一種基于合成單鏈dna文庫進化酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基于合成單鏈DNA文庫進化酶的方法，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 隨著分子生物學技術和基因工程技術的發展，已有數千種類的天然酶基因被發 現，由于酶介導的生物催化具有環境友好型，高效專一性和反應條件溫和等優點，作為生催 化的主導者，被廣泛應用于復雜的藥物、中間體、化合物的合成，甚至生物燃料的合成。合成 生物和代謝工程中酶是核心的參與者，通過構建一系列的代謝合成途徑，可以實現微生物 代謝合成各種有機合成無法獲得的復雜化合物，如芳烴、碳水化合物、有機酸、醇和其他次 級代謝產物。然而，在大多數情況中，天然酶的性質的局限性，極大地限制了它在各種復雜 條件下的使用。
[0003] 自然界在遺傳突變與自然選擇的動態平衡過程中，進化出了非常精確且又高效的 酶，然而自然選擇的速度非常緩慢，需要漫長的時間。人們迫切需要對天然酶進行人工進化 和改造，以期獲得能夠滿足人們需求的功能更強大的新酶。在當今實驗技術條件下，人們通 過物理化學等方法，例如紫外、射線和亞硝酸鹽等極大地提高了基因突變的頻率，為人工快 速進化基因提供了可能。然而，物理化學等方法造成的突變往往都是有害突變，且隨機性較 大，還無法滿足大規模的進化需求。隨著分子生物學技術的日趨成熟，從基因操作水平上直 接對天然基因引入特定的或隨機的突變位點已成為可能。隨機突變方法是通過引進隨機的 堿基替換，進而篩選理想的突變體。例如易錯PCR技術，是目前使用較廣的基因進化方式之 一，通過在體外聚合酶鏈反應（PCR)過程中隨機引入突變點，高通量篩選有益進化的基因。 經過多輪次操作后，可以獲得酶學性質和功能發生明顯變化的新酶。在此基礎上發展起來 的各種依賴PCR技術引入突變點進化基因的技術如定點突變、基因嵌合以及瞬時模板的隨 機嵌合等方法。然而，上述方法產生的突變點多樣性少，產生的突變體也多為有害突變，工 作量大而且效率極低。
[0004] 1994年，一種的定向進化新技術DNA改組（DNA shuffling)悄然誕生，Stemmer在 Nature發表了一篇題為Rapid evolution of a p rotein in vitro by DNA shuffling的 文章，首次提出了 DNA改組技術。研宄者以β-內酰胺酶系統為試驗對象，運用DNA改組， 經過三輪篩選和兩次回交得到一新菌株，其頭孢噻H虧（cefotaxime)的最低抑制濃度比原 始菌株提高了 16000倍，遠高于錯誤傾向PCR的突變篩選結果。隨后發展起來的各種以重 組技術為基礎的方法，以提高基因雜交的程度和篩選效率為目標，都獲得了比較好的效果。 然而，DNA shuffling技術對序列同源性的要求較高（同源性大于75% )且需要獲取同源 基因材料。這兩個條件極大限制了 DNA shuffling技術的應用，同時該技術產生的突變體 往往有較多的移碼突變體。
[0005] 此外，當前合成生物學和代謝工程對合成途徑的改造基本都注重在對合成途徑基 因的表達調控上，例如增強途徑基因的表達，敲除或者抑制競爭途徑，例如優化啟動子或者 核糖體結合位點，優化基因的密碼子，改造途徑基因的間隔調控區域等。另外，對合成途徑 中的酶進行改造也是非常有必要的，例如關鍵酶的限速問題、受產物或者底物反饋抑制。因 為，如果僅僅加強表達水平，可能會導致細胞合成能力的浪費和細胞生長負擔，而不能從根 本上解決代謝途徑流量平衡的問題。
[0006] 本發明采用體外PCR重組技術為基礎，通過人工合成單鏈DNA文庫，采用PCR技術 獲得含有多樣性極其豐富的突變文庫，再采用體外重組技術構建突變篩選文庫。此技術克 服了上述隨機突變多樣性不足、DNA shuffling技術同源序列和同源基因材料的限制等因 素，而且操作實施簡單，易于獲得豐富的突變體文庫，為基因體外快速進化奠定了基礎，同 時，結合蛋白結構生物信息學和合成生物學，特別適合于酶基因和代謝合成途徑的快速定 向進化應用。當然，本發明同樣適用于只有一個目標突變區域的情況。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種基于合成單鏈DNA文庫進化酶的方法（Rapidly Efficient Combinatorial Oligonucleotides for Direct Evolution，RECODE)，主要包括制備突變體 文庫、篩選突變體；所述突變體文庫包括單鏈突變體文庫和雙鏈突變體文庫，單鏈突變體文 庫和雙鏈突變體文庫可以分開構建，也可以同步構建得到。為構建單鏈突變體文庫，針對親 本基因的各個目標突變區域分別設計引物，各引物方向相同，并通過向PCR體系中添加 DNA 連接酶來連接各發生突變的核苷酸片段，得到完整的單鏈突變體；為構建雙鏈突變體文庫， 單鏈突變體的兩端需帶上額外的錨點序列，便于在雙鏈化時，設計用于特異性擴增單鏈突 變體的引物。
