然需要改進所述反應的特異性、靈敏度和產率以及聚合酶的性能。一些模板或靶核酸是難以擴增的和/或產生非特異性副產物如引物二聚體或寡聚體以及其他包括結合的引物的雙鏈副產物。如果靶核酸以非常低的濃度存在，不合意的非特異性副產物的產生可能完全阻止對這種靶核酸的擴增。這在診斷試劑盒中可能是導致假陰性結果的棘手問題。擴增反應的特異性是由引物在不允許非特異性配對的優化溫度下特異性退火至核酸靶而提供的。然而，出于各種原因，在進行擴增之前將反應混合物保持在低于理想退火溫度的溫度下。當反應混合物保持在較低溫度時，引物可能不合期望地以非特異性方式結合至非靶核酸。這些副產物能夠同靶核酸一起擴增或者能夠完全阻止對靶核酸精確和大量的擴增。這導致背景的產生并減少特異性PCR產物的產率。物理阻斷劑如蠟屏障(wax barrier)或蠟珠可以用于以熱依賴性方式將反應組分分開。然而，主要的缺點是融化的屏障材料在PCR反應過程中殘留在反應混合物中。常用的改進擴增反應的方法是使用HotStart DNA聚合酶的HotStart PCR0這一技術允許在PCR反應準備過程中抑制或阻斷聚合酶活性。通過在PCR循環之前限制聚合酶活性，HotStart PCR減少非特異性擴增并增加PCR產物產率。HotStart PCR常常是通過使用對DNA聚合酶的可逆化學修飾或通過用特異性抗體抑制DNA聚合酶來進行的(EP O 592 035,EP O 771 870,EP O 962 526) 0在兩種情況下，對DNA聚合酶的抑制都是可逆的，并且通過初始加熱步驟來激活DNA聚合酶，所謂的“HotStart”在PCR循環之前進行。然而，這些技術需要使用特別制備的熱穩定性DNA聚合酶和加熱步驟。W02006/119419描述了在hot-start PCR中用于掩蔽試劑的物質，其中所述掩蔽劑是聚內酯基質。需要熱起始(hot-start)從所述聚內酯基質釋放PCR試劑。環糊精是環狀寡糖，其一直是受到強烈關注的對象，主要是因為它們能夠與稱作 “訪客(guest)”的其他分子形成所謂的“包含”復合物。環糊精通常包含能夠容納訪客分子的疏水部分的腔。盡管環糊精的外表面為親水性的，內腔卻高度疏水，使它們能夠與許多種較小的疏水分子形成包含復合物。所述腔取決于葡萄糖單位數而具有不同的直徑。通過與各種分子或分子的部分形成包含復合物，它們能夠改變所述訪客分子的理化性質。這能夠導致訪客分子(例如活性藥物分子)的溶解度增加，并增加它們的生物利用度。可以封裝可溶性差的藥物、迅速變質的味道、揮發性香味或有毒分子。環糊精在藥品工業中用作控制藥物配制劑中活性成分釋放的手段。另外，環糊精能夠使不穩定的分子穩定并保護它們免受光、溫度、氧化、還原和水解的降解或通過降低它們的揮發性而保護它們免遭降解。因此， 環糊精在包括藥理學、食品工業和美容學在內的廣泛領域中得到多種應用。由于環糊精與疏水分子的包含化合物能夠穿透身體組織，這可用于在特定條件下釋放生物活性化合物。已經顯示了環糊精或環糊精衍生物催化特定的化學反應。還發現了環糊精在分子生物學中的一些應用。W091/02040描述了用于標記配體的包含熒光團和環糊精的包含復合物。所述熒光團和環糊精的包含復合物將信號放大。將用這些包含復合物標記的引物用于核酸測序。W000/37674還描述了在測序反應中使用環糊精來擴增激基締合物或激基復合物標簽的熒光團。US 5，705, 345描述了使用環糊精制備核酸的方法和試劑盒。該文獻公開了使用環糊精用于中和DNA修飾或擴增反應中的提取劑。例如，環糊精有效中和SDS和苯酚。EP 0 762 898描述了用于治療用途的反義寡核苷酸與環糊精的包含體。 W095/32739描述了用于細胞遞送系統的與環糊精復合的寡核苷酸。在分子生物學中，已將環糊精用于擴增熒光標記以及用于治療性反義寡核苷酸的遞送。然而，現有技術從未描述或提出過在核酸擴增反應中使用環糊精。現在本發明令人驚訝地證明環糊精的使用改進了 DNA擴增反應如PCR反應和PCR 反應的變型的特異性、靈敏度和/或產率。另外，環糊精還改進等溫DNA擴增反應的特異性、靈敏度和/或產率。在第一個實施方案中，這種改進是通過用環糊精預處理擴增反應的組分之一來獲得的，所述組分如熱穩定性DNA聚合酶、dNTP或引物。引人注目的是，在另一實施方案中， 如果簡單地將環糊精加入到進行了核酸擴增的最終反應混合物中，也觀察到了擴增反應的改進。本發明的試劑盒、組合物和方法導致非特異性擴增產物包括引物二聚體的減少， 同時改進特異性靶核酸的產率。本發明的試劑盒、組合物和方法不需要熱激活步驟(HotStart)，但是通過根據本發明加入環糊精可進一步改進HotStart PCR技術。核酸擴增反應的整體效率、靈敏度和特異性得到改進。由于可以簡單地向反應混合物加入環糊精，本發明的試劑盒、組合物和方法使醫師能夠獲得很大的靈活性。如果用環糊精對組分之一進行預處理，則該預處理包括簡單的與環糊精一起溫育。序列表SEQ ID No. 1 引物 FWD NUMBSEQ ID No. 2 引物 REV NUMBSEQ ID No. 3 引物 HLA-CSEQ ID No. 4 引物 HLA-CSEQ ID No. 5 引物 FWD t-PAl
SEQ ID No. 6 引物 REV t-PAl

發明內容
本發明涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其中所述擴增反應在包含至少一種環糊精的最終反應混合物中進行。在第一種實施方案中，本發明涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、 靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的樣品與含有至少一種環糊精的擴增反應混合物接觸；b)對步驟a)中獲得的反應混合物進行擴增反應。在第二種實施方案中，本發明涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、 靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將環糊精與至少一種選自熱穩定性DNA聚合酶、反應緩沖液、dNTP和引物的組分接觸；b)將含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的樣品與含有至少一種來自步驟a) 的組分的擴增反應混合物接觸；c)對步驟b)中獲得的反應混合物進行擴增。