專利名稱：：一種鴨感染里默氏桿菌病和大腸桿菌病的快速鑒別診斷方法
技術領域：
：本發明屬分子生物學領域，具體是一種鴨感染里默氏桿菌病和大腸桿菌病的快速鑒別診斷方法。
背景技術：
：鴨疫里默氏桿菌病(Riemerellaanatipestiferinfection,RAI)是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer,RA)引起的一種主要危害2-3周齡雛鴨的接觸性傳染病，該病呈急性或慢性敗血癥形式，其病理特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎，常常與大腸桿菌混合感染，給疾病的診斷和治療帶來一定的困難；本病發病率高、死亡率高、淘汰率高、耐過鴨生長緩慢等而給養鴨業造成巨大的經濟損失。RA為革蘭氏陰性桿菌。大腸桿菌病(Colibacillosis)是由大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)某些致病性血清型菌株引起的疾病，E.coli是革蘭氏陰性桿菌。雛鴨發生大腸桿菌病，其發病病理特征與鴨疫里默氏桿菌病極為相似，主要是纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎，通過臨床癥狀和病理變化來鑒別這兩種疫病有一定的困難。傳統檢測兩種疾病是通過細菌分離，然后再分別進行生化反應的鑒定，已報道的研究只是針對RA的檢測建立了PCR的診斷，缺乏對兩種細菌混合快速診斷方法。例如樂濤等對RA和E.coli的混合感染進行了細菌的分離鑒定；胡清海等對應用PCR技術檢測鴨疫里默氏桿菌進行了相關研究。這些應用細菌分離鑒定的方法對RA和E.coli混合感染進行檢測，但是存在耗時且敏感性不強，而單一針對RA的PCR檢測，對RA和E.coli的混合感染則未能同時完成檢測。
發明內容為克服現有技術的不足，本發明提供一種鴨感染里默氏桿菌和大腸桿菌的快速鑒別檢測方法。本發明解決上述技術問題的技術方案是本方法應用分子生物學技術，選擇鴨感染里默氏桿菌42-KD外膜蛋白基因和大腸桿菌phoA基因合成了兩對特異性引物，在一個反應系統同時對兩種病菌的基因分別進行擴增，其擴增產物的大小分別為809bp和622bp，兩者大小相差187bp，足以將兩者明顯區分。因此，建立的RA和大腸桿菌兩重PCR方法，一方面可分別對這兩種細菌引起的鴨病進行診斷，另一方面還可以對這兩種相似的細菌進行鑒別。具有快速、特異、敏感的優勢。檢測方法步驟如下1)增菌培養基的制備增菌培養基按下列方法進行配制將Nac1，胰蛋白胨，牛肉湯混勻，在HI值7.27.4、溫度121°C或107.9kPa高壓條件下，滅菌15min;培養基冷卻至室溫，無菌加入小牛血清，使之最終濃度為10%，混勻后可使用或密封放置室溫保存備用。2)待檢樣品的準備A.細菌平板分離物用巧克力平板對疑似病鴨進行細菌分離，在燭缸中培養2448小時后取平板上生長菌落，用無菌生理鹽進行10—9的稀釋。B.細菌增菌培養物將病死鴨的腦組織，研磨后用滅菌生理鹽水l:5的重量比例稀釋，稀釋病料中加入增菌培養基500iiL，稀釋病料在培養基里的濃度為20%，在37t:搖床培養4h8h，將培養物10000r/min離心，去除上清400yL，剩余的病料培養物吹打均勻，留著抽提DNA用。3)待檢樣品DNA抽提取待檢病鴨的細菌平板分離物或者細菌增菌培養物的樣品約50ul，置于1.5mL離心管中，置于99。C水浴1015min，獲得的模板DNA，用于PCR擴增或置-2(TC保存。4)PCR檢測A.DNA抽提將細菌平板分離物和細菌增菌培養物99t:水浴1015min處理后，-2(TC保存備用。B.