專利名稱：提取木本紅樹植物的總rna的方法及其專用提取液的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種提取木本紅樹植物的總RNA的方法及其專用提取液。
背景技術：
紅樹林(Mangrove)是熱帶海岸潮間的木本植物群落，是一種熱帶、南亞熱帶特有 的海岸帶植物群落，因主要由紅樹科的植物組成而得名。紅樹是濕地的特色植物，全球共有 61個品種包括紅樹科的秋茄(Kadelia candel)和紅海欖(Rhizophora stylosa)，使君子 ^4^1 ^ (Lumnitzera racemosa)等。具有海陸邊緣生態系統的特有特點，是珍貴的物種資源。隨著現代江河流域工 農業的迅猛發展，沿海城市人口與經濟的快速增長，人為干擾使河口海灣區的環境污染日 趨嚴重。紅樹林作為一種海岸潮間帶森林生態系統.對海灣河口區域的污染具有較高承 載力和耐受性(李裕紅，章幼玉.重金屬污染對紅樹植物影響的研究綜述與展望.海峽 科學.2007,6 140 142.)。目前，國內外關于紅樹植物對重金屬、有機污染物等的抗性 研究主要集中于紅樹植物對污染物的富集以及生長、形態和生理學方面(鄭文教，王文 卿，林鵬.九龍江口桐花樹紅樹林對重金屬的吸收與累積.應用與環境生物字報.1996， 20:20 213.；鄭逢中，林鵬，鄭文教.紅樹植物秋茄幼苗對鎘耐性的研究L丌.生態學 報.199414 (4) :408 414.；覃光球，嚴重玲，韋莉莉.秋茄幼苗葉片單寧、可溶性糖和脯 氨酸含量Cd脅迫的響應.生態學報.2006，沈(10) :3366 3371.；吳桂容，嚴重玲.鎘對 桐花樹幼苗生長及滲透調節的影響.生態環境.2006，15 (5) :1003 1008. ；Ravikumar S, WilliamsG P, Shanthy S, et al. Efect of heavy metals(Hg and Zn)on the growth andphosphate solubilising activity in halophilic phosphobaeteria isolated fromManakudi mangrove. Journal of environmental Biology,2007,28(1) :109 114·)。隨著現代分子生物學的發展及其向各個學科的滲透，人們越來越認識到紅樹林這 一獨特珍貴資源的重要性，越來越多的分子水平技術被應用于紅樹植物的研究。如采用等 位酶、限制性內切酶片斷長度多態性等手段研究紅樹植物種群的遺傳變異和生態分化問 題(潘文，周涵韜，陳攀，等.木欖屬3種紅樹植物的遺傳變異和親緣關系分析.海洋科 學.2005, (5) :23 觀.；黎中寶，林鵬.我國不同緯度白骨壤種群遺傳多樣性和遺傳分 化的研究.海洋學報.2002，M(1) :142 147.)。但到目前為止，關于紅樹植物抗污染脅 迫的分子機理方面的研究還極少有報道。在分子水平探討紅樹植物對重金屬具較高耐受性 的分子生態機理，鑒定紅樹植物中高效的重金屬結合物質及其調控基因，可以為可持續利 用紅樹林資源提供了更多的依據，對保護沿海及海洋生態系統具有重要的意義。獲得高質量的RNA是進行分子生物學研究的必要前提。紅樹植物富含單寧和多 糖，普通的RNA提取方法(如鹽酸胍法和TRIZOL法等)無法去除干擾，得不到高純度的RNA。單寧也稱植物多酚或鞣質。紅樹植物的單寧含量比較高，大多數紅樹植物的單寧 含量通常在10% 30% (林鵬、傅勤.中國紅樹林環境生態及經濟利用.北京高等教育 出版社，1994:61 71.；林益明，向平，林鵬.紅樹林單寧的研究進展.海洋科學，2005，
329(3) :59 63.)。紅樹植物的單寧種類也比較多，Hsu等(王宗訓.中國資源植物利用手 冊[M].北京中國科學技術出版社，1989.)對秋茄中的縮合單寧進行了結構的研究，結果 不僅發現有原天竺葵定(propelargonidin) 二聚物、原花青定(procyanidin)三聚物這些 與其他物種共有的原花色素(縮合單寧)，還發現了 2種新的原花色素二聚物(秋茄素A-1、 A-2)和4個三聚物(秋茄素Β-1、Β-2、Β-3、Β-4)。