在第三種實施方案中，本發明涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、 靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將所述樣品與環糊精接觸以獲得樣品和環糊精的混合物；b)將所述樣品和環糊精的混合物與擴增反應混合物接觸；c)對步驟b)中獲得的反應混合物進行擴增反應。在第四種實施方案中，本發明涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、 靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將所述樣品與擴增反應混合物接觸；b)加入至少一種環糊精；c)對步驟b)中獲得的反應混合物進行擴增反應。優選地，包含在所述反應混合物中的環糊精的濃度為0. l_50mM。優選地，所述反應混合物包含0. 01-0. 2單位/ μ 1的熱穩定性DNA聚合酶。優選地，所述反應混合物至少包含樣品、環糊精、熱穩定性DNA聚合酶、反應緩沖液、dNTP和至少一種引物。優選地，所述環糊精選自下組α -環糊精、β -環糊精、Y -環糊精和它們的衍生物。更優選地，所述環糊精選自下組單丙二胺-β -環糊精、6-0- α -D-麥芽糖基-β 環糊精、羥乙基-β -環糊精、羥丙基-β -環糊精和2-羥丙基-β -環糊精。本發明的另一目的是一種用于改進由DNA聚合酶催化的核酸體外合成的特異性和/或產率的方法，包括將單鏈核酸與DNA合成反應混合物接觸，所述DNA合成反應混合物包含DNA聚合酶、引物、dNTP和至少一種環糊精。優選地，所述用于改進由DNA聚合酶催化的核酸體外合成的特異性和/或產率的方法，包括使所述引物退火至所述單鏈核酸并在所述引物的3’端摻入互補的dNTP。優選地，包含在最終反應混合物中環糊精的濃度為0. 5-50mM,所述最終反應混合物包含單鏈核酸和所述DNA合成反應混合物。本發明還涉及用于擴增樣品中靶核酸的試劑盒，其在同一容器中包含至少一種環糊精和至少一種選自下組的組分熱穩定性DNA聚合酶、用于核酸擴增的反應緩沖液、dNTP 和寡核苷酸引物。在一些實施方案中，所述試劑盒在同一容器中或另外的容器中包含逆轉錄酶。發明詳述本發明涉及用于改進通過DNA聚合酶催化的核酸體外合成的特異性、靈敏度和/ 或產率的方法，其包括將單鏈核酸與DNA合成反應混合物接觸，所述DNA合成反應混合物包含DNA聚合酶、引物、dNTP和至少一種環糊精。測序，以及任何其他涉及引物退火繼以使用 DNA聚合酶的引物延伸的反應，當在至少一種環糊精存在下進行該反應時均得到改進。變性、退火和延長/延伸步驟可以重復期望的次數以擴增樣品中的靶核酸。因此， 在優選的實施方案中，本發明提供使用環糊精擴增核酸的方法。本發明還涉及包含環糊精的試劑盒和組合物。有利地，本發明提供用于核酸擴增的試劑盒和組合物。這些試劑盒和組合物通常意圖用于研究或用于體外診斷應用。術語“擴增”指增加樣品中靶核苷酸序列拷貝數的體外方法。擴增反應通常由允許連續變性、退火和引物延伸循環的多輪重復溫度循環組成。然而，等溫擴增方法也在本發明的范圍內。本發明提供用于進行PCR或PCR反應的變型如等溫擴增的方法、組合物和試劑盒。這些方法在文獻中描述并且是本領域技術人員熟知的。通常，PCR反應涉及一系列重復20-35次的熱循環，所述循環包括變性步驟、引物退火步驟和延伸/延長步驟。該反應常常以5-100μ 1的反應體積在小反應管中于熱循環儀中進行。變性步驟在大約94°C-95°C的溫度使核酸能夠完全變性。這一步驟產生單鏈DNA。 引物退火步驟通常在比引物-靶序列DNA雙鏈體的解鏈溫度低大約5°C的溫度下進行。在此步寡核苷酸引物特異性結合于單鏈靶序列。延伸步驟在約72°C進行，但這依賴于所用的 DNA聚合酶。例如Taq DNA聚合酶的最佳條件為72°C。在此步DNA聚合酶通過在5，到3， 方向上添加dNTP的引物延伸來合成與靶鏈互補的新DNA鏈。本發明涉及DNA或RNA靶核苷酸的擴增。對于RNA靶的擴增，使用逆轉錄酶來獲得DNA模板。本發明的方法、試劑盒和組合物可用于經典PCR、常規解決方案的DNA/RNA定量 (routine solution DNA/RNA quantification)、逆轉錄酶 PCR( —步和兩步)、Real-Time PCR(單標記探針，雙染料探針，Molecular Beacon探針，Scorpions探針，plexor引物，FRET 探針，Padlock探針；僅在與雙鏈DNA結合時發射熒光的dsDNA結合性熒光體(如STOrGreen 染料))、基于核酸序列的擴增(NASBA)、高分辨率DNA熔解曲線分析(HRM)、多重連接依賴性探針擴增(MLPA)、嗜熱解旋酶依賴性擴增(tHDA)的實時監測、引物延伸、cDNA末端的快速擴增(RACE)、巢式PCR、免疫聚合酶鏈式反應(免疫PCR)、牽涉滾環復制(RCA)的方法、芯片上的染色質免疫沉淀(芯片上的ChIP)、使用鄰位連接技術用于檢測蛋白質、生物分子相互作用和單拷貝病原體的應用以及基于固相的核酸測定法。本發明的試劑盒、組合物和方法適用于包括靶核酸的擴增和測序的測定法。本發明的試劑盒、組合物和方法特別用于診斷目的，用于基因分型和用于SNP研究。含有或疑似含有靶核苷酸序列的核酸可以標記或附接至固相支持物如珠或固體表面。也可以將寡核苷酸引物標記或附接于多種支持物包括珠。在本發明中，反應中環糊精的目的不是擴大標記或標志物的信號，舉例而言例如標記的熒光。通常，環糊精不包括任何標記或標志物。在本發明的方法或試劑盒中，將環糊精用于增加擴增反應或DNA合成反應的產率、靈敏度和/或特異性。本發明的試劑盒、組合物和方法提供用于靶核酸的擴增。在一個優選的實施方案中，本發明的試劑盒和組合物包含環糊精和至少另一種核酸擴增所需的試劑。本發明還涉及在用于核酸擴增的方法中使用環糊精以改進該反應的產率、特異性和/或靈敏度。環糊精是一個環式環狀寡糖家族。常見的環糊精由5個或更多個通過1- > 4糖苷鍵連接的α-D-吡喃葡糖苷單位構成。環糊精是技術人員熟知的并且可以例如通過酶轉化手段從淀粉產生。令人驚訝的是，環糊精的添加改進核酸擴增反應的特異性、靈敏度和產率。