來自尿路病原性大腸桿菌的免疫原的制作方法

專利名稱：來自尿路病原性大腸桿菌的免疫原的制作方法
技術領域：
本發明屬于大腸桿菌(E. coli)生物學領域，具體涉及能引起對腸外病原性大腸桿菌(ExPEC)菌株的免疫的免疫原。
背景技術：
很少有微生物具有如大腸桿菌般的多用途。同時作為哺乳動物正常腸道微生物區系的重要成員，其已被廣泛用作重組DNA技術的宿主。然而，大腸桿菌也可能成為致命病原體。大腸桿菌菌株通常被分為共生性或病原性，病原性菌株再分成腸內或腸外菌株。更新的分類技術如多基因座酶電泳法(MLEE)將大腸桿菌分為5類系統發生組(A、BI、B2、D和E)，這些分組與傳統的分類不匹配。例如MLEE BI組包括共生性和病原性菌株，D組包括腸內和腸外菌株。大腸桿菌的腸外病原性菌株(或’ ExPEC 菌株[I])落入MLEE B2組和D組中，包括尿路病原性(UPEC)菌株和腦膜炎/膿毒癥相關性(MNEC)菌株。UPEC菌株引起尿路感染(UTI)，為膀胱炎的最普遍形式。它們還引起腎盂腎炎(及其并發癥如膿毒癥)和尿導管相關感染。MNEC菌株引起病例致死率范圍在25% -40%的新生兒腦膜炎(每1000個活新生兒中出現O. I例)，還引起大約1/6的膿毒癥病例。最早的ExPEC疫苗基于細胞裂解物或細胞結構。S0LC0UR0VAC 包括10種不同的熱殺細菌，包括6種ExPEC菌株，參考文獻2中報道了成功的II期臨床實驗。UR0-VAX0M 是ー種含有18種選擇的大腸桿菌菌株的凍干細菌裂解物的ロ服片劑疫苗[3]。BaxterVaccines研制出一種基于6_10種不同菌株來源的菌毛的UTI疫苗,但該產品已被放棄。MedImmune研制出一種基于FimH粘附素復合物的名為MEDI516的產品[4]，但是II期臨床實驗顯示效カ不夠。而且，這種疫苗存在影響正常腸道菌叢中的非病原性FimH^菌株的風險，同吋，由于其膀胱特異性粘附機制，預計這種疫苗僅對UPEC菌株有效，而其它ExPEC菌株不受它的控制。因此，需要ー種改良的ExPEC疫苗，還需要從天然細胞裂解物轉移到更明確的分子，還需要鑒定適于包含入疫苗的其它抗原，尤其是那些在臨床ExPEC菌株中很普遍、而在共生性菌株中不存在的抗原。
參考文獻5報道了滿足上述需要的ー種方法，其發明人尋找在MLEE B2類型和D類型的基因組中存在但在MLEE A類型和BI類型中不存在的基因。基于扣除雜交的其它比較方法參見參考文獻6和7。參考文獻8中也鑒定了 ExPEC菌株的毒力基因。參考文獻9分析了 UPEC大腸桿菌菌株536中的四種致病性島(island)。參考文獻10采用UPEC(06:K2:H1)菌株CFT073的基因組序列[11，12]來鑒定在非病原性大腸桿菌菌株中不存在的序列。參考文獻13比較了大腸桿菌人腎盂腎炎分離物536(06:K15:H31)( ー種UPEC)的基因組序列與菌株CFTO 7 3 (UPEC)、EDL933(腸出血性)和MG1655(非病原性實驗菌株)的序列數據。病原性菌株的基因組序列獲自數據庫中的登錄號AE005174、BA000007和NC-004431。非病原性菌株的序列獲自登錄號U00096。本發明的目的是提供用于引起對病原性大腸桿菌菌株、具體是ExPEC菌株、更具體是UPEC菌株的免疫的其它抗原。

發明內容
發明人確定了能包含入對病原性大腸桿菌菌株有特異性的免疫原性組合物中的各種基因。所述基因來自尿路病原性菌株(UPEC)，然而在非病原性菌株中不存在，并且其編碼蛋白的細胞定位使它們可受免疫系統的影響。一方面，本發明涉及一種多肽，其包含(a)選自下組的氨基酸序列SEQ ID N022、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、
218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598和599 ； (b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少10個連續氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%并包含氨基酸序列(a)中至少10個連續氨基酸的片段的氨基酸序列。在ー個具體實施方式
中，本發明這方面的多肽包含ー種片段，其包含至少ー個(a)的B細胞表位。 另ー方面，本發明涉及一種多肽，其包含(a)選自下組的氨基酸序列SEQ IDNO22、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598 和 599 ； (b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少10個連續氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%并包含氨基酸序列(a)中至少10個連續氨基酸的片段的氨基酸序列。在ー個具體實施方式
中，本發明這方面的多肽包含ー種片段，其包含至少ー個(a)的B細胞表位。本發明的多肽可用于在患者中產生免疫應答的藥物及藥物的制備。本發明還涉及ー種藥物組合物，其包含與藥學上可接受載體混合的本發明多肽。本發明還涉及ー種藥物組合物，其包含兩種或多種與藥學上可接受載體混合的本發明多肽。在ー個具體實施方式
中，本發明藥物組合物還包含疫苗佐劑。本發明還涉及免疫原性組合物，其包含表達或過表達包含如下氨基酸序列的ー種或多種多肽的一種或多種外膜泡(OMV) (a)選自下組的氨基酸序列SEQ IDNO 22、120、
219、221、305、371、400、489、555、565、597、598 和 599 ;(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少10個連續氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%并包含氨基酸序列(a)中至少10個連續氨基酸的片段的氨基酸序列。在ー個具體實施方式
