專利名稱：一種流感病毒疫苗的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種應用生物反應器微載體細胞培養生產禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗的方法。可用于工業化生產禽流感病毒以及其它 流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗，替代傳統的雞胚培養法。
背景技術：
目前，國內禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗生 產唯一依靠雞胚法實現。該傳統工藝勞動強度大，耗時長、效率低，生產成本高；容易被環境 污染；雞胚不同批次間的差異大；難以擴大生產；雞胚自身被細菌或其它病毒污染而致生 產的疫苗或有質量隱患；廢胚數量多，無害化處理難度大，涉及生物安全和公共衛生問題。 另外，目前已經有利用生物反應器微載體培養狂犬病疫苗的報道，但尚沒有利用生物反應 器微載體生產禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗的報道。
發明內容
本發明的目的在于克服現有雞胚法技術存在的不足之處，提供一種應用生物反應 器微載體細胞培養生產禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫 苗的方法。該方法可以大量降低生產成本，而且生產周期短，不會受制于原料供應，占用場 地小，易于快速擴大生產規模，環境污染少且易于處理，自動化程度高，用人少，質量易于實 現均衡穩定，顯著提高疫苗產量和質量。為達到上述目的，本發明采取了如下的技術方案一種禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感的流感疫苗的生產 方法，選擇生物反應器作為培養工具；選擇微載體作為細胞貼附生長的載體；選擇MDCK細 胞作為制苗用細胞；包括如下步驟(1)制苗用細胞的傳代與培養取細胞培養瓶中生長良好的MDCK細胞，經 EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培養，培養溫度為 37°C，形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養；(2)制苗用毒種的繁殖將基礎毒種10-4稀釋，尿囊腔接種11日齡SPF雞胚， 0. Iml/枚，置37°C孵化，每天照蛋2 4次，收獲36 96小時死亡雞胚的尿囊液，置_18°C 保存。將此病毒液作為生產種毒.(3)MDCK細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養取步驟(1)中已形成良好單層 的細胞培養瓶上生長良好的MDCK細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細 胞計數后按5 X 105/ml 5 X 106/ml的細胞密度接種于生物反應器中，在生物反應器中加有 微載體，設定培養溫度37°C、PH6. 8-7. 6、溶氧30% -60%、攪拌速度30_60rpm，進行反應器 自動控制、微載體懸浮培養；(4)制苗毒液的繁殖觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數結果達到5X106/ml 5X107ml后進行接毒操作，所接入種毒為步驟(2)中之種毒，接毒前用含有lOug/ml 胰酶的病毒培養液洗滌2-4次。設定培養溫度37 °C、PH6. 8-7. 6、溶氧30% -60%、攪拌速 度30-60rpm，進行反應器自動控制培養，接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡 觀察細胞病變情況；(5)病毒液的收獲待微載體上細胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，將 反應器內液體連同微載體一起收獲，置-20°C反復凍融兩次，然后經離心或過濾去除細胞碎 片，即制得病毒液。病毒液一般于_20°C冷凍保存備用。上述技術方案中，(1)生物反應器為能夠自動控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參 數，適用于微載體懸浮培養的生物反應器，容積為3L-3000L。上述技術方案中，(3)步驟中 的微載體為Cytodex系列微載體 5-10g/L，微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下1)用 PBS浸泡微載體過夜；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十 分鐘，微載體經清洗、滅菌處理后，加入到已滅菌的生物反應器中，用DMEM清洗。上述技術方案中，(1)、(3)步驟中的EDTA-胰酶細胞分散液配方為重量分數分別 是0.25%的胰酶(1 250)、0.02%的EDTA的Hank' s液；細胞生長液的配方為重量分 數分別是90% -98% DMEM液、2% -10%牛血清、加適量的抗菌素，PH為6. 8-7. 6。上述技術方案中，(4)步驟中的種毒接種量為0. 01-0. 5M0I、病毒培養液配方為 不含血清，含有胰酶的DMEM液、加適量的抗菌素，PH為6. 