任何環糊精、修飾的環糊精或它們的任何混合物均可以在本發明的試劑盒、組合物和方法中使用。α -環糊精(六元糖環分子)、β -環糊精(七糖環分子)、Y -環糊精(八糖環分子)或它們的衍生物是優選的。α -環糊精、β -環糊精設Y -環糊精的通式在下文顯示。這些天然環糊精能夠充當支架，在其上可以裝配官能基和其它取代基。取代的環糊精或環糊精衍生物可以在本發明的方法、試劑盒和組合物中使用。可以通過用疏水模塊或用“效應基團”例如糖或肽對羥基進行的任意取代或官能化來修飾環糊精。修飾的環糊精的化學式如下所示，其中R 是有機基團。通式修飾的β -環糊精，其中R是有機基團任何環糊精或環糊精衍生物，只要對擴增反應或對核酸合成反應具有期望的效果，均可用于本發明的試劑盒、組合物或方法中。在α -環糊精中，優選的環糊精包括(2-羥丙基)-α -環糊精和3Α_氨基_3Α_脫氧-(2AS，3AS) - α -環糊精水合物。
在β-環糊精中，優選的環糊精包括單丙二胺-β-環糊精(6' -(3-氨基-丙胺基)-6 ‘-脫氧-環麥芽七糖)>6-0- α -D-麥芽糖基-β -環糊精、2，6- 二 _0_甲基-β -環糊精、羥乙基-β-環糊精、(2-羥丙基)-β-環糊精(β環糊精2-羥丙基醚)、3Α_氨基-3Α-脫氧-(2AS，3AS) - β -環糊精水合物和羥丙基-β -環糊精。在優選的實施方案中，使用2-羥丙基-β -環糊精，甚至更優選使用取代程度為每個葡萄糖單元0. 5至0. 7個羥丙基基團的2-羥丙基-β -環糊精。最優選使用取代程度為每個葡萄糖單元0. 67個羥丙基基團的2-羥丙基-β -環糊精。 在γ -環糊精中，優選的環糊精包括(2-羥丙基)-γ -環糊精和3Α-氨基-3Α-脫氧-(2AS，3AS)-γ-環糊精水合物。用于核酸擴增的試劑或組分，包括寡核苷酸引物、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、熱穩定性DNA聚合酶和合適的反應緩沖液，在文獻中描述并且為本領域普通技術人員所知。可以在本發明的試劑盒、組合物或方法中使用任何DNA聚合酶。優選熱穩定性DNA 聚合酶。優選的、可以用于本發明的方法的熱穩定性DNA聚合酶包括獲得自各種棲熱菌屬 (Thermus)細菌菌種或來自其他微生物來源的聚合酶。優選的熱穩定性DNA聚合酶是從水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)、黃棲熱菌(Thermus flavus)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、沃氏火球菌(Pyrococcus woseii)禾口附岸熱球菌(Thermococcus litoralis)獲得的那些。這些聚合酶優選產生并純化自含有編碼所述DNA聚合酶的基因的重組大腸桿菌。本發明的試劑盒、組合物和方法也可以使用上至少兩種熱穩定性DNA聚合酶或熱穩定性DNA聚合酶與其他酶的組合，所述其他酶如尿嘧啶-N-糖基化酶、DNA酶或核酸外切酶如3’ -5’校正讀碼核酸外切酶。這些酶或酶組合對于長的核酸分子的擴增特別有用。另外，本發明的試劑盒、組合物和方法可以使用所謂的HotStart DNA聚合酶，所述 HotStart DNA聚合酶已經通過例如化學處理或通過特異性單克隆抗體而可逆地失活。這些 DNA聚合酶需要在90°C -95°C進行5_10分鐘的初始熱激活步驟。一些試劑或組分可以作為濃縮儲液提供，在制備擴增反應混合物用于進行反應時將所述濃縮儲液稀釋。組分也可以以干固體的形式提供，意圖將其重懸于水中或適當的緩沖液中以制備儲液。術語“反應緩沖液”指在其中進行酶促核酸擴增的緩沖性溶液。所述反應緩沖液可以作為濃縮儲液提供，通常為^、切或IOx濃度。在本發明中，所述反應緩沖液可以含有在用于核酸擴增的緩沖液中使用的任何已知化學品。例如，所述溶液可以含有Tris以供進行緩沖。反應緩沖液通常還含有一價陽離子(KCl)、二價陽離子(MgCl2、MgS04)和非離子洗滌劑(TritonX-100、Tween 20、NP40)。所述緩沖液也可以含有提高PCR產率的試劑，比如舉例而言(NH4)2SO4、海藻糖、DMS0、BSA、甘油、MgCl2、EDTA、甜菜堿等。所述反應緩沖液也可以含有任何熱穩定性DNA聚合酶所需的輔助因子。這些試劑可以在同一容器中提供或在分開的容器中提供。例如，標準IOX PCR 緩沖液可以包含150-750mM Tris-HCl pH 8-8.8、 50-200nM(NH4) 2S04、100-500mM KCl、0_20mM MgCl2、0. 1% Tween-20 和 0.01% 明膠。
術語“儲存緩沖液”指將酶如熱穩定性DNA聚合酶儲存于其中的緩沖性溶液。這種緩沖性溶液可以使酶能夠在-20°C或在4°C儲存數周或數月。通常，所述儲存緩沖液含有甘油以供在-20°C儲存酶。例如標準Ix儲存(緩沖液)可以包含Tris 20mM、EDTA 0. ImM, KCllOOmM, DTT 1-lOmM、Nonidet P40 0. 50 Tween-20 0. 10-0. 50 %、甘油 0-50 %、磷酸鉀 (k-phospate) IOmM, Triton X-100 0. 10%, PMSF 0. 5mM 和 Ig印alCA-630 0.50%。dNTP包括dATP、dCTP、dTTP和dGTP。本發明的試劑盒、組合物和方法也可以使用經修飾的或經標記的dNTP或核苷。dNTP可以作為預混合的dATP、dCTP、dTTP和dGTP的平衡儲液提供。例如預混合的dNTP是2’ -脫氧-腺苷-5’ -三磷酸、2’ -脫氧-胞苷_5’ -三磷酸、2’ -脫氧-鳥苷-5’ -三磷酸、2’ -脫氧-胸苷-5’ -三磷酸各5mM的水溶液。本發明的試劑盒、組合物和方法也可以使用dUTP。例如預混合的dNTP/dUTP溶液含有 dATP、dCTP、dGTP 各 5mM 和 IOmM 2，-脫氧-鳥苷 _5，-三磷酸(dUTP)。術語“引物”指具有或含有與靶核酸互補的序列的寡核苷酸或其衍生物。所述引物與變性的靶核酸通過堿基配對雜交以起始由DNA聚合酶催化的延伸反應。本發明的試劑盒、組合物和方法優選使用至少兩種寡核苷酸引物，所述引物在靶核酸側翼并與核酸的相對鏈雜交。