單寧對紅樹植物的重要性表現在其所處 的特殊的物理環境、化學環境和生物環境等各方面都有生態適應意義，如依賴單寧的聚鹽 性是紅樹植物適應高鹽度環境的最重要的機制(Hsu F L，Ncmaka G I,Nishioka I. Tannins andrelated compounds. XXXI. Isolation and characterization ofproanthocyanidins in Kandelia candel(L)[J], Druce Chem Pharm Bull,1985,33(3) :142 3152. ；Lin P,Fu Q. Environmental Ecology and EconomicUtilization of Mangroves in China[R]. China Higher Education Press Beijingand Springer-Verlag Berlin Heidelberg,2000.)。但 是，種類繁多、含量較高的單寧化合物卻是紅樹植物RNA的提取困難的重要原因之一。單 寧化合物極易氧化，被氧化的單寧化臺物(如醌類)能與RNA穩定地結合，導致RNA活性 喪失，在用苯酚、氯仿抽提時會導致RNA的丟失，或形成不溶性復合物(khneiderbauer A, Sandermann H, Ernst D. Isolation of functional RNA from plant tissue richin phenolic compounds. Analytical Biochemistry. 1991,197 (1) :91 95.)。普通的方法 (TRIZOL和硫酸胍法)無法提取紅樹植物的RNA，在提取過程中，強變性劑使紅樹植物細胞 破裂后釋放出大量的單寧化合物，在酸性pH(pH4-6)條件下極易氧化使勻漿被變為褐色。
多糖的去除是RNA提取過程中另一個關鍵問題。多糖具有與RNA非常相似的理化 性質，很難將其與RNA分開。因此對多糖的處理不當，會導致RNA的提取出現兩種后果，影響 進一步的生物學實驗。第一，去除多糖的同時大量的RNA也被除去，使得RNA的產量受到影 響；第二，未能完全的去除RNA中的多糖，形成難溶于水的沉淀，或者溶解后為粘稠狀溶液。
發明內容
本發明的目的是提供一種提取木本紅樹植物的總RNA的方法及其專用提取液。本發明提供的RNA提取緩沖液由1Tris-HCl、EDTA、NaCUSDS, DTT、β -巰基乙醇 和水組成；Tris-HCl 的終濃度為 75-125mmol 'T1jEDTA 的終濃度為 400-600mmol 'T1jNaCl 的終濃度為400-600mmol · Γ1, SDS的終濃度為(質量百分含量)，DTT的終濃度為 3-8mmol · L—1，β -巰基乙醇的終濃度為(質量百分含量)；ρΗ為8_9。所述RNA提取緩沖液具體可為=Tris-HCl的終濃度為IOOmmol · L—1，EDTA的終濃 度為500mmol · L—1，NaCl的終濃度為500mmol · L—1，SDS的終濃度為2% (質量百分含量)， DTT的終濃度為5mmol · L—1，β -巰基乙醇的終濃度為1. 5% (體積百分含量)；ρΗ為8. 5。所述RNA提取緩沖液在提取木本紅樹植物的總RNA中的應用也屬于本發明的保護 范圍。所述木本紅樹植物可為紅樹科(Rhizophoraceae)植物或使君子科 (Combretaceae)植物。所述紅樹科植物具體可為秋茄(Kadelia candel)、紅海欖 (Rhizophora stylosa)等。所述使君子科植物具體可為欖李(Lumnitzera racemosa)等。本發明還保護一種提取木本紅樹植物的總RNA的方法，包括如下步驟(1)植物葉片加入PVP (聚乙烯吡咯烷酮)進行液氮研磨，得到粉末，用所述的RNA提取緩沖液進行提取，然后離心取上清；(2)加入NaCl水溶液混勻，再加入三氯甲烷混勻，離心取上層溶液；(3)加入NaCl水溶液混勻，再加入三氯甲烷混勻，離心取上層溶液；(4)加入2-丁氧乙醇，離心取上清；(5)加入 LiCl，沉淀 RNA ；(6)用乙醇水溶液洗滌。所述步驟中，2-丁氧乙醇的體積具體可為步驟C3)得到的上層溶液的體積的 1/4。所述步驟(5)中，所述LiCl以IOmol -L"1 LiCl水溶液的形式加入，加入體積為步 驟(4)得到的上清的體積的1/4。所述植物葉片、所述PVP、所述RNA提取緩沖液、所述步驟O)中的NaCl水溶液、 所述步驟O)中的三氯甲烷、所述步驟(3)中的NaCl水溶液和所述步驟(3)中的三氯甲 烷的配比具體如下0. 2g植物葉片0. 002-0. 004g PVP 0. 5mlRNA提取緩沖液:0. Iml 5mol 'T1NaCl水溶液0. 3ml三氯甲烷0. Iml 5mol 'T1NaCl水溶液0. 3ml三氯甲烷。所述木本紅樹植物可為紅樹科(Rhizophoraceae)植物或使君子科 (Combretaceae)植物。