8-7. 6。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)用細胞系代替雞胚組織培養制造禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬 流感，馬流感的流感疫苗，可解決雞胚自身及受外源病毒污染的問題，通過原材料和培養條 件的嚴格控制，保證生產出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性。(2)本發明可以大量降低生產成本，不會受制于原料供應，而且生產周期短，每個 生產周期僅需5-7天，相比現有雞胚培養法的15天以上大大縮短。(3)應用生物反應器進行疫苗生產，具有自動化程度高，用人少，生產工藝簡單穩 定。易操作、產量大占用場地小，易于快速擴大生產規模。質量易于實現均衡穩定。(4)應用本方法生產疫苗，環境污染少且易于處理。而現有的雞胚生產法會產生的 大量廢胚等廢物，且處理難度大，涉及生物安全和公共衛生問題。本方法同時也適用于生產其他流感病毒如豬流感、犬流感、馬流感等。
圖1為本發明的制備流程圖。
具體實施例方式以下結合說明書附圖及具體實施例來對本發明作進一步的描述。實施例一一種禽流感疫苗的生產方法，包括如下步驟(1)制苗用細胞的傳代與培養取MDCK細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液(含0. 25% 胰酶(1 250)、0. 02% EDTA的Hank' s液)消化傳代，以含90% DMEM液、10%牛血清、各200單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，PH調整為7. 4的細胞生長液繼續培養，培養溫 度為37°C，形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培 養，其中生物反應器為能夠自動控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參數，適用于微載體懸浮培 養的生物反應器；(2)制苗用毒種的繁殖將禽流感(H9亞型)基礎毒種10-4稀釋，尿囊腔接種11 日齡SPF雞胚，0. Iml/枚，置37°C孵化，每天照蛋2 4次，收獲36 96小時死亡雞胚的 尿囊液，置-18°C保存。將此病毒液作為生產種毒.(3)MDCK細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養取步驟(1)培養好的MDCK細 胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數后接種于生物反應器中，在生 物反應器中加有微載體，設定培養溫度37°C、PH7. 4、溶氧50%、攪拌速度60rpm，進行反應 器自動控制培養，其中生物反應器容積為75L ；微載體為Cytodex系列微載體，微載體在使 用前，需清洗、滅菌，具體步驟為1)稱量Cytodexl微載體500g、使用20LPBS液浸泡過夜； 2)用IOLPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘；(4)制苗毒液的繁殖培養后第三日觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數結 果為9. 6X 106/ml后進行接毒操作，接毒前用含有lOug/ml胰酶的病毒培養液洗滌4次。接 種量為0. IMOI，設定培養溫度37°C、PH7. 4、溶氧50%、攪拌速度60rpm，進行反應器自動控 制培養，接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況；(5)病毒液的收獲待微載體上細胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，將反 應器內液體連同微載體一起收獲，置-20°C反復凍融兩次，然后經過濾去除細胞碎片，即制 得病毒液。病毒液于_20°C冷凍保存備用。上述技術方案中，(4)步驟中病毒培養時，使用的病毒培養液配方為不含血清， 含有胰酶的DMEM液、加各200單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，PH為7. 4。實施例二一種豬流感疫苗的生產方法，包括如下步驟(1)制苗用細胞的傳代與培養取MDCK細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液(含質量 體積分數為0. 25%胰酶(1 250)和0. 02% EDTA的Hank' s液)消化傳代，以含重量分 數95% DMEM液、5%牛血清、各250單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，PH調整為7. 3的細 胞生長液繼續培養，培養溫度為37°C，形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反 應器中進行微載體懸浮培養，其中生物反應器為能夠自動控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等 參數，適用于微載體懸浮培養的生物反應器；(2)制苗用毒種的繁殖將禽流感(H9亞型)基礎毒種10-4稀釋，尿囊腔接種11 日齡SPF雞胚，0. Iml/枚，置37°C孵化，每天照蛋2 4次，收獲36 96小時死亡雞胚的 尿囊液，置-18°C保存。