中，本發明這方面的免疫原性組合物包含一種或多種多肽，所述多肽含有包含至少ー個(a)的B細胞表位的片段。本發明還涉及ー種在患者中產生免疫應答的方法，所述方法包括給予所述患者本發明的藥物組合物或免疫原性組合物的步驟。在ー個具體實施方式
中，所述免疫應答能保護對象不受ExPEC感染。 本發明的其它方面描述如下。


圖I顯示用熱滅活CFT073進行免疫后，用CFT073刺激后小鼠的存活率。
具體實施方式
本發明人鑒定了可包含在對病原性大腸桿菌菌株特異性的免疫原性組合物中的各種基因。所述基因來自UPEC菌株，然而在非病原性菌株中不存在，并且其編碼蛋白的細胞定位使它們可受免疫系統的影響。多肽本發明提供多肽，其包含實施例中公開的氨基酸序列。序列表中的SEQ IDN01-596和SEQ ID NO 597-599給出了這些氨基酸序列。SEQ ID NO 1-596中的優選序列在表2、表3和表5中給出。本發明還提供包含與實施例中公開的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。針對特定序列，序列相同性程度優選大于50% (如60%、7 0%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)。這些多肽包括同源物、直向同源物、等位基因變體和突變體。一般地，兩種多肽序列之間相同性為50%或更高被認為是功能等效的標志。優選用MPSRCH程序(Oxford Molecular)中運行的Smith-Waterman同源性檢索算法來確定多肽間的相同性，其采用帶有參數缺ロ開放罰分=12和缺ロ延伸罰分=I的仿射缺ロ檢索來進行。與實施例的序列相比，這些多肽可包含ー個或多個(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
等)保守的氨基酸取代，即用具有相關側鏈的另ー種氨基酸取代原有氨基酸。遺傳編碼氨基酸通常分成4種家族(I)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性，即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起稱為芳族氨基酸。通常，這些家族中的單個氨基酸的替換不會對生物活性產生重要影響。相對于參比序列，所述多肽可以有ー個或多個(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)單個氨基酸的缺失。相對于參比序列，所述多肽還可包含ー個或多個(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(如1、2、3、4或5個氨基酸)。優選的多肽包含那些脂質化的、位于外膜中的、位于內膜中的、或位于周質中的多肽。尤其優選的多肽是同時屬于這些范疇中I種以上的多肽，如位于外膜中的脂質化多肽。翻譯后加工信號肽后脂蛋白的N端半胱氨酸共價連接于脂質。可以進行脂質化的多肽包括SEQID NO :1、2、7、12、13、14、15、16、17、18、22、26、28、29、33、34、38、40、45、50、51、59、67、68、69、71、77、80、82、83、84、92、98、103、104、105、120、121、124、125、126、127、130、131、133、134、138、142、147、159、160、176、184、185、186、187、192、206、210、215、222、223、225、226、228、233、234、246、251、252、268、272、273、275、284、287、293、295、297、298、299、300、302、303、304、305、310、311、312、314、315、320、326、327、330、331、336、340、359、360、364、366、367、369、370、371、374、378、379、386、387、388、389、390、395、400、401、407、408、418、419、422、423、425、429、431、433、434、435、436、438、441、442、444、447、453、464、465、472、478、492、500、506、509、517、518、519、523、526、531、536、540、543、544、546、548、551、557、559、560、562、563、564、565、566、568、569、574、577、583、584、585、586、593 和 594。優選多肽為表2、表3和表5列出的多肽，尤其是表3列出的多肽。本發明還提供包含實施例中公開的氨基酸序列的片段的多肽。所述片段包含該序列中至少η個連續氨基酸，針對特定序列，η為7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更大)。所述片段可包含該序列的至少ー
個T細胞表位，或優選地，B細胞表位。T細胞表位和B細胞表位可憑經驗鑒定(如采用PEPSCAN[14、15]或類似方法)或預測(如采用Jameson-WoIf抗原性指數[16]、矩陣基方法、TEPIT0PE[18]、神經網絡[19]、OptiMer & EpiMer [20、21]、ADEPT [22]、Tsites [23]、親水性[24]、抗原性指數[25]或參考文獻26公開的方法等)。其它優選片段為(a)本發明多肽的N端信號肽、(b)不具有N端信號肽的本發明多肽、(c)不具有其N端氨基酸殘基的本發明多肽。其它優選的片段為以可能的起始密碼子(ATG、GTG、TTG)編碼的氨基酸開始的那些片段。從所示起始密碼子下游的起始密碼子編碼的甲硫氨酸處開始的片段為本發明多肽。其它優選的片段為那些與本發明多肽以及與由參考文獻5、6、8、10和11中的任一 篇鑒定的多肽相同的片段。本發明多肽可以許多方式制備，如化學合成(全部或部分)、用蛋白酶消化較長多肽、對RNA進行翻譯、從細胞培養物(如重組表達的細胞培養物)或生物體本身(如經過細菌培養或直接來自患者的生物體)進行純化等。