豬流行性腹瀉病毒的生產方法

專利名稱：豬流行性腹瀉病毒的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種應用生物反應器微載體細胞培養技術生產疫苗的方法，可用于工
業化生產豬流行腹瀉疫苗，替代傳統的轉瓶培養法生產工藝。
背景技術：
目前，國內豬流行性腹瀉疫苗生產唯一依靠細胞轉瓶培養法實現。該傳統工藝勞 動強度大，耗時長、效率低，生產成本高；容易被環境污染；不同生產批次間或同一生產批 次不同瓶間的差異大；難以擴大生產；容易出現被細菌或其它病毒污染而致的疫苗質量隱 患，涉及生物安全和公共衛生問題。

發明內容
本發明的目的在于克服現有細胞轉瓶培養法技術存在的不足之處，提供一種應用 生物反應器微載體細胞培養高效生產豬流行性腹瀉疫苗的方法。該方法可以大量降低生產 成本，而且生產周期短，占用場地小，易于快速擴大生產規模，環境污染少且易于處理，自動 化程度高，用人少，質量易于實現均衡穩定。可顯著提高豬流行性腹瀉病毒的單位效價以及 疫苗產量和質量。 為達到上述目的，本發明采取了如下的技術方案
—種豬流行性腹瀉病毒的生產方法，包括如下步驟 (1)制苗用細胞的傳代與培養取VER0細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代， 以"細胞生長液"培養，培養溫度為35_38°C ;形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于 生物反應器中進行微載體懸浮培養； (2)細胞毒種的繁殖用"病毒培養液"將豬流行腹瀉病毒種毒按0. 5-5%比例 接種到步驟(1)形成的良好細胞單層繼續培養，至細胞50-100%以上病變時收獲病毒液； 再將此病毒液作為種毒，在細胞上進行細胞適應性連續傳代復壯，每次傳代產物進行病毒 TCID5。和無菌檢測，傳至病毒TCID5。穩定且達到107°TCID5。/mL以上時停止復壯，作為生產 種子； (3)VER0細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養生物反應器按總體積的 30% -80%加入無菌"細胞生長液"，且每升無菌細胞生長液中按3-108/1濃度加入微載 體，啟動生物反應器，低轉速攪拌30分鐘后，取步驟(1)轉瓶上生長良好的VERO細胞，經 EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按按1 3X 105個/mL的密度接 種到反應器中，設定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量等培養參數，進行反應器自動控制 培養。 (4)制苗毒液的繁殖待觀察微載體上細胞長滿80% _90%，空球率低于5%，，滿 球率大于80 % ，細胞狀態良好，且細胞計數結果達到3 5 X 106個/mL以上進行接毒操作， 按O. 5-5%比例接入步驟(2)制備好的豬流行性腹瀉病毒種毒，設定適合的溫度、PH、攪拌 速度、溶氧含量等培養參數，進行反應器自動控制培養；按0. 1_5%的比例接入豬流行腹瀉病毒種毒毒液，接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，并檢 測樣品的TCID5。；待觀察微載體上細胞基本全部脫落，且D0值呈明顯上升趨勢，停止反應器 攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，收獲上清液和微載體； (5)收獲病毒液的處理病毒液和微載體經2-3次凍融后，離心或過濾去除細胞碎 片后-2(TC冷凍保存備用。 上述技術方案中，生物反應器為能夠自動控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參數，適 用于微載體懸浮培養的生物反應器，容積為3L-3000L。 上述技術方案中，微載體為Cytodex系列微載體，微載體在使用前需清洗、滅菌， 方法如下1)用PBS浸泡微載體三小時以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微
載體，12rc蒸汽滅菌三十分鐘。 上述技術方案中，"EDTA-胰酶細胞分散液"配方為質量分數分別是O. 25%的胰 酶(1 : 250) 、0. 02%的EDTA的Hank' s液； 上述技術方案中，"細胞生長液"的配方為質量分數分別是90% -98% DMEM液、 2% _10%牛血清、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，PH為6. 8_7. 6。
上述技術方案中，種毒接種量為0. 5-5%， 上述技術方案中，"病毒培養液"配方為含血清l-4X的DMEM液、終濃度為 100-200IU/mL的抗菌素，PH調整為7. 2_7. 4。 上述技術方案中，生物反應器設定參數為培養溫度培養溫度33-38 °C、 PH6. 5-7. 68、溶氧30% _70%、攪拌速度30-80rpm。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果 (1)用生物反應器微載體細胞培養技術代替轉瓶細胞培養技術制造豬流行性腹瀉 疫苗，可解決生產效率低、產品質量不穩定、病毒效價低的問題，通過生產技術和生產工藝 的改變，提高病毒單位培養效價10-30倍，全面提升疫苗質量和產量，提高疫苗的安全性。
(2)本發明可以大量降低生產成本，而且生產周期短，每個生產周期僅需5-6天， 相比現有轉瓶細胞培養法的6-7天以上明顯縮短。 (3)應用生物反應器進行疫苗生產，具有自動化程度高，用人少，生產工藝簡單穩 定。易操作、產量大占用場地小，易于快速擴大生產規模。質量易于實現均衡穩定。
(4)應用本方法生產疫苗，產品病毒效價比傳統轉瓶細胞培養法提高10-30倍，成 本降低3-4倍。產品質量均一，易于規模化生產，整個生產工藝過程不涉及傳統生產方法所 具有的其他生物安全和公共衛生問題。