本發明的試劑盒、組合物和方法也可以使用標記的或修飾的寡核苷酸。術語“擴增反應混合物”指包含進行反應所需的組分中的一些或全部但不含樣品的溶液。這種擴增反應混合物通常稱作“MasterMix”。MasterMix由進行反應所需的組分中的一些或全部組成，但不含樣品。MasterMix通常包含反應緩沖液、dATP、dCTP、dTTP和 dGTP的平衡混合物、熱穩定性DNA聚合酶和引物。術語“反應混合物”或“最終反應混合物”指包含包括樣品在內的進行反應所需的全部組分的溶液。所述反應混合物通常通過將確定體積的擴增反應混合物與確定體積的樣品混合來制備。所述最終反應混合物包含含有或疑似含有靶核酸的樣品和擴增反應混合物二者。所述最終反應混合物通常含有5-100 μ 1的體積。PCR反應或更概括而言擴增反應也可以在dsDNA結合性熒光體存在下進行，所述 dsDNA結合性熒光體僅在與雙鏈DNA結合時發出熒光(如STOrGreen染料)。這對于實時 PCR應用或定量PCR特別有用。術語“樣品”指含有或疑似含有靶核酸的任何固體或液體材料。所述樣品可以是純化的核酸、生物樣品如組織樣品、生物流體樣品或細胞樣品。所述樣品可以例如是血液、 尿液、血清或唾液。所述樣品可以含有人、植物、動物、細菌或病毒來源的固體或液體材料。用于核酸擴增的反應組分通常商品化為包含至少一種或多種進行靶核酸擴增所必需的試劑/組分的試劑盒。本發明的第一個目的是一種改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/ 或特異性的方法，其中所述擴增反應在包含至少一種環糊精的反應混合物中進行。本發明涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括將含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的樣品與含有環糊精的擴增反應混合物接觸的步驟。可以將所述環糊精和其他核酸擴增所需的試劑/組分分別加入樣品以構成在其中進行擴增的最終反應混合物。或者，可以將環糊精與用于核酸擴增的其他組分預混合，然后再將其與樣品接觸以進行擴增反應。或者，可以在加入其他用于核酸擴增的組分之前將樣品與環糊精接觸。在另一實施方案中，將環糊精用于預處理核酸擴增組分。可以用環糊精預處理熱穩定性DNA聚合酶、寡核苷酸引物或dNTP。將經預處理的組分用于制備含有環糊精的擴增反應混合物或用于直接制備含有環糊精的最終反應混合物。本發明涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的樣品與含有至少一種環糊精擴增反應混合物接觸；b)對步驟a)中獲得的最終反應混合物進行擴增反應。本發明還涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將環糊精與至少一種選自熱穩定性DNA聚合酶、反應緩沖液、dNTP和引物的組分接觸；b)將含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的樣品與含有至少一種來自步驟a) 的組分的擴增反應混合物接觸；c)對步驟b)中獲得的最終反應混合物進行擴增反應。本發明還涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將所述樣品與環糊精接觸以獲得樣品和環糊精的混合物；b)將所述樣品和環糊精的混合物與擴增反應混合物接觸；c)對步驟b)中獲得的最終反應混合物進行擴增反應。本發明還涉及用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將所述樣品與擴增反應混合物接觸；b)加入至少一種環糊精；c)對步驟b)中獲得的反應混合物進行擴增反應。在根據本發明的方法中，由樣品和擴增反應混合物組成的所述反應混合物中環糊精的濃度優選包括0. 1至50mM，更優選0. 5至50mM。優選在0. 1,0. 5、l、2、4、5mM至10、15、 20、25、30、40和50mM。環糊精的適當濃度可以依賴于根據本發明的方法中使用的環糊精。 如本申請所述的方法可以用于評價使擴增方法的靈敏度、特異性和/或產率得到改進的環糊精的最佳濃度。在優選的實施方案中，環糊精選自下組α-環糊精、β-環糊精、Y-環糊精和它們的衍生物。還更優選地，環糊精選自下組單丙二胺-β -環糊精、6-0- α -D-麥芽糖基-β 環糊精、羥乙基-β -環糊精、羥丙基-β -環糊精和2-羥丙基-β -環糊精。熱穩定性DNA聚合酶的濃度是可能決定核酸擴增方法的靈敏度、特異性和產率的另一因素。在一個優選的實施方案中，包含樣品和擴增反應混合物的所述最終反應混合物包含 0.01、0. 02,0.03,0. 04 單位 / μ 1 至 0. 05,0. 075,0. 1 和 0. 2 單位 / μ 1 的熱穩定性 DNA 聚合酶。將一個單位定義為在72°C在30分鐘內向酸性不溶材料摻入IOnmol dNTP所需的酶量。根據本發明的方法可以進一步包括加熱步驟以將核酸變性和/或激活“Hot Start'DNA聚合酶。如果所述熱穩定性DNA聚合酶通過化學修飾或通過單克隆抗體進行了可逆失活，則需要這一額外步驟。有利地，本發明的方法不需要在95°C的加熱步驟/激活步驟。在根據本發明的方法中，所述擴增反應混合物可以包含經環糊精預處理的熱穩定性DNA聚合酶。在本發明的方法中，所述擴增反應混合物可以包含經環糊精預處理的dNTP。在本發明的方法中，所述擴增反應混合物可以包含經環糊精預處理的至少一種引物。用環糊精預處理擴增反應混合物的試劑/組分通過將所述組分與足夠濃度的環糊精溫育來進行。這種溫育可以在室溫或優選在4°C進行。溫育一小時通常足以獲得環糊精對所述試劑的充分預處理。或者，可以使用環糊精來制備要加入樣品的擴增反應混合物或制備最終反應混合物以供進行反應。在一個優選的實施方案中，所述擴增反應混合物包含環糊精、熱穩定性DAN聚合酶、反應緩沖液、dNTP和寡核苷酸引物。用于靶核酸擴增的方法在文獻中描述并且為本領域技術人員所知。PCR是用于核酸擴增的標準技術但PCR方法的變型也可用于根據本發明的方法。本發明的方法可以進一步包括在94-95°C進行的初始變性步驟以供核酸的初始和完全變性。加熱步驟通常要1、2、3或5-10分鐘。