制備長度<40個氨基酸的多肽的優選方法包括體外化學合成[27、28]。尤其優選固相的肽合成，如基于tBoc或Fmoc[29]化學的方法。也可部分或全部采用酶合成[30]。作為對化學合成的替代方法，還可采用生物合成，例如可以通過翻譯來制備多肽。這可在體外或體內進行。生物學方法通常限于制備L氨基酸多肽，然而操控翻譯機器(如氨酰基tRNA分子)可用于引入D氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、疊氮高丙氨酸等)[31]。然而，含有D氨基酸吋，優選采用化學合成方法。可在C末端和/或N末端對本發明多肽進行共價修飾。本發明多肽可采取各種形式(如天然、融合、糖基化、非糖基化、脂質化、非脂質化、磷酸化、非磷酸化、十四烷基化、非十四烷基化、単體、多聚體、顆粒、變性等)。優選提供純化或基本純化形式，即基本上不含其它多肽(如不含天然產生的多肽)，尤其是不含其它ExPEC或宿主細胞多肽的本發明多肽，通常至少約50 %純(重量)，通常至少約90%純，即其它表達多肽占該組合物的約50%以下，更優選約10%以下(如5%或更少)。本發明的多肽優選為ExPEC多肽。本發明多肽可連接于固相載體。本發明多肽可包含檢測標記(如放射性或熒光標記或生物素標記)。術語“多肽”指任何長度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直鏈或支鏈，它可包含修飾氨基酸，并且可被非氨基酸所中斷。所述術語還涵蓋經天然修飾或介入(intervention)修飾的氨基酸聚合物；例如，ニ硫鍵形成、糖基化、脂質化、こ酰化、磷酸化或任何其它操控或修飾，如與標記組分偶聯。該定義還包括(例如)含有一個或多個氨基酸類似物(包括(如)非天然氨基酸等)以及其它本領域公知修飾的多肽。多肽可以單鏈或結合鏈的形式存在。本發明多肽可以是天然或人工糖基化的多肽(即所述多肽的糖基化模式與在相應的天然產生多肽中發現的糖基化模式不同)。本發明多肽的長度可以是至少40個氨基酸(如至少40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500 或更多)。本發明多肽可短于 500 個氨基酸(如不超過 40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400 或 450 個氨基酸)。本發明提供的多肽包含序列-X-Y-或-Y-X-，其中-X-為上述定義的氨基酸序列，-Y-并非上述定義的序列，即本發明提供融合蛋白。當多肽編碼序列的N末端密碼子并非ATG時，所述密碼子將會按照該密碼子的標準氨基酸進行翻譯而不是翻譯成Met，這種情況發生在該密碼子翻譯成起始密碼子吋。本發明提供一種制備本發明多肽的方法，包括在誘導多肽表達的條件下培養本發明的宿主細胞的步驟。本發明提供一種制備本發明多肽的方法，其中所述多肽部分或完全用化學方法合成。本發明提供ー種含有兩種或多種本發明多肽的組合物。本發明還提供一種以通式NH2-A-[-X-L-]n-B-C00H表示的雜交多肽，其中X為上述定義的本發明多肽，L為任選的接頭氨基酸序列，A為任選的N末端氨基酸序列，B為任選的C末端氨基酸序列，η為大于I的整數。η值在2和X之間，X值一般為3、4、5、6、7、
8、9或10。優選地，η為2、3或4 ;更優選地為2或3 ;最優選地，η = 2。在姆種η的例子中，-X-可以相同或不同。在[-X-L-]的每種η的例子中，接頭氨基酸序列-L-可有或無。例如，當 η = 2 時，該雜交體可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOHAH2-X1-X2-COOHAH2-X1-L1-X2-COOlNH2-X1-X2-L2-COOH等。接頭氨基酸序列-L-一般為短序列(如20個或更少氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個)。例子包括有助于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接頭(即Glyn，其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)、和組氨酸標簽(即Hisn，其中11 = 3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合適的接頭氨基酸序列對本領域技術人員而言是顯而易見的。-A-和-B-為任選序列，一般為短序列(如40個或更少氨基酸，即39、38、37、
36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、
11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個)。例子包括指導多肽運輸的前導序列，或有助于克隆或純化的短肽序列(如組氨酸標簽，即把811，其中11 = 3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合適的N末端和C末端氨基酸序列對本領域技術人員而言是顯而易見的。可采用各種試驗來評估本發明多肽的體內免疫原性。例如，多肽可重組表達并通過免疫印跡法用來篩選患者血清。多肽和患者血清之間發生陽性反應說明患者以前對所研究蛋白產生了免疫應答，即該蛋白為免疫原。這種方法還可用來鑒定優勢免疫蛋白。抗體本發明提供與本發明多肽結合的抗體。它們可以是多克隆或單克隆抗體，并可由任何合適方法制備(如通過重組表達)。為了增加其與人免疫系統的相容性，所述抗體可以是嵌合抗體或人源化抗體[如，參考文獻32和33]，或可采用完全人杭。所述抗體可以包含檢測標記(如用于診斷試驗)。本發明抗體可以連接于固相載體。本發明抗體優選為中和抗體。單克隆抗體對鑒定和純化與之結合的単獨多肽尤其有用。本發明的單克隆抗體也可以用作免疫測定、放射性免疫試驗(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等的試劑。