將此病毒液作為生產種毒.(3)MDCK細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養取步驟(1)培養好的MDCK細 胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數后接種于生物反應器中，在生 物反應器中加有微載體，設定培養溫度37°C、PH7. 3、溶氧45%、攪拌速度50rpm，進行反應 器自動控制培養，其中生物反應器容積為75L ；微載體為Cytodex系列微載體，微載體在使 用前，需清洗、滅菌，具體步驟為1)稱量Cytodexl微載體500g、使用20LPBS液浸泡過夜；2)用IOLPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘；(4)制苗毒液的繁殖培養后第三日觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數結果為2X 107ml后進行接毒操作，接毒前用含有lOug/ml胰酶的病毒培養液洗滌4次。接 種量為0. IMOI，設定培養溫度37°C、PH7. 3、溶氧45%、攪拌速度50rpm，進行反應器自動控 制培養，接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況；(5)病毒液的收獲待微載體上細胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，將反 應器內液體連同微載體一起收獲，置-20°C反復凍融兩次，然后經過濾去除細胞碎片，即制 得病毒液。病毒液于-20°C冷凍保存備用。上述技術方案中，(4)步驟中病毒培養時，使用的病毒培養液配方為不含血清， 含有胰酶的DMEM液、加各200單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，PH為7. 4。半成品檢驗及制苗、成品檢驗1.血凝價及毒價的測定將以上收獲的細胞病毒液混合后取樣，測定血凝價及毒 價。血凝價彡81og2，病毒含量彡108ELD50/0. 1ml。滅活按總量的0. 2%向病毒液中加入甲醛溶液，振搖2分鐘，置37°C條件滅活30 小時。期間定時振搖。2.半成品檢驗無菌檢驗按《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》附錄301頁進行，無菌生長。滅活檢驗滅活后，無菌從每瓶病毒滅活液中取樣，經尿囊腔途徑接種10日齡SPF 雞胚5枚，0. Iml/胚，37°C孵化，每天照蛋，120小時內應無死亡，若有死亡，尿囊液應無血凝 價。3.油佐劑滅活疫苗的配制油相制備按注射用白油(見《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》附錄343 頁)96份、司本-804份和硬脂酸鋁2份的比例配制油相。取硬脂酸鋁，用少量注射用白油混合，加熱融化至半透明狀，再與全量司本-80及 剩余注射用白油混合均勻，經121°C滅菌15分鐘，冷卻至室溫，備用。水相制備取經檢驗合格的H9亞型禽流感病毒滅活液，按病毒液的4%加入吐 溫-80乳化1分鐘。滅活疫苗的制備按水相和油相為1 3(體積比)比例進行乳化，lOOOOr/min乳 化3 5分鐘。4.成品檢驗4. 1 性狀外觀為白色乳狀液。劑型呈油包水型。穩定性在37°C保存21日或以3000r/min離心15分鐘，未破乳。粘度用Iml潔凈吸管(上口內徑2. 7mm、下口內徑1.2mm)，吸取25°C左右的疫苗 Iml，令其垂直自然流出，記錄流出0. 4ml所需時間，在8秒以內。4. 2無菌檢驗按《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》附錄301頁進行，無菌生長。4. 3安全檢驗用3 5周齡非免疫鴨、雞(應無抗H9亞型禽流感HI抗體或低于22)各10只，皮下、肌肉注射疫苗2羽份(0.6ml)，觀察14日。全部存活，且無因疫苗注射 引起的全身反應和嚴重的局部反應。4. 4效力檢驗用3 5周齡非免疫鴨、雞(應無抗H9亞型禽流感血凝抑制抗體或低于22)各10只，皮下、肌肉注射疫苗0. 3ml，另取條件相同的鴨、雞各10只，不接種，作 為對照。21日后，采免疫及對照組雞、鴨血樣并測定血清HI抗體，免疫雞應有>90%只數 HI抗體彡61og2，免疫鴨應有彡80%只數HI抗體彡21og2，對照組均應為0。4. 5甲醛含量測定分別按《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》附錄311頁進行。符合規定。
權利要求