這種初始步驟也可以充當用于HotStart DNA聚合酶的加熱激活步驟。本發明的試劑盒、組合物和方法改進核酸擴增反應的特異性、靈敏度和/或產率。 其他已知的方法可以與本發明組合使用以進一步改進反應。一些試劑如DMSO、BSA、甘油、 海藻糖、甜菜堿據報道可改進反應。進一步的改進可以通過使用所謂的HotStart DNA聚合酶來獲得。本發明還涉及含有環糊精和至少一種用于核酸擴增的試劑的組合物。本發明的組合物可以是一旦加入樣品便可即刻用于進行反應的擴增反應混合物。或者，如果根據本發明的組合物包含酶，其可以是濃縮儲液或濃縮儲存溶液的形式。本發明提供用于通過DNA聚合酶催化的體外DNA合成的包含環糊精和至少一種選自下組的組分的組合物DNA聚合酶、用于體外DNA合成的反應緩沖液、dNTP和引物。本發明還涵蓋用于樣品中靶核酸擴增的組合物，其包含環糊精和至少一種選自下組的組分熱穩定性DNA聚合酶、用于核酸擴增的反應緩沖液、dNTP和寡核苷酸引物。在一個優選的實施方案中，根據本發明的組合物包含環糊精和熱穩定性DNA聚合酶。優選地，根據本發明的組合物包含環糊精、熱穩定性DNA聚合酶和儲存緩沖液。所述儲存緩沖液適用于在4°C或-20°C儲存熱穩定性DNA聚合酶。概括而言，為了改進核酸擴增的產率、靈敏度和/或特異性，優選以充分的濃度提供環糊精。本發明還涉及包含環糊精和至少一種dNTP的組合物。優選地，所述組合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP的平衡混合物。例如所述組合物是包含dNTP的平衡預混物和環糊精的濃縮儲液。或者，所述組合物可以包含dATP、dCTP、dGTP、dUTP和環糊精。另外，本發明涉及包含環糊精和用于核酸擴增的反應緩沖液的組合物。在另一實施方案中，所述組合物包含環糊精和至少一種引物。優選地，所述組合物包含環糊精和在靶核酸的5’和3’端與相對鏈雜交的至少兩種引物。在一個優選的實施方案中，所述組合物包含環糊精、熱穩定性DNA聚合酶、dNTP和用于核酸擴增的反應緩沖液。所述組合物可以進一步包含含有靶核酸或疑似含有靶核酸的樣品。在所述組合物中，更具體而言在由樣品和擴增反應混合物組成的所述最終反應混合物中，環糊精的濃度優選包括0. 1至50mM，更優選0. 5至50mM。優選在0. 1、0. 5、1、2、4、 5mM 至 10、15、20、25、30、40 和 50mM。在所述組合物中，更具體而言在由樣品和擴增反應混合物組成的所述最終反應混合物中，熱穩定性DNA聚合酶的量優選包括0. 01,0. 02,0. 03,0. 04單位/ μ 1至0. 05、 0. 075,0. 1 和 0. 2 單位 / μ 1。在另一實施方案中，所述組合物是用于擴增樣品中靶核酸序列的試劑盒的一部分。本發明的另一個目的是試劑盒，其在相同或分開的容器中包含環糊精和至少一種選自下組的組分DNA聚合酶、用于體外DNA合成的反應緩沖液、dNTP和引物。優選地，所述試劑盒用于核酸擴增。在一個優選的實施方案中，本發明涉及試劑盒，其在相同或分開的容器中包含環糊精和至少一種選自下組的組分熱穩定性DNA聚合酶、用于核酸擴增的反應緩沖液、dNTP 和寡核苷酸引物。在另一優選的實施方案中，本發明涉及用于樣品中靶核酸擴增的試劑盒，其在同一容器中包含至少一種環糊精和至少一種選自下組的組分熱穩定性DNA聚合酶、用于核酸擴增的反應緩沖液、dNTP和寡核苷酸引物。在本發明的試劑盒中，將不同的試劑在分開的容器中提供或作為包含幾種組分的預混物提供。所述組分可以作為濃縮儲液提供，所述濃縮儲液在核酸擴增之前必需經混合和稀釋。所述組分還可以以意圖在水中或在合適的緩沖液中重懸的脫水的、凍干的或任何其他干固體形式提供。所述試劑盒可進一步包含用于DNA聚合酶的任何輔助因子。所述試劑盒還可包含dsDNA結合性熒光體，其僅當與雙鏈DNA結合時發出熒光 (如 SYBRGreen)。在第一實施方案中，根據本發明的試劑盒在同一容器中包含環糊精和熱穩定性 DNA聚合酶。優選地，根據本發明的試劑盒在同一容器中包含環糊精、熱穩定性DNA聚合酶和儲存緩沖液。所述儲存緩沖液特別意圖用于且適于熱穩定性DNA聚合酶的儲存。保持在含有環糊精的儲存緩沖液中的熱穩定性DNA聚合酶通常在進行核酸擴增之前進行稀釋。在第二實施方案中，根據本發明的試劑盒在同一容器中包含環糊精和至少一種dNTP。優選地，所述容器包含環糊精以及dATP、dCTP、dGTP和dTTP的平衡濃縮預混物。在核酸擴增前稀釋這種含有環糊精的dNTP預混物。或者，所述容器包含環糊精以及dATP、 dCTP、dGTP和dUTP的混合物。在另一實施方案中，根據本發明的試劑盒在同一容器中包含環糊精和用于核酸擴增的反應緩沖液。優選地，所述容器含有濃縮的反應緩沖液和環糊精。將這種儲液稀釋以制備擴增反應混合物和在其中進行核酸擴增的最終反應混合物。在另一實施方案中，根據本發明的試劑盒在同一容器中包含環糊精和至少一種引物。優選地，所述容器可以包含環糊精和在待擴增的靶核酸序列的5’和3’端與相對鏈雜交的至少兩種或更多種引物。在另一實施方案中，根據本發明的試劑盒在同一容器中包含環糊精、僅當與雙鏈 DNA結合時發出熒光的dsDNA結合性熒光體。在另一實施方案中，所述試劑盒在同一容器中包含與靶核酸雜交的標記的探針和環糊精。本發明的試劑盒提供用于DNA和RNA 二者的擴增。因此，本發明的試劑盒還可包含逆轉錄酶。將所述逆轉錄酶或RNA依賴性DNA聚合酶用于從RNA模板合成cDNA ；之后擴增所得的cDNA。優選的逆轉錄酶包括Mu-MLV逆轉錄酶和AMV逆轉錄酶。在一些實施方案中，本發明的試劑盒提供用于等溫擴增。所述試劑盒因此可包含解旋酶。在本發明的試劑盒中，所述環糊精可以作為濃縮儲液在單獨的容器中提供或作為與其他組分或試劑的混合物提供。在一個優選的實施方案中，最終反應混合物中環糊精的終濃度優選包括0. 1至50mM，更優選0. 5至50mM，并且還更優選0. 1,0. 5、l、2、4、5mM至10、 15、20、25、30、40 和 50mM。根據本發明的試劑盒可以含有溶液或干固體形式的環糊精，所述干固體形式用于在水中或合適的緩沖液中重懸。環糊精可以作為與其他組分的預混物或濃縮儲液提供。所述試劑盒也可包含用于制備具有合適濃度環糊精的擴增反應混合物的說明。環糊精可以直接添加至用于制備擴增反應混合物的其他試劑。或者，可以使用環糊精預處理反應組分之一，例如熱穩定性DNA聚合酶、dNTP或寡核苷酸引物。在另一實施方案中，可以將環糊精添加至含有或疑似含有所述靶核酸的樣品。優選地，在擴增反應混合物中使用提供良好特異性、產率和靈敏度的適量的熱穩定性DNA聚合酶。優選地，最終反應混合物中熱穩定性DNA聚合酶的量包括0. 01,0. 02、 0. 03,0. 04 單位 / μ 1 至 0. 05,0. 075,0. 1 和 0. 2 單位 / μ 1。本發明的試劑盒上通常可以不包含核酸擴增所需的全部組分。一些組分如弓I物和樣品可以由試劑盒的最終用戶提供。本發明的試劑盒也可包含內部陽性對照(IPC)。所述內部陽性對照包含引物和/ 或特異性探針和對照DNA模板。這種IPC也可以含有環糊精。本發明還涉及試劑盒的用途，所述試劑盒包含環糊精和在同一容器或在別的容器中的至少一種用于核酸擴增的試劑。