在這些應用中，可用分析檢測試劑如放射性同位素、熒光分子或酶標記抗體。以上述方法制備的單克隆抗體還可用于本發明多肽的分子鑒定或表征(表位作圖)。 本發明抗體優選對大腸桿菌的ExPEC菌株具有特異性，即，相對于其它細菌(如，相對于非ExPEC大腸桿菌和相對于非大腸桿菌細菌)，它們優選地與ExPEC大腸桿菌結合。更優選地，所述抗體對UPEC菌株具有特異性，即，相對于其它細菌，包括其它ExPEC大腸桿菌，它們優選地與UPEC細菌結合。本發明抗體優選地以純化或基本純化形式提供。一般地，抗體存在于基本上不含其它多肽的組合物中，如組合物中其它多肽少于90% (重量)，通常少于60%，更通常少于50%。本發明抗體可以是任何同種型(如IgA、IgG、IgM,即α、γ或μ重鏈)，然而通常為IgG。在IgG同種型中，抗體可以是 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4亞類。本發明抗體可具有K或λ輕鏈。本發明抗體可具有各種形式，包括完整抗體，抗體片段如F(ab’)2和F(ab)片段、Fv片段(非共價異ニ聚體)、單鏈抗體(如單鏈Fv分子(scFv))、小抗體、寡抗體(oligobody)等。術語“抗體”不暗指任何特定來源，并包括由非常規方法(如噬菌體呈現)所獲得的抗體。本發明提供一種檢測本發明多肽的方法，包括如下步驟(a)在適于形成抗體-杭原復合物的條件下將生物樣品與本發明抗體接觸；和(b)檢測所述復合物。本發明提供一種檢測本發明抗體的方法，包括如下步驟(a)在適于形成抗體-杭原復合物的條件下將生物樣品(如血液或血清樣品)與本發明多肽接觸；和(b)檢測所述復合物。優選抗體與本發明多肽結合的親和カ明顯大于本領域公知抗體。優選地，該親和カ至少比本領域公知抗體強I. 5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍等。核酸本發明還提供包含編碼本發明多肽的核苷酸序列的核酸。本發明還提供包含與所述核苷酸序列有序列相同性的核苷酸序列的核酸。序列之間的相同性優選用上述Smith-Waterman同源檢索算法確定。本發明還提供可與這些核酸雜交的核酸。雜交反應可以在不同“嚴格”條件下進行。本領域眾所周知并公開了提高雜交嚴格性的條件[如參考文獻34第7. 52頁]。相關條件的例子包括(以嚴格性遞增的順序)培育溫度25で、37で、50で、55で和68で；緩沖液濃度:10XSSC、6XSSC、1XSSC、0. I X SSC (其中 SSC 為 O. 15M NaCl 和 15mM 檸檬酸鹽的緩沖液)及采用其它緩沖體系的等效物；甲酰胺濃度50%和75% ;培育時間從5分鐘到24小時；1次、2次或更多次洗滌步驟；1分鐘、2分鐘或15分鐘的洗滌培育時間；洗滌溶液6XSSC、1XSSC、0. IXSSC或去離子水。雜交技術及其優化為本領域公知[如見參考文獻34-37等]。一些實施方式中，本發明核酸在低嚴格條件下與靶點雜交；在其它實施方式中它在中等嚴格條件下雜交；優選實施方式中，它在高度嚴格條件下雜交。低嚴格雜交條件的示例性參數組為50°C和10XSSC。中等嚴格雜交條件的示例性參數組為55°C和1XSSC。高度嚴格雜交條件的示例性參數組為68°C和O. IXSSC0還提供了包含這些序列片段的核酸。它們應該包含序列中的至少η個連續核苷酸，根據特定序列，η 為 10 或更多(如 12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100,150,200或更多)。優選的片段為與本發明核酸序列和參考文獻5、6、8、10和11中任ー篇所鑒定的核苷酸序列相同的那些片段。本發明提供通式5' -X-Y-Z-3'的核酸，其中-X-為由X個核苷酸組成的核苷酸序列；-Z-為Z個核苷酸組成的核苷酸序列；-Y-為由以下片段組成的核苷酸序列(a)編碼SEQ ID NO :1-596之一的核酸序列的片段；或(b)編碼SEQ ID NO :597-599之一的核苷酸序列的片段；或(c) (a)或(b)的互補物;所述核酸5' -X-Y-Z-3'不是⑴編碼SEQ IDNO :1-596之一或編碼SEQ ID NO :597-599之一的核酸序列的片段，也不是(ii) (i)的互補物。-X-和/或-Z-部可包含啟動子序列(或其互補序列)。本發明包括包含與這些序列互補的序列的核酸(如作為反義鏈或探針，或用作引物)。本發明核酸可用于雜交反應(如Northern雜交或Southern印跡 、或用于核酸微陣列或‘基因芯片’)、擴增反應(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA, NASBA等)和其它核苷酸技術。本發明核酸可具有各種形式(如單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標記等)。本發明核酸可以是環狀或支鏈，然而通常為直鏈。除非另有限定或要求，采用核酸的本發明任何實施方式均可采用雙鏈形式和組成該雙鏈形式的兩條互補的單鏈形式。引物和探針通常為單鏈，反義核苷酸通常也是單鏈。優選以純化或基本純化的形式，即基本上不含其它核酸(如不含天然產生的核酸)、尤其不含其它ExPEC或宿主細胞核酸的形式提供本發明核酸，通常為至少約50%純(重量)，通常至少約90%純。本發明核酸優選地為ExPEC核酸。本發明核酸可以多種方式制備，如完全或部分采用化學合成(如DNA的亞磷酰胺合成)，用核酸酶消化較長核酸(如限制性酶)，連接基因組或cDNA文庫中的較短核酸或核苷酸(如采用連接酶或聚合酶)等。本發明核酸可以連接于固相載體(如珠子、平板、濾紙、膜、玻片、微陣列載體、樹脂等)。可用(如)放射性標記或熒光標記、或生物素標記標記本發明核酸。當該核酸用于檢測技術，如該核酸是引物或探針時，標記特別有用。術語“核酸”通常包括任何長度的核苷酸的聚合形式，其包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交體。它還包括DNA或RNA類似物，如含有修飾主鏈(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酷)或修飾堿基的類似物。因此本發明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重組核酸、支鏈核酸、質粒、載體、探針、引物等。當本發明的核酸采用RNA形式時，它可能或可能不帶有5'帽。本發明核酸包含序列，然而它們還可以包含非ExPEC序列(如上述通式5' -X-Y-Z-3'的核酸)。這對探針而言尤其適用，從而可使探針包含與靶核酸互補的第一序列和不與靶核酸互補的第二序列。引物中的任何此類非互補序列優選位于互補序列的