一種流感病毒疫苗的生產方法，其特征在于選擇生物反應器作為培養工具；選擇微載體作為細胞貼附生長的載體；選擇MDCK細胞作為制苗用細胞；并包括如下步驟(1)制苗用細胞的傳代與培養取細胞培養瓶中生長良好的MDCK細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培養，培養溫度為37℃，形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養；(2)制苗用毒種的繁殖將基礎毒種10-4稀釋，尿囊腔接種11日齡SPF雞胚，0.1ml/枚，置37℃孵化，每天照蛋2-4次，收獲36～96小時死亡雞胚的尿囊液，置-18℃保存。將此病毒液作為生產種毒。(3)MDCK細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養取步驟(1)中已形成良好單層的細胞培養瓶上生長良好的MDCK細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按5×105/ml～5×106/ml的細胞密度接種于生物反應器中，在生物反應器中加有微載體，設定培養溫度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、攪拌速度30-60rpm，進行反應器自動控制、微載體懸浮培養；(4)制苗毒液的繁殖觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數結果達到5×106/ml～5×107/ml后進行接毒操作，所接入種毒為步驟(2)中之生產種毒，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培養液洗滌2-4次。設定培養溫度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、攪拌速度30-60rpm，進行反應器自動控制培養，接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況；(5)病毒液的收獲待微載體上細胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，將反應器內液體連同微載體一起收獲，置-20℃反復凍融兩次，然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片，即制得病毒液。
2.根據權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的生物反應器為能 夠自動控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參數，適用于微載體懸浮培養的生物反應器，容積為 3L-3000L。
3.根據權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的微載體為Cytodex 系列微載體。
4.根據權利要求3所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的微載體在使用前 需清洗、滅菌，方法如下1)用PBS浸泡微載體過夜；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS 浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘，微載體經清洗、滅菌處理后，加入到已滅菌的生物反 應器中，用DMEM清洗。
5.根據權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的EDTA-胰酶細胞 分散液配方為質量體積濃度分別是0. 25%的規格為1 250的胰酶、0. 02%的EDTA的 Hank' s 液。
6.根據權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的細胞生長液的 配方為重量分數分別是90% -98% DMEM液、2% -10%牛血清，在細胞生長液中另加入各 100-500單位/ml的抗菌素，PH為6. 8-7. 6。
7.根據權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的步驟(4)中的病毒培養液為含有胰酶的DMEM液，并在DMEM液中加入各100-500單位/ml的抗菌素，PH為 6. 8-7. 6。
8.根據權利要求6或7所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的抗菌素為青 霉素鈉和硫酸鏈霉素的混合物。
9.根據權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的步驟(4)中的種 毒接種量為0. 01-0. 5MOI。
10.根據權利要求1所述的流感疫苗的生產方法，其特征在于所述的流感疫苗包括禽 流感、豬流感、犬流感、馬流感疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種禽流感病毒以及其它流感病毒如豬流感，犬流感，馬流感疫苗的生產方法，包括如下步驟(1)制苗用細胞的傳代與培養；(2)制苗用毒種的繁殖；(3)MDCK細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養；(4)制苗毒液的繁殖；(5)病毒液的收獲。本發明可以大量降低生產成本，而且生產周期短，不會受制于原料供應，占用場地小，易于快速擴大生產規模，環境污染少且易于處理，自動化程度高，用人少，質量易于實現均衡穩定，顯著提高疫苗產量和質量。
文檔編號C12N7/00GK101818131SQ20101010378
公開日2010年9月1日 申請日期2010年2月1日 優先權日2010年2月1日
發明者嚴成, 劉玉才, 徐志春, 王立斌, 胡來根, 高鵬 申請人:成都天邦生物制品有限公司