圖1 測試Taa聚合酶+SAl (環糊精)1 =IOng gDNA, Taq R-POL-PO1 lx+SAl 4mM ；2 :0ng gDNA，TaqR-POL-POl lx+SAl 4mM ；3 :10ng gDNA, Taq R-P0L-P01 稀釋 10x+SA14mM ;4 :0ng gDNA, Taq R-POL-POl 稀釋 ΙΟχ+SAl 4mM ；5 :10ng gDNA，Taq R-P0L-P01 lx+dH20 ；6 :0ng gDNA，Taq R-P0L-P01 lx+dH20 ；7 1 OnggDNA, Taq R-P0L-P01 稀釋 10x+dH20 ；8 :0ng gDNA, Taq R-P0L-P01 稀釋 10x+dH20 ；9 :10ng gDNA, GoldStar+SA14mM ；10 :0ng gDNA, GoldStar+SAl 4mM ；11 :10ng gDNA, GoldStar+dH20 ； 12 :0ng gDNA, GoldStar+dH20 ；L :用于小片段的 Smart Ladder。Ml :用HLA-C引物測試Taq+SAl (環糊精)L Smart Ladder ；1 :2ng gDNA, TAQ,無 SAl ；2 :NTC，TAQ,無 SAl ；3 :2ng gDNA, TAQ+SA1 4mM 終濃度；4 :NTC，TAQ+SA1 4mM 終濃度；Ml I gnatov 等中通過 PCR 擴增的 HLA-CMi 使用含SAl (環糊精)和SAR(環糊精)的Taq聚合酶制備物的測試L. Smart Ladder1. Taq R-Pol-POl 與 IOng gDNA ；2. Taq R-Pol-POl 與 Ing gDNA ；3. NTC 與 Taq R-Pol-POl ；4.在 9mM SAl 存在下的 Taq R-Pol-POl 與 IOng gDNA ；5.在 9mM SAl 存在下的 iTaq R-Pol-POl 與 Ing gDNA ；6.在 9mM SAl 存在下的 NTC 與 iTaq R-Pol-POl ；7.在 9mM SAR 存在下的 Taq R-Pol-POl 與 IOng gDNA ；8.在 9mM SAR 存在下的 Taq R-Pol-POl 與 Ing gDNA ；9.在 9mM SAR 存在下的 NTC 與 iTaq R-Pol-POl ；10. HotGoldStar 與 IOng gDNA ； 11. HotGoldStar 與 Ing gDNA ；12. NTC 與 HotGoldStar1. Taq R-Pol-POl 與 IOng gDNA ；2. Taq R-Pol-POl 與 Ing gDNA ；3. NTC 與 Taq R-Pol-POl ；4.在 9mM SAl 存在下的 Taq R-Pol-POl 與 IOng gDNA ；5.在 9mM SAl 存在下的 iTaq R-Pol-POl 與 Ing gDNA ；6.在 9mM SAl 存在下的 NTC 與 iTaq R-Pol-POl ；7.在 9mM SAR 存在下的 iTaq R-Pol-POl 與 IOng gDNA ；8.在 9mM SAR 存在下的 iTaq R-Pol-POl 與 Ing gDNA ；9.在 9mM SAR 存在下的 NTC 與 iTaq R-Pol-POl ； IOHotGoldStar 與 IOng gDNA ； 11. HotGoldStar 與 Ing gDNA ；12. NTC 與 HotGoIdStar。M5 在使用不同Taq聚合酶的PCR中測試SARL. Smart Ladder SF1-7. Taq Pol R-Pol-POl 與 IOng gDNA，無 SaR2-8. Taq Pol R-PoI-POl 與 Ing gDNA，無 SaR3-9. NTC 與 iTaq Pol R-Pol-POl，無 S aR4-10. Taq Pol R-PoI-POl 與 IOng gDNA，在 9mM SaR 存在下5-11. Taq Pol R-Pol-POl 與 Ing gDNA，在 9mM SaR 存在下6-12. NTC 與 iTaq Pol R-Pol-POl，在 9mM SaR 存在下13-19. EGT GoldStar 與 IOng gDNA，無 SaR14-20. EGT GoldStar 與 Ing gDNA，無 SaR15-21. NTC 與 EGT GoldStar, ^ SaR16-22. EGT GoldStar 與 IOng gDNA，在 9mM SaR 存在下17-23. EGT GoldStar 與 Ing gDNA，在 9mM SaR 存在下18-24. NTC 與 EGT GoldStar，在 9mM SaR 存在下
15圖6 在使用不同Taq聚合酶的PCR中測試SAR L.Smart Ladder SF
1-7.EGT HotGoldStar 與 IOng gDNA，無 SaR
2-8.EGT HotGoldStar 與 Ing gDNA，無 SaR
3-9.NTC 與 EGT HotGoldStar,無 SaR
4-10.EGT HotGoldStar 與 IOng gDNA，在 9mM SaR 存在下
5-11.EGT HotGoldStar 與 Ing gDNA，在 9mM SaR 存在下