。典型的非互補序列包含限制性位點或啟動子序列。本發明的核酸可用許多方法制備，如化學合成(至少一部分)，用核酸酶(如限制性酶)消化較長核酸，連接基因組或cDNA文庫中的較短核酸(如采用連接酶或聚合酶)等。本發明核酸可以是載體的一部分，即設計用于轉導/轉染ー種或多種細胞類型的核酸構建物的一部分。載體可以是，例如，設計用來分離、増殖和復制插入核苷酸的“克隆載體”，設計用來在宿主細胞中表達核苷酸序列的“表達載體”，設計用來生產重組病毒或病毒樣顆粒的“病毒載體”，或包括超過ー種類型的載體的屬性的“穿梭載體”。優選的載體為質粒。“宿主細胞”包括單個細胞或細胞培養物，其可以作為或已經作為外源核酸的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突變和/或改變，所述后代不一定與原始親代細胞完全相同(形態方面或總DNA互補物(complement)方面)。宿主細胞包括用本發明核酸在體內或體外轉染或感染的細胞。當核酸為DNA吋，應理解，RNA序列中的“U”會被DNA中的“T”取代。相似地，當核酸為RNA吋，應理解，DNA序列中的“ T ”會被RNA中的“ U ”取代。當術語“互補物”或“互補”用于核酸時，指Watson-Crick堿基配對。因此C的互補物為G，G的互補物為C，A的互補物為T(或U)，T(或U)的互補物為Α。還 可能使用如1(嘌呤肌苷)這樣的堿基，與嘧啶(C或Τ)互補。所述術語還暗示了方向，即5' -ACAGT-3'的互補物為 5' -ACTGT-3'而不是 5' -TGTCA-3'。本發明核酸可用于，如制備多肽；作為在生物樣品中檢測核酸的雜交探針；產生核酸的額外拷貝；產生核酶或反義寡核苷酸；作為單鏈DNA引物或探針；或作為三鏈形式寡核苷酸。本發明提供一種制備本發明核酸的方法，其中所述核酸為部分或全部采用化學方法合成的。本發明提供包含本發明核苷酸序列的載體(如，克隆或表達載體)和轉染有所述載體的宿主細胞。本發明還提供包含用于擴增ExPEC核酸序列內所含模板序列的引物(如PCR引物)的試劑盒，所述試劑盒包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物與所述模板序列基本互補，所述第二引物與所述模板序列的互補物基本互補，其中基本互補的所述引物部分確定了待擴增模板序列的末端。所述第一引物和/或第二引物可包括可檢測標記(如熒光標記)。本發明還提供ー種試劑盒，其包括第一和第二單鏈寡核苷酸，其可以擴增單鏈或雙鏈核酸(或其混合物)內所含的ExPEC模板核酸序列，其中(a)所述第一寡核苷酸包含與所述模板核酸序列基本互補的引物序列；(b)所述第二寡核苷酸包含與所述模板核酸序列的互補物基本互補的引物序列；(C)所述第一寡核苷酸和/或所述第二寡核苷酸包含不與所述模板核酸互補的序列；和(d)所述引物序列確定了待擴增模板序列的末端。所述特征(c)的非互補序列優選位于所述引物序列的上游(即其5'方向)。(c)序列中一種或兩種可包含限制性位點[如參考文獻38]或啟動子序列[如39]。第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸可包括可檢測標記(如熒光標記)。本發明提供檢測本發明核酸的方法，包括如下步驟(a)在雜交條件下將生物樣品與本發明核酸探針接觸以形成雙鏈體；和(b)檢測所述雙鏈體。本發明提供檢測生物樣品(如血液)的方法，包括如下步驟在雜交條件下將生物樣品與本發明核酸接觸。所述方法可以包括核酸擴增(如，PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)或雜交(如微陣列、印跡、在溶液中與探針雜交等)。已經報道過用PCR檢測臨床樣品中的ExPEC [如，見參考文獻40]。在參考文獻41中總體描述了基于核酸的臨床試驗。本發明提供ー種制備靶序列片段的方法，其中通過延伸核酸引物制備所述片段。所述靶序列和/或引物為本發明的核酸。所述引物延伸反應可包括核酸擴增(如，PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA 等)。本發明的核酸擴增可以是定量和/或實時擴增。就本發明的某些實施方式而言，核酸長度優選為至少7個核苷酸(如8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300 個核苷酸或更長)。就本發明的某些實施方式而言，核酸長度優選為至多500個核苷酸(如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、
37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15 個核苷酸