所述紅樹科植物具體可為秋茄(Kadelia candel)、紅海欖 (Rhizophora stylosa)等。所述使君子科植物具體可為欖李(Lumnitzera racemosa)等。所述PVP具體可為分子量為40，000的PVP。本發明的方法的主要優點在于選用堿性提取緩沖液(pH = 8. 5左右)，一定程度 上防止了單寧化合物的氧化；在提取過程中加入PVP，PVP中的CO-N=對酚類化合物具有較 強的結合能力，可以螯合一部分酚類化合物；由于堿性條件的提取緩沖液會減弱PVP的螯 合作用，為了防止單寧化合物影響RNA的提取，在緩沖液中加入了 DTT(還原劑)和β-巰基 乙醇，有效地防止了單寧類物質的氧化；采用LiCl沉淀RNA，LiCl可以選擇性的沉淀RNA， 能夠獲得比較純凈的RNA ；由于紅樹植物的特殊性，單純的LiCl沉淀也不能完全去除多糖 的干擾，為了解決這個問題，在沉淀RNA之前采用20% 2- 丁氧乙醇先去除一部分多糖，由 于RNA、多酚和多糖在2- 丁氧乙醇中的溶解度不同，這樣不僅去除了多余的多糖，同時也去 除掉了在溶液中殘留的酚類物質。采用本發明的方法提取出來的RNA，可以直接用于合成 cDNA，進行建庫、分子克隆、RACE等分子生物學操作。
圖1為總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；1 =TRIZOL提取的秋茄葉片RNA ；2 本發明的 方法提取的秋茄葉片RNA ；3 本發明的方法提取的紅海欖葉片RNA ；4 本發明的方法提取 的欖李葉片RNA。圖2為cDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；1 =TRIZOL提取的秋茄葉片RNA合成cDNA ；2 本發明的方法提取的秋茄葉片RNA合成cDNA ；3 本發明的方法提取的紅海欖葉片RNA合成 cDNA ；4 本發明的方法提取的欖李葉片RNA合成cDNA。圖 3 為目的基因 PCR 擴增結果；M :Trans2K Plus DNA Marker ；1 :PCR 產物。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。用于實施例的植物秋茄(Kadelia candel)、紅海欖(Rhizophora stylosa)、欖李 (Lumnitzera racemosa)，均由何振艷于2008年3月采自于福建省廈門市隕笪湖，移栽于中 國科學院植物研究所溫室培養。TRIZOL 購于 Invitrogen 公司；TransScript II Reverse Transcriptase KID 購于TRANS公司；DEPC、異硫氰酸胍、PVP等購自上海生工；Dnase I、Rase抑制劑、TaKaRa 3，-Full RACE Core Set Ver. 2. O Kit、TaKaRa 5，-Full RACE Kit 等購自大連寶生生物 公司；無Rase塑料管和槍頭購于hvitrogen公司。用于RNA提取的研缽、藥匙、鑷子、試劑 瓶等均在240°C條件干熱滅菌濁以上。實施例1、采用本發明的方法提取植物總RNA一、采用本發明的方法提取RNA提取緩沖液由Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT、β -巰基乙醇和水組成；Tris-HCl 的終濃度為IOOmmol · Λ EDTA的終濃度為500mmol · Λ NaCl的終濃度為500mmol · Λ SDS的終濃度為2% (質量百分含量)，DTT的終濃度為5mmol · β -巰基乙醇的終濃度為 1.5% (體積百分含量)；ρΗ為8. 5。取0. 5ml提取緩沖液裝在1. 5ml離心管中65°C預熱。分別提取秋茄(Kadeliacandel)、紅海欖(Rhizophora stylosa)和欖李 (Lumnitzera racemosa)的 RNA,方法如下1、將0. 2g幼嫩葉片置于液氮中，加入PVP(分子量40，000) (PVP的加入量為葉片 質量的1-2% )研磨至粉末，迅速轉移至提取液中，劇烈震蕩離心管，將其混勻；2、室溫平放 5min，4°C、12000g 離心 lOmin，取上清；3、加入0. Iml 5mol · L—1 NaCl水溶液充分混勻，加入0. 3ml三氯甲烷漩渦震蕩 2min，充分混勻，4°C、12000g離心IOmin ；此時，溶液分為兩層，取上層溶液；4、加入0. Iml 5mol · L—1 NaCl水溶液充分混勻；加入0. 