6-12.NTC 與 EGT HotGoldStar,在 9mM SaR 存在下
13-19.Roche FastStart 與 IOng gDNA，無 SaR
14-20.Roche FastStart 與 Ing gDNA，無 MR
15-21.NTC 與 Roche FastStart, ^ SaR
16-22.Roche FastStart 與 IOng gDNA，在 9mM SaR 存在下
17-23.Roche FastStart 與 Ing gDNA，在 9mM SaR 存在下
18-24.NTC 與 Roche FastStart，在 9mM SaR 存在下圖7 測試dNTP+SAM緩沖液+SAl
A(未修飾的 Taq R-P0L-P07-GoIdStar Cycling)
1.人gDNA IOng-Numb
2.人gDNA Ing-Numb
3.NTC-Numb
B.(未修飾的Taq R-P0L-P07-HotGoIdStar Cycling)
4.人gDNA IOng-Numb
5.人gDNA Ing-Numb
6.NTC-Numb
C.(dNTP+SAl IOmM 于最終反應中-GoldStar Cycling)
1.人gDNA IOng-Numb
2.人gDNA Ing-Numb
3.NTC-Numb
D.(dNTP+SAl IOmM 于最終反應中-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA IOng-Numb
5.人gDNA Ing-Numb
6.NTC-Numb
E.(緩沖液反應物+SAl
1.人gDNA IOng-Numb
2.人gDNA Ing-Numb
3.NTC-Numb
F.(緩沖液反應物+SAl
4.人gDNA IOng-Numb
5.人gDNA Ing-Numb
6.NTC-Numb
IOmM 最終-GoldStar Cycling)
IOmM 最終-HotGoldStar Cycling)
G.
1.
2.
3.
H.
4.
5.
6.
S
A丨
1.
2.
3.
B.
4.
5.
6.
C.
1.
2.
3.
D.
4.
5.
6.
Ε.
1.
2.
3.
F.
4.
5.
6.
G.
1.
2.
3.
H.
4.
人 gDNA IOng-Numb
6. NTC-Numb
圖8 測試dNTP+SAM緩沖液+SAl A(未修飾的 Taq R-P0L-P07-GoIdStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(未修飾的 R-P0L-P07-HotGoIdStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(dNTP+SAl IOmM 于最終反應中-GoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(dNTP+SAl IOmM 于最終反應中-HotGoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(緩沖液反應物 +SAl IOmM 最終-GoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(緩沖液反應物 +SAl IOmM 最終-HotGoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(HotGoldStar-GoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(HotGo1dStar-HotGoIdStar Cycling) 人 gDNA lOng-tPAl
5.人 gDNA lng-tPAl6. NTC-tPAl圖9 無初始加熱步驟的PCR 使用Taq P08，Taq P08+6mM環糊精和Hot GoldStar 的擴增
實施例實施例1 基因、引物和特異件PCR產物1. NUMB引物序列Numb弓I物 FWD:gag gtt cct aca ggc acc tgc cca g弓丨物 REV:caa aat cac ccc tea cag tac tct g這些引物的所述三個堿基能夠雜交在一起并在低溫下得到引物二聚體。NCBI 參考所述靶在NCBI數據庫中標識為NT_(^6437. 11 (序列位置54742877至 54743182)。擴增子長度306bp2. HLA-CHLA-C 禾口 PCR 片段記載于 “K. B. Ignatov, A. I. Miroshnikov, V. M. Kramarov, Russian Journal of Bioorganic Chemistty, 2003, vol. 29 (4),368-371.”引物序列HLA-C弓 I物 3 :gca agg att aca tcg ccc tga acg ag弓丨物 4:cat cat age ggt gac cac age tcc aa難以擴增的模板和非常長的PCR產物NCBI 參考所述靶在NCBI數據庫中標識為ΝΤ_07592· 14。擴增子長度1230bp3. t-PAl引物序列t-PAl弓丨物 FWD:aga cag tac age cag cct ca弓 I物 REVl :gac ttc aaa ttt ctg ctc ctc在PCR過程中，在一些條件下，這些引物能夠產生引物二聚體的形成。NCBI 參考所述靶在NCBI數據庫中標識為NT_007995. 14。擴增子長度:374bp實施例2 測試Taa聚合酶+SAl (環糊精)gDNA 人基因組 DNA，Roche引物Numb ；擴增子=3(^bpGoldStar+ 來自 Eurogentec 的試劑盒 Ref :ME-0064-05 (5U/ μ 1)
Taq 聚合酶R-P0L_P01 (自制 Taq)2X儲存緩沖液-Tris 40mM ；pH 8-EDTA 0. 2mM-KCl 0. 2M-DTT 2mM-Nonidet P40 1% (ν/ν)-Tween-20 1%環糊精SAlC45H78N2CXM+2HC1 :單丙二胺-β-環糊精*或6' _(3_氨基-丙基氨基)_6'-脫氧-環麥芽七糖(Chlorohydrated形式)。1. DNA 制備物gDNA 制備物