或更短)。本發明的引物和探針，以及其它用于雜交的核酸的長度優選為10-30個核苷酸(如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸)。小泡參考文獻42描述了通過敲除mltA(胞壁質溶解性糖基轉移酶)或大腸桿菌Tol-Pal復合物的一種或多種組分(如tolA、tolQ、tolB、pal和/或tolR)從尿路病原性(UPEC)菌株中制備小泡的方法。可以對細菌染色體進行ー個或多個遺傳改變或插入附加型元件(如表達載體)來増加小泡表面保護性抗原的量和/或免疫可及性，從而改進小泡。獲得此類改進的ー種方法是上調本發明多肽的表達。本領域熟知增加靶蛋白表達的多種不同遺傳方案，它們可能分成兩大類ー類依賴對染色體的修飾(如用較強的啟動子替換野生型啟動子、使天然抑制基因失活等)以增加內源性基因的表達，另ー類則基于附加型元件(如高拷貝數質粒、攜帯工程改造的靶基因的載體等)或染色體中整合外源性基因進行的重組表達。這些方法的實施例可以在參考文獻44-50中找到。提高小泡免疫原性和選擇性的另ー種方法是下調免疫優勢非保護性抗原的表達或下調與共生菌株中找到的蛋白同源的蛋白。可以通過對LPS的脂質A部分進行脫毒而獲得進ー步改進。先前描述了相似的改變，以從其它革蘭陰性病原體中產生改進小泡(參見參考文獻51和52)。所有上述方案均可単獨使用或聯用以獲得用于免疫原性組合物的改進小泡。本發明提供一種敲除了 mltA和/或其Tol-Pal復合物的組分和下組中ー種或多種的病原性大腸桿菌(尤其是UPEC) (i)在一種與編碼本發明多肽的基因天然相連的啟動子相比使本發明多肽表達水平升高的啟動子的控制下編碼本發明多肽的染色體基因；(ii)編碼本發明多肽的自主復制的染色體外元件；和/或(iii)相對于野生型LPS減弱大腸桿菌LPS的脂質A部分毒性的遺傳修飾。本發明還提供可通過培育此類細菌獲得的小泡，例如在細菌培養時，釋放入培養 基中的小泡。藥物組合物本發明提供的組合物含有(a)本發明的多肽、抗體、小泡和/或核酸；和(b)藥學上可接受的載體。這些組合物可能適合用作免疫原性組合物，例如，或者用作診斷試劑，或者用作疫苗。本發明的疫苗可以是預防性疫苗或治療性疫苗，但一般是預防性疫苗。
在ー個具體方面，本發明提供包含表達或過表達ー種或多種本發明多肽的ー種或多種外膜泡(OMV)的免疫原性組合物。在ー個具體實施方式
中，本發明提供包含表達或過表達ー種或多種多肽的ー種或多種OMV的免疫原性組合物，所述多肽包含(a)選自SEQ IDNO :22、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598 或 599 的氨基酸序列；(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為來自氨基酸序列(a)的至少10個連續氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%并包含氨基酸序列(a)中至少10個連續氨基酸的片段的氨基酸序列。在另ー實施方式中，所述免疫原性組合物包含含有片段的多肽，所述片段含有選自下組的氨基酸序列的至少ー個 B 細胞表位SEQ ID NO 22、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598 和599。‘藥學上可接受的載體’包括自身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體 的任何載體。合適的載體一般為大的、代謝緩慢的大分子如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚こ醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳塘和脂質聚集體(如油滴或脂質體)。此類載體對本領域技術人員為公知技木。所述疫苗還可包含稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此夕卜，可存在助劑，如濕潤劑或乳化剤、PH緩沖物質等。無菌無熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水是典型的載體。對藥學上可接受賦形劑的詳細討論參見參考文獻296。本發明的組合物可包含抗微生物劑、尤其是以多劑量形式包裝吋。本發明的組合物可包含去污劑，如吐溫(聚山梨醇酷)，例如吐溫80。去污劑的含量通常很低，如< O. 01% O本發明的組合物可包含鈉鹽(如氯化鈉)以提供漲度(tonicity)。NaCl濃度ー般為 10±2mg/ml。本發明的組合物通常包含緩沖液。一般為磷酸鹽緩沖液。本發明的組合物，尤其是當其將被凍干或當它們包含由凍干材料重建獲得的物質時，可包含(如)約15-50mg/ml (如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或ニ糖(如鹿糖或海藻糖)。在凍干前可將用于凍干的組合物的PH調整為約6. I。本發明的多肽可與其它免疫調節劑一起給藥。具體說，組合物通常包含疫苗佐劑。所述佐劑可選自THl佐劑和TH2佐劑中的ー種或多種，下面進行進一歩論述。可用于本發明組合物的佐劑包括，但不限于A.含礦物質的組合物適合用作本發明佐劑的含礦物質的組合物包括無機鹽、如鋁鹽和鈣鹽。本發明包括無機鹽,如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如羥磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如參見參考文獻53的第8和9章]或不同無機化合物的混合物(如磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選地磷酸鹽過量)，該化合物采用任何合適的形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優選吸附于鹽。含礦物質的組合物制成金屬鹽顆粒[54]。典型的磷酸鋁佐劑為無定形羥基磷酸鋁，其P04/A1摩爾比為O. 84-0. 92，包括約O. 6mg Al3Vml0可以采用低劑量磷酸鋁進行吸附，如每劑量每個偶聯物采用50-100 μ gAl3+。當采用磷酸鋁并且不希望使抗原吸附于佐劑時，宜在溶液中包含游離磷酸根離子(如通過采用磷酸鹽緩沖液)。磷酸鋁的零電荷點(PZC)與磷酸基團取代羥基的程度負相關，所述取代程度可能取決于用于以沉淀制備鹽的反應條件和反應物濃度。也可通過改變溶液中游離磷酸根離子的濃度(更多磷酸離子=更偏酸性的PZC)或通過添加緩沖液如組氨酸緩沖液(使得PZC更偏堿性)來改變PZC。本發明采用的磷酸鋁的PZC通常為4. 0-7. O,更優選5. 0-6. 5，如約