反應液配置在冰浴條件下，按下列試劑用量在PCR反應管中分別加入下列各成分-10XBuffer:2.5iiL，終濃度為1倍；-25mmolMgCl2:1.5iiL，終濃度為1.5mmo1;-5U/iiLTaqDNA聚合酶0.3iiL，終濃度為0.06U/iiL;-25mmol/LRA特異性引物1PL，終濃度為0.5mmol/L;-25mmol/LE.coli特異性引物1PL，終濃度為0.5mmol/L。-dNTPs:濃度為2.5mM的0.5iiL;-DNA模板3iiL。-RNaseFree:補足至總體積為25iiL。C.反應程序取步驟B配置好的反應液，瞬時離心混勻，將PCR反應管置于PCR儀內，按如下程序進行反應①95°C，5min;②94°C，lmin;③55°C，50s;72°C，lmin;②④循環30次；72°C，8min;⑥4。C結束反應；將PCR產物直接用于電泳或者保存于4。C冰箱以備電泳；RA和E.coli的DNA最低檢測濃度均為2.98pg。5)PCR檢測結果判斷將10iiLPCR產物與2iU凝膠電泳加樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中，同時設置標準分子量DNAMarker對照，以5V/cm膠長的穩壓進行電泳，直至溴酚藍指示劑到達離瓊脂糖凝膠末端2cm3cm時停止。將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外線透射儀上觀察，與標準DNA分子量及陽性對照比較分析，判定結果，并用凝膠成像系統拍照保存。若應用二重PCR，被檢樣品在809bp的片段位置上出現一條DNA擴增帶，判定為RA陽性，記為RA"+";被檢樣品在622bp的片段位置上出現一條DNA擴增帶，判定為E.coli陽性，記為E.coli"+";若被檢樣品在該兩處位置無DNA擴增帶出現，則判定為RA、E.coli陰性，記為RA(-)、E.coli(-)。本發明的優點是本發明方法與傳統的鑒別診斷方法相比較，需要的費用更低、效率更高、特異性更強。圖1是引物特異性試驗瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中1.標準DNA分子量(lOObpladderDNAMarker);2-6.依次是對樣品大腸桿菌(_)、沙門氏菌(_)、巴氏桿菌(_)、葡萄球菌(_)和鴨疫里默氏桿菌(+)的RA擴增結果；7-11.依次是對樣品沙門氏菌(-)、巴氏桿菌(-)、葡萄球菌(-)、鴨疫里默氏桿菌(_)和大腸桿菌(+)的E.coli擴增結果；注"809bp"為擴增RA獲得的目的基因片段；"622bp"為擴增E.coli獲得的目的基因片段；"-"表示檢測結果陰性；"+"表示檢測結果陽性。圖2是擴增反應敏感性試驗瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中1.標準DNA分子量(100bpladderDNAmarker);2.參考株RA(+)和E.coli(+)DNA濃度為190ng/L的擴增電泳結果；3.參考株RA(+)和E.coli(+)DNA濃度為47.50ng/L的擴增電泳結果；4.參考株RA(+)和E.coli(+)DNA濃度為11.88ng/L的擴增電泳結果;5.參考株RA(+)和E.coli(+)DNA濃度為2.98ng/L的擴增電泳結果；6.參考株RA(+)和E.coli(+)DNA濃度為0.75ng/L的擴增電泳結果；7.參考株RA(+)和E.coli(+)DNA濃度為0.19ng/L的擴增電泳結果;8.陰性對照(_)的擴增電泳結果。注"809bp"為擴增RA獲得的目的基因片段；"622bp"為擴增E.coli獲得的目的基因片段；"-"表示檢測結果陰性；"+"表示檢測結果陽性。具體實施例方式1.