樣品儲液濃度[ng/μ 1]稀釋成具有IOng/μ 1的工作濃度人 gDNA2001 μ 1 gDNA 儲液 +19 μ 1 H2O PCR 級對于測試，加入1 μ 1/25 μ 1的反應對于NTC (陰性對照)，加入1 μ 1的H2O PCR級/25 μ 1的反應2.聚合酶制備物· Taq R-POL-POl+SAla.不稀釋的Taq30 μ 1 Taq+30 μ 1 SAl 200mM在4 °C振蕩并溫育1小時b. IOx 稀釋的 Taq3 μ 1 Taq+27 μ 1 儲存緩沖液 2Χ+30 μ 1 SAl 200mM在4 °C振蕩并溫育1小時·單獨的 iTaq R-P0L-P01c.不稀釋的Taq5 μ 1 Taq+5 μ 1 H2Od. IOx 稀釋的 Taq1 μ 1 Taq+9 μ 1 儲存緩沖液 2Χ+10 μ 1 H2O· GoldStar(5U/μ 1)+SAlL 25 μ 1 GoldStar+3. 75 μ 1 儲存緩沖液 2Χ+5 μ 1 SAl 200mM在4 °C振蕩并溫育1小時0. 625U/ μ 1·單獨的 GoldStar (5U/ μ 1)L 25 μ 1 GoldStar+3. 75 μ 1 儲存緩沖液 2Χ+5 μ 1 H2O0. 625U/ μ 1
對于測試和NTC，力口入1 μ 1的酶/25 μ 1反應3. Mastermix 制備物
權利要求
1.一種用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其特征在于所述擴增反應在包含至少一種環糊精的反應混合物中進行。
2.根據權利要求1的用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的樣品與含有至少一種環糊精的擴增反應混合物接觸；b)對步驟a)中獲得的反應混合物進行擴增反應。
3.根據權利要求1的用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將環糊精與至少一種選自熱穩定性DNA聚合酶、反應緩沖液、dNTP和引物的組分接觸；b)將含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的樣品與含有至少一種來自步驟a)的組分的擴增反應混合物接觸；c)對步驟b)中獲得的反應混合物進行擴增反應。
4.根據權利要求1的用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將所述樣品與環糊精接觸以獲得樣品和環糊精的混合物；b)將所述樣品和環糊精的混合物與擴增反應混合物接觸；c)對步驟b)中獲得的反應混合物進行擴增反應。
5.根據權利要求1的用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其包括下述步驟a)將所述樣品與擴增反應混合物接觸；b)加入至少一種環糊精；c)對步驟b)中獲得的反應混合物進行擴增反應。
6.根據權利要求1-5中任一項的用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其中包含在所述反應混合物中的環糊精的濃度為0. l-50mM。
7.根據權利要求1-6中任一項的用于改進樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和 /或特異性的方法，其中所述反應混合物包含0. 01-0. 2單位/ μ 1的熱穩定性DNA聚合酶。
8.根據權利要求1-7中任一項的用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其中所述反應混合物至少包含樣品、環糊精、熱穩定性DNA聚合酶、反應緩沖液、dNTP和至少一種引物。
9.根據權利要求1-8中任一項的用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其中所述環糊精選自下組α-環糊精、β-環糊精、Y-環糊精和它們的衍生物。
10.根據權利要求1-9中任一項的用于改進對樣品中靶核酸的擴增反應的產率、靈敏度和/或特異性的方法，其中所述環糊精選自下組單丙二胺-β -環糊精(monopropane diamino-β -eyelodextrin) ,6-0- α -D-麥芽糖基-β環糊精、羥乙基-β -環糊精、羥丙基-β -環糊精和2-羥丙基-β -環糊精。
11.一種用于改進由DNA聚合酶催化的核酸體外合成的特異性和/或產率的方法，包括將單鏈核酸與DNA合成反應混合物接觸，所述DNA合成反應混合物包含DNA聚合酶、引物、 dNTP和至少一種環糊精。
12.根據權利要求11的用于改進由DNA聚合酶催化的核酸體外合成的特異性和/或產率的方法，包括使所述引物退火至所述單鏈核酸并在所述引物的3’端摻入互補的dNTP。
13.根據權利要求9-12中任一項的用于改進由DNA聚合酶催化的核酸體外合成的特異性和/或產率的方法，其中包含在最終反應混合物中環糊精的濃度為0. l_50mM，所述最終反應混合物包含單鏈核酸和所述DNA合成反應混合物。
14.一種用于擴增樣品中靶核酸的試劑盒，其在同一容器中包含至少一種環糊精和至少一種選自下組的組分熱穩定性DNA聚合酶、用于核酸擴增的反應緩沖液、dNTP和寡核苷酸引物。
15.根據權利要求14的用于擴增樣品中靶核酸的試劑盒，其在同一容器中或另外的容器中還包含逆轉錄酶。
16.一種用于擴增樣品中靶核酸的組合物，其包含環糊精、熱穩定性DNA聚合酶和儲存緩沖液。
全文摘要
本發明涉及使用環糊精通過DNA聚合酶進行的體外DNA合成方法。本發明還涉及包含環糊精的方法、組合物和試劑盒以供核酸的擴增。環糊精的使用改善了擴增反應的特異性、靈敏度和/或產率。本發明更具體地涉及包含環糊精的用于進行PCR反應的試劑盒、組合物和方法。
文檔編號C12Q1/68GK102317472SQ200980156656
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月14日 優先權日2008年12月12日
發明者A.古魯卡亞, A.維塔爾, E.科利特, M-C.貝克斯, P.克羅內特 申請人:歐洲基因技術股份有限公司