5.7。用于制備本發明組合物的鋁鹽懸液可以包含緩沖液(如磷酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液或Tris緩沖液)，但并非必須包含。所述懸液優選為無菌且無熱原的。懸液可以含有游離水相磷酸根離子如其濃度是I. 0-20mM，優選5-15mM，更優選約IOmM的磷酸根離子。所述懸液還可包含氯化鈉。本發明可采用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。此時磷酸鋁比氫氧化鋁多，如重量比為至少2 1，如彡5 I、彡6 I、彡7 I、彡8 I、彡9 I等。本發明疫苗中可含有鋁鹽，使Al3+的劑量為每劑量O. 2-1. Omg0 B.油乳劑適合用作本發明佐劑的油乳劑組合物包括鯊烯-水乳剤，如MF59 (采用微流化機將5%鯊烯、O. 5%吐溫80和O. 5% Span 85制成亞微米顆粒)[參考文獻53的第10章；還參見參考文獻55-57，參考文獻58的第12章]。MF59用作FLUAD 流感病毒三價亞基疫苗的佐劑。所述乳劑宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。用于該組合物中的尤其優選佐劑為亞微米水包油乳劑。本發明采用的優選的亞微米水包油乳劑為鯊烯/水乳劑，任選地包含不同量的MTP-PE，如含有4-5% (重量/體積)鯊烯、O. 25-1. O % (重量/體積)吐溫80 (聚氧こ烯山梨糖醇單油酸酯)、和/或O. 25-1. O %的Span85 (山梨聚糖三油酸酯)以及任選的N-こ酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1, -2, - ニ棕櫚酰基-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-こ胺(MTP-PE)的亞微米水包油乳剤。參考文獻55和59-60中詳細描述了用于組合物的亞微米水包油乳齊U、其制備方法和免疫刺激劑如胞壁酰肽。可以采用鯊烯、生育酚和吐溫80的乳剤。所述乳劑可包含磷酸鹽緩沖鹽水。還可包含Span85 (如I % )和/或卵磷脂。這些乳劑可含有2-10%的鯊烯、2-10%的生育酚和O. 3-3%的吐溫80，并且鯊烯生育酚的重量比優選彡1，以提供更穩定的乳剤。此類乳劑中的ー種可以通過以下方法制備將吐溫80溶于PBS以獲得2%溶液，然后將90ml所述溶液與5g DL-α-生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，然后微流化所述混合物。得到的乳劑可含有(如)平均直徑為100-250nm，優選約180nm的亞微米油滴。可以采用鯊烯、生育酚和Triton去污劑(如Triton X-100)的乳剤。可以采用鯊烯、聚山梨醇80和泊洛沙姆401( “Plur0nicTML121”)的乳剤。可用磷酸鹽緩沖鹽水，PH7.4配制所述乳剤。所述乳劑可用作胞壁酰ニ肽的遞送載體，并與蘇氨酰-MDP—起用于“SAF-1”佐劑[61] (O. 05-1 % Thr_MDP、5 %鯊烯、2. 5 %普朗尼克(Pluronic)L121和O. 2%聚山梨醇80)。它還可以在沒有蘇氨酰-MDP的情況下用作“AF”佐劑[62] (5%鯊烯、I. 25%普朗尼克(Pluronic)L121和O. 2%聚山梨醇80)。優選進行微流化。還可將完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)用作本發明佐劑。C.皂苷制劑[參考文獻53第22章]皂苷制劑也可用作本發明的佐劑。皂苷為留醇糖苷和三萜糖苷的異種組，其發現于廣泛的植物種類的樹皮、葉、莖、根甚至花中。分離自阜樹(Quillaia Saponaria,Molina)樹皮的阜苷作為佐劑已廣泛研究。在商業上，阜苷還可獲自麗花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥阜草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21和脂質制劑如ISCOM。皂苷組合物采用HPLC和RP-HPLC純化。已鑒定出采用這些技術特別純化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B 和 QH-C。優選地，皂苷為 QS21。制備 QS21 的ー種方法示于參考文獻63。皂苷制劑還可包含留醇，如膽固醇[64]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成免疫刺激復合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻53第23章]。ISCOM通常也包含磷脂，如磷脂酰こ醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知皂苷均可用于ISC0M。優選地，ISCOM包含ー種或多種Qui 1A、QHA和QHC。ISCOM在參考文獻64-66中進ー步描述。任選地，ISCOM不含另外的去污劑[67]。
有關皂苷基佐劑的進展的綜述可見參考文獻68和69。D.病毒體或病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發明的佐劑。這些結構通常包含一種或多種來自病毒的蛋白，所述病毒任選結合磷脂或用磷脂配制。它們通常為不致病、不復制且通常不含有任何天然病毒基因組。所述病毒蛋白可由重組方法制備或從完整病毒中分離。這些適用于病毒體或VLP的病毒蛋白包括由如下病毒衍生的蛋白流感病毒(如HA或NA)、こ肝病毒(如核心蛋白或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒(Sindbis)、輪狀病毒、ロ蹄疫病毒、反轉錄病毒、諾沃克病毒(Norwalk)、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA噬菌體、