增菌培養基的制備增菌培養基按下列方法進行配制-Nacl:0.5g;——蛋白胨lg;-牛肉湯90mL(濃度為0.5g/ml);——小牛血清10mL(5X濃度)將Nacl，胰蛋白胨，牛肉湯混勻，在規范的HI值7.27.4，溫度121°C或6107.9kPa高壓條件下，滅菌15min，培養基冷卻至室溫，無菌加入小牛血清，混勻后可使用或密封放置室溫保存備用。注新制備的培養基均應做無菌檢查，并用已知陽性菌和陰性菌進行測試，以保證培養基的質量。2.待檢樣品的準備細菌平板分離物用巧克力平板對疑似病鴨進行細菌分離，在燭缸中培養2448小時后取平板上生長菌落進行10—9的稀釋。細菌增菌培養物將病死鴨的腦組織，研磨后用滅菌生理鹽水1:5的比例稀釋，稀釋病料中加入胰蛋白胨肉湯+小牛血清(10%)的培養基500iiL(稀釋病料在培養基里的接種量20%)，37。C搖床培養4h8h，將培養物10000r/min離心，去除上清400iiL，剩余的病料培養物吹打均勻，留著備用抽提DNA。3.待檢樣品DNA抽提無菌采取待檢病鴨增菌培養后的組織液或者分離培養的細菌稀釋液樣品約50ul，置于1.5mL離心管中99°C水浴1015min，獲得的模板DNA可直接用于PCR擴增或置-20°C保存備用。4.PCR檢測DNA抽提將細菌平板分離物和細菌增菌培養物99°C水浴1015min處理后，-2(TC保存備用；反應液配置在冰浴條件下，按下列試劑用量在PCR反應管中分別加入各成分-10XBuffer:2.5iiL，終濃度為1倍；-25mmolMgCl2:1.5iiL，終濃度為1.5mmo1;-5U/iiLTaqDNA聚合酶0.3iiL，終濃度為0.06U/iiL;-25mmol/LRA特異性引物1PL，終濃度為0.5mmol/L;-25mmol/LE.coli特異性引物1PL，終濃度為0.5mmol/L-dNTPs:濃度為2.5mM的0.5iiL;-DNA模板3iiL-RNaseFree:補足至總體積為25iiL。反應程序加完試劑后瞬時離心混勻。將PCR反應管置于PCR儀內，按如下程序進行反應①95。C，5min;②94°C，lmin;③55。C，50s;④72°C，lmin;②④循環30次；⑤72。C，8min;⑥4t:結束反應。PCR產物直接用于電泳或者保存于4t:冰箱以備電泳。RA和E.coli的DNA最低檢測濃度均為2.98pg，500nmol/L。表1兩重PCR的引物序列及擴增片斷長度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4.PCR檢測結果判斷將10PLPCR產物與2iU凝膠電泳加樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中。同時設置標準分子量DNAMarker對照。以5V/cm膠長的穩壓進行電泳，直至溴酚藍指示劑到達離瓊脂糖凝膠末端2cm3cm時停止。將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外線透射儀上觀察，與標準DNA分子量及陽性對照比較分析，判定結果，并用凝膠成像系統拍照保存。若應用二重PCR，被檢樣品在809bp的片段位置上出現一條DNA擴增帶，判定為RA陽性，記為RA"+";被檢樣品在622bp的片段位置上出現一條DNA擴增帶，判定為E.coli陽性，記為E.coli"+";若被檢樣品在該兩處位置無DNA擴增帶出現，則判定為RA、E.coli陰性，記為RA(-)、E.coli(-)。權利要求一種鴨感染里默氏桿菌病和大腸桿菌病的快速鑒別診斷方法，其特征在于，選擇鴨感染里默氏桿菌42-KD外膜蛋白基因和大腸桿菌phoA基因合成了兩對特異性引物用于兩種病菌的基因擴增，其擴增片段大小分別為809bp和622bp，兩者大小相差187bp，建立的RA和E.coli兩重PCR方法能快速、特異、敏感地檢測并同時鑒別這兩種細菌。