3ml三氯甲烷，充分混勻， 4°C、12000g離心lOmin，取上層溶液；5、加入1/4體積的2- 丁氧乙醇，室溫放置20min，4°C、12000g離心lOmin，取上清；6、加入1/4體積的IOmol · L-1 LiCl水溶液，混勻，_20°C過夜；7、4°C、12000g 離心 15min，取沉淀；8、用Iml 75% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌1_2次，晾干；9、取30 μ 1 DEPC水溶解沉淀。二、硫氰酸胍一步法(對照甲)提取總RNA參考《分子克隆實驗指南》的方法(Sambrook J，Fritsch EF, Maniatis Y著(金 冬雁，黎孟楓等譯)(1992)分子克隆實驗指南(第2版).科學出版社.北京，352 355.) 提取秋茄(Kadelia candel)幼嫩葉片的總RNA。材料研磨后，加入提取液，待細胞裂解，溶 液呈棕色，并伴有粘稠物在液體的表面，說明單寧類化合物已經被氧化，且糖類物質已經被 釋放出來，導致實驗無法繼續進行。三、TRIZOL法(對照乙)提取總RNA
用試劑盒提取秋茄(Kadelia candel)幼嫩葉片的總RNA。TRIZOL總RNA提取試 劑盒購于^vitrogen公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。材料研磨后，加入提取液，待細胞 裂解，溶液呈棕色，并伴有粘稠物在液體的表面，說明單寧類化合物已經被氧化，且糖類物 質已經被釋放出來，導致實驗無法繼續進行。四、RNA質量檢測1、用紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度取Ιμ RNA溶液至無RNA酶的PCR管，用DEPC水稀釋100倍，檢測在紫外光沈Onm 和^onm的吸光值，結果見表1。表1紅樹植物RNA含量的檢測
od260od280od260/od280對照乙0. 02210. 02131. 0375秋茄0. 15530. 08151. 9055欖李0.15470. 08051. 9217紅海欖0. 03390. 01811.8729從表中的數據可以看出，三種紅樹的RNA的0D26Q/0D28Q均在1. 8-2. 0之間，進一步 驗證了 RNA具有較好的完整性。2、電泳檢測RNA的完整性用1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA (見圖1)。由圖1可見，采用本發明的方法提取的RNA，出現3條條帶Q8S、18S、5. 8S)。其中 28S比18S條帶亮，亮度大概在2倍左右，說明RNA完整性較好。3、cDNA 的合成采用 TRANS 公司的 iTransScript II Reverse Transcriptase KID 提供的方法用 RNA合成 cDNA。按照 TransScript II Reverse Transcriptase KID 提供方法嚴格操作。結 果見圖2。由圖2可見，改良方法RNA合成得cDNA在0. l-2kb,而TRIZOL方法獲得的RNA 合成的cDNA均在11Λ以下，說明改良法提取得RNA質量較高，有較高的轉錄活性，普通的 TRIZOL方法提取的RNA質量不能滿足以后的實驗要求4、KcCAS (Kadelia candel Cycloartenol Synthase)基因克隆以步驟2合成的秋茄cDNA為模板，根據KcCAS基因(GENBANK ACCESSION NUMBERAB292609)設計引物(5' -ATGTGGCGGCTCAAGATTGC-3‘； 5’ -CAAGAAGCCTGCAACACCC-3’)，PCR克隆KcCAS基因。PCR產物的電泳結果見圖3，克隆到 了 2277bp的DNA片段。PCR產物的測序結果見序列表的序列1，所獲得的DNA片段即KcCAS 基因。該實驗進一步證明了通過本發明的方法提取的RNA質量高，可以用于分子克隆操作。序列表<110>中國科學院植物研究所<120>提取木本紅樹植物的總RNA的方法及其專用提取液
<130>CGGNARY102071
<160>1
<210>1
<211>2277
<212>DNA
〈213〉秋茄(Kadelia candel)
<400>1
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attttccctatctgggcactgggagaataccgatgccggg tgttgcaggcttcttga227權利要求