噬菌體(如外被蛋白)、GA噬菌體、fr噬菌體、AP205噬菌體、和Ty (如反轉錄轉座子Ty蛋白pi)。VLP在參考文獻70-75中進ー步討論。病毒體在參考文獻76中進ー步討論。E.細菌或微生物衍生物適用于本發明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，如腸細菌脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂質A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的非毒性衍生物包括單磷酰脂質A (MPL)和3_0_脫酰化MPL (3dMPL)。3dMPL為帶有4、5或6條酰化鏈的3脫-O-酰化單磷酰脂質A的混合物。優選的“小顆粒”形式的3脫-O-酰化單磷酰脂質A在參考文獻77中公開。此類3dMPL “小顆粒”足夠小，能通過O. 22 μ m膜進行無菌過濾[77]。其它非毒性LPS衍生物包括單磷酰脂質A模擬物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[78、79]。脂質A衍生物包括大腸桿菌來源的脂質A的衍生物，如OMl74。OMl74在參考文獻80和81中進行了描述。適合用作本發明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通過磷酸鍵與鳥嘌呤連接的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯現出免疫刺激性。CpG可包括核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸修飾并可為雙鏈或單鏈。參考文獻82、83和84公開了可能的類似物取代，如用2'-脫氧_7_脫氮鳥苷代替鳥苷。CpG寡核苷酸的佐劑效果在參考文獻85-90中進ー步討論。CpG序列可指向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[91]。CpG序列可特異性誘導Thl免疫應答，如CpG-A 0DN,或可更特異性地誘導B細胞應答，如CpG-BODN。CpG-A和CpG-BODN在參考文獻92-94中討論。優選的CpG為CpG-A ODN0優選地，構建CpG寡核苷酸使5'端能進行受體識別。可選地，兩種CpG寡核苷酸以其V端相連以形成“免疫聚體(immunomers)”。參見例如，參考文獻91和95-97。其它免疫刺激性寡核苷酸包括雙鏈RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。細菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發明的佐劑。優選地，蛋白獲自大腸桿菌(大腸桿菌熱不穩定腸毒素“ LT”)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。采用脫毒ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑在參考文獻98中描述,作為腸道外佐劑在參考文獻99中描述。毒素或類毒素優選為包含A和B亞基的全毒素形式。優選地，A亞基包含脫毒突變；B亞基優選不突變。優選地，佐劑為脫毒LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。采用ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作為佐劑可參見參考文獻 100-107。氨基酸取代的參比數字優選根據參考文獻108中所列的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基的比對得到。式I、II或III化合物或其鹽也可以用作佐劑
I
權利要求
1.一種多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO 577，該多肽用于在患者中產生免疫應答的藥物的制備。
2.如權利要求I所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQID NO 557和選自有助于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接頭、和組氨酸標簽的序列。
3.如權利要求I所述的多肽，其特征在于，所述多肽如SEQID NO 577所示。
4.ー種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權利要求1-3中任一項所述的多肽與藥學上可接受的載體的混合物。
5.ー種藥物組合物，所述藥物組合物包含兩種或多種如權利要求1-3中任一項所述的多肽與藥學上可接受的載體的混合物。
6.如權利要求4或5所述的組合物，還包含免疫佐劑。
7.如權利要求1-3中任一項所述的多肽或者如權利要求4或5所述的藥物組合物在制備用于在患者中產生免疫應答的藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述免疫應答保護個體免受ExPEC感染。
全文摘要
本文公開了可包含在對病原性大腸桿菌(E.Coli)菌株特異性的免疫原性組合物中的各種基因。所述基因來自尿路病原性菌株，但不存在于非病原性菌株中，并且其編碼蛋白的細胞定位使它們可受免疫系統的影響。
文檔編號A61P31/04GK102675432SQ20121010312
公開日2012年9月19日 申請日期2006年2月17日 優先權日2005年2月18日
發明者D·戈麥斯·莫里爾, F·博蘭達斯科薩, L·塞里諾, M·R·豐塔納, M·皮薩 申請人:諾華疫苗和診斷公司