檢測方法步驟如下1)增菌培養基的制備增菌培養基按下列方法進行配制將NaCl、胰蛋白胨和牛肉湯混勻，在PH值7.2～7.4、溫度121℃或107.9kPa高壓條件下，滅菌15min；培養基冷卻至室溫，無菌加入小牛血清使之最終濃度為10％，混勻后可使用或密封放置室溫保存備用；2)待檢樣品的準備A.細菌平板分離物用巧克力平板對疑似病鴨進行細菌分離，在燭缸中培養24～48小時后取平板上生長的菌落，用無菌生理鹽水作10-9的稀釋；B.細菌增菌培養物將病死鴨的腦組織，研磨后用滅菌生理鹽水1∶5的重量比例稀釋，稀釋病料中加入增菌培養基500μL，稀釋病料在培養基里的比例為20％，37℃搖振培養4h～8h，將培養物10000r/min離心，去除上清400μL，剩余的培養物吹打均勻，留作抽提DNA用；3)待檢樣品DNA抽提取待檢病鴨的細菌平板分離物或者細菌增菌培養物的樣品約50μl，于1.5mL離心管中，置99℃水浴10～15min，獲得模板DNA，用于PCR擴增或置-20℃保存；4)PCR檢測A.DNA抽提將細菌平板分離物和細菌增菌培養物99℃水浴10～15min處理后，-20℃保存備用；B.反應液配置在冰浴條件下，按下列試劑用量在PCR反應管中分別加入下列各成分——10×Buffer2.5μL(終濃度為1倍)；——25mmolMgCl21.5μL(終濃度為1.5mmol)；——5U/μLTaqDNA聚合酶0.3μL(終濃度為0.06U/μL)；——25mmol/LRA上下游半巢式引物1μL(終濃度為0.5mmol/L)；——25mmol/LE.coli上下游半巢式引物1μL(終濃度為0.5mmol/L)；——dNTPs濃度為2.5mM的0.5μL；——DNA模板3μL——RNaseFree雙蒸水補足至總體積為25μL；C.反應程序取步驟A配置好的反應液，瞬時離心混勻，將PCR反應管置于PCR儀內，按如下程序進行反應①95℃，5min；②94℃，1min；③55℃，50s；④72℃，1min；②～④循環30次；⑤72℃，8min；⑥4℃結束反應；將PCR產物直接用于電泳或者保存于4℃冰箱以備電泳。RA和E.coli的DNA最低檢測濃度均為2.98pg；5)PCR檢測結果的判斷將10μLPCR產物與2μl凝膠電泳加樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中，同時設置標準分子量DNAMarker對照，以5V/cm膠長的穩壓進行電泳，直至溴酚藍指示劑到達離瓊脂糖凝膠末端2cm～3cm時停止；將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外線透射儀上觀察，與標準DNA分子量及陽性對照比較分析，判定結果，并用凝膠成像系統拍照保存；若應用二重PCR，被檢樣品在809bp的片段位置上出現一條DNA擴增帶，判定為RA陽性，記為RA“+”；被檢樣品在622bp的片段位置上出現一條DNA擴增帶，判定為E.coli陽性，記為E.coli“+”；若被檢樣品在該兩處位置無DNA擴增帶出現，則判定為RA和E.coli陰性，記為RA(-)和E.coli(-)。全文摘要本發明公開了一種鴨感染里默氏桿菌病和大腸桿菌病的快速鑒別診斷方法。該方法是選擇鴨感染里默氏桿菌42-KD外膜蛋白基因和大腸桿菌phoA基因合成了兩對特異性引物用于兩種病菌的基因擴增，其擴增片段大小分別為809bp和622bp，兩者大小相差187bp，建立的RA和E.coli兩重PCR方法能快速、特異、敏感地檢測并同時鑒別這兩種細菌。本發明的優點是本發明方法與傳統的鑒別診斷方法相比較，需要的費用更低、效率更高、特異性更強。文檔編號C12Q1/68GK101736088SQ201010102938公開日2010年6月16日申請日期2010年1月29日優先權日2010年1月29日發明者尤巖巖,楊宗維,韋天超,韋平申請人:廣西大學