1.一種RNA提取緩沖液由Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT、β -巰基乙醇和水組成； Tris-HCl 的終濃度為 75-125mmol ·Ι^，EDTA 的終濃度為 400-600mmol 'L^1jNaCl 的終濃度為 400-600mmol · L-1，SDS的終濃度為1-3% (質量百分含量)，DTT的終濃度為3-8mmol · L-1， β-巰基乙醇的終濃度為1-3% (質量百分含量)；ρΗ為8-9。
2.如權利要求1所述的RNA提取緩沖液，其特征在于Tris-HCl的終濃度為 IOOmmol · Λ EDTA的終濃度為500mmol · Λ NaCl的終濃度為500mmol · Λ SDS的終濃度 為2% (質量百分含量)，DTT的終濃度為5mmol · L—1，β -巰基乙醇的終濃度為1. 5% (體 積百分含量)；ρΗ*8.5。
3.權利要求1或2所述RNA提取緩沖液在提取木本紅樹植物的總RNA中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述木本紅樹植物為紅樹科 (Rhizophoraceae)植物或使君子科(Combretaceae)植物；所述紅樹科植物為秋 茄(Kadeliacandel)或紅海欖(Rhizophora stylosa)；所述使君子科植物為欖李 (Lumnitzera racemosa)。
5.一種提取木本紅樹植物的總RNA的方法，包括如下步驟(1)植物葉片加入PVP進行液氮研磨，得到粉末，用權利要求1或2所述的RNA提取緩 沖液進行提取，然后離心取上清；(2)加入NaCl水溶液混勻，再加入三氯甲烷混勻，離心取上層溶液；(3)加入NaCl水溶液混勻，再加入三氯甲烷混勻，離心取上層溶液；(4)加入2-丁氧乙醇，離心取上清；(5)加入LiCl，沉淀RNA；(6)用乙醇水溶液洗滌。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟(4)中，2-丁氧乙醇的體積為步驟 (3)得到的上層溶液的體積的1/4。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步驟(5)中，所述LiCl以 IOmol · L-1LiCl水溶液的形式加入，加入體積為步驟(4)得到的上清的體積的1/4。
8.如權利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于所述植物葉片、所述PVP、 所述RNA提取緩沖液、所述步驟中的NaCl水溶液、所述步驟中的三氯甲烷、所 述步驟(3)中的NaCl水溶液和所述步驟(3)中的三氯甲烷的配比如下0. 2g植物葉 片0. 002-0. 004g PVP 0. 5mlRNA 提取緩沖液0. Iml 5mol · L^1NaCl 水溶液0. 3ml 三氯甲烷0. Iml 5mol · L^1NaCl水溶液0. 3ml三氯甲烷；所述PVP為分子量為40，000 的 PVP。
9.如權利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于所述木本紅樹植物為紅樹科 (Rhizophoraceae)植物或使君子科(Combretaceae)植物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述紅樹科植物為秋茄(Kadeliacandel) 或紅海欖(Rhizophora stylosa)；所述使君子科植物為欖李(Lumnitzeraracemosa)。
全文摘要
本發明公開了一種提取木本紅樹植物的總RNA的方法及其專用提取液。本發明提供的提取液由Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT、β-巰基乙醇和水組成；Tris-HCl的終濃度為75-125mmol·L-1，EDTA的終濃度為400-600mmol·L-1，NaCl的終濃度為400-600mmol·L-1，SDS的終濃度為1-3％(質量百分含量)，DTT的終濃度為3-8mmol·L-1，β-巰基乙醇的終濃度為1-3％(質量百分含量)；pH為8-9。本發明提供的方法是使用所述提取液提取木本紅樹植物的總RNA。采用本發明的方法提取出來的RNA，可以直接用于合成cDNA，進行建庫、分子克隆等分子生物學操作。
文檔編號C12N15/10GK102140447SQ201010103768
公開日2011年8月3日 申請日期2010年1月29日 優先權日2010年1月29日
發明者何振艷, 陳宏林, 麻密 申請人:中國科學院植物研究所