[0008] 所述目標突變區域可以是有目的地選擇得到的或隨機產生的。對一條鏈上進行同 時突變的區域數量在理論上不受限制，實際操作中可根據需要自行設定，2k以內的基因可 以在1-15個位點之間。
[0009] 所述方向相同，是指各引物均為3'至5'方向，或均為5'至3'方向。當親本基因 是雙鏈DNA時，引物方向相同可以保證PCR過程僅以特定方向的DNA鏈為模板，最終得到單 鏈突變體。
[0010] 所述親本基因編碼的是酶基因；親本基因的存在形式不受限制，可以為質粒、基因 組、雙鏈DNA片段或者單鏈cDNA。
[0011] 所述單鏈突變體文庫和雙鏈突變體文庫同步構建，是直接向構建單鏈突變體文庫 的PCR體系中添加特異結合單鏈突變體的引物，邊PCR獲得單鏈突變體，邊以單鏈突變體為 模板進行雙鏈化反應和雙鏈突變體的擴增反應。
[0012] 所述單鏈突變體文庫和雙鏈突變體文庫分步構建時，直接以含單鏈突變體文庫的 PCR混合物作為模板，不更換反應體系，直接向其中加入特異結合單鏈突變體的引物進行 第二輪PCR制備全長完整的雙鏈突變體；或者以經柱純化回收后的單鏈突變體文庫作為模 板，重新配制反應體系進行第二輪PCR制備全長完整的雙鏈突變體。
[0013] 為構建單鏈突變體文庫，針對親本基因的一個或多個目標突變區域，分別設計相 應的引物，稱為編輯引物。所述編輯引物含有需要向突變區域引入的突變堿基且3'和5' 端分別有適當長度的與模板鏈匹配的序列；涉及多個突變區域時，各編輯引物為同方向，均 與同一模板鏈配對結合。同時，合成兩條與編輯引物同方向的錨點引物，其中一條是上游錨 點引物，一條是下游錨點引物，所述上游錨點引物含有一段與模板鏈3'端匹配的核苷酸序 列，此外，該上游錨點引物的5'端還有15-25bp的錨點序列；所述下游錨點引物含有一段與 模板鏈5'端匹配的核苷酸序列，此外，該下游錨點引物的3'端還有15-25bp的錨點序列。
[0014] 對于編輯引物，為節省合成費用，一般建議編輯引物長度低于59bp，若有需要可增 加引物長度，或者可分為兩條短引物。需要進行突變的位點一般置于編輯引物的中間部位， 根據需要可進行高度簡并，若親本編碼的是蛋白序列，為避免終止密碼子TAA、TAG和TGA出 現，三聯密碼子可簡并為VNN或者降低終止子出現的概率，編輯引物合成優選PAGE純化方 式。
[0015] 所述錨點引物，還可以兼具編輯引物的功能，即在作為錨點引物的同時，還可以含 有需要向突變區域引入的突變堿基。
[0016] 所述錨點序列，一方面可以在構建雙鏈突變體文庫時，用于設計專一與單鏈突變 體結合的外端引物，另一方面還可作為同源重組序列，用于突變體文庫與表達載體的連接。 在將雙鏈突變體與載體連接時，不建議使用限制性酶切位點進行重組載體，因為高度簡并 的突變引入，可能會使基因內部出現相應的酶切位點。
[0017] 所述需要在突變區域引入的突變堿基可以是具體的堿基序列，也可以是簡并堿基 序列。
[0018] 所述編輯引物和下游錨點引物，在使用前先采用T4多聚核苷酸激酶對引物的5' 端羥基進行磷酸化反應。
[0019] 所述編輯引物的3'和5'端序列分別保留15-30bp的與模板完全匹配的寡聚核苷 酸序列。
[0020] 制備單鏈突變體文庫的反應過程是DNA延伸和DNA連接同步進行的反應：上、下游 錨點引物、編輯引物與模板DNA以適當摩爾比混合，添加 DNA聚合酶和DNA連接酶，反應緩 沖液。反應緩沖液中Mg2+濃度為1-lOmM，PCR退火溫度為40-66 °C，PCR延伸溫度為65-72°C， PCR反應循環數為1-35個。PCR產物中包括變性解鏈后未用作模板的單鏈DNA、大量的發生 突變的單鏈DNA、與模板結合著的處于雙鏈狀態的發生突變的DNA鏈。