圖1為本發明的制備流程圖。
具體實施例方式
以下結合說明書附圖及具體實施例來對本發明作進一步的描述。
(1)選擇生物反應器作為培養的手段75L生物反應器。 (2)選擇微載體作為細胞貼附生長的載體微載體Cytodex-2 (3)微載體的清洗、滅菌方法1)稱量Cytodex-2微載體10g/L、使用2L PBS液浸泡三小時。2)每次用2L PBS液清洗3遍。3)加入2L PBS液浸泡微載體，121。C蒸汽滅菌 三十分鐘。 (4)選擇VER0細胞作為制苗用細胞 (5)制苗用細胞的傳代與培養上述細胞經EDTA-胰酶細胞分散液(含0. 25%胰 酶(規格為1 : 250) 、0. 02% EDTA的Hank' s液)消化傳代，以含92% DMEM液、8%小牛 血清、200IU/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，K1調整為7. 2的細胞生長液繼續培養，培養溫度 為36°C。形成良好單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養。
(6)細胞毒種的繁殖用細胞維持液，將來豬流行性腹瀉病毒種毒按3%比例接種 生長良好的上述細胞單層，繼續培養，培養溫度為35°C。至細胞80%以上病變時收獲病毒 液；測定病毒的TCIDs。，待病毒效價穩定且達到107°TCID5。/mL以上時停止復壯，將該病毒作 為生產用種毒。 (7)VER0細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養取轉瓶上生長良好的VERO細 胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數密度按2X 105/ml接種反應器 中。生物反應器設定如下參數溫度37°C、 2、攪拌速度60rpm、溶氧含量50%進行反應 器自動控制培養。 (8)制苗毒液的繁殖培養后第三日待觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數 結果達5X 107ml以上后進行接毒操作。設定溫度34°C、PH6. 8、攪拌速度70rpm、溶氧含量 30%等培養參數，進行反應器自動控制培養。接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯 微鏡觀察細胞病變情況，并檢測樣品的TCID5。。待觀察微載體上細胞基本全部脫落，且DO值 呈明顯上升趨勢，停止反應器攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，分別收獲上清液和微 載體。 收獲病毒液的處理經3次反復凍融后，過濾去除細胞碎片后_201:冷凍保存備 用。 半成品檢驗及疫苗制造、成品檢驗 1.收獲病毒液毒價的測定將以上收獲的細胞病毒液混合后取樣，測定毒價。病 毒含量應^ 107°ELD5。/ml。 滅活按總量的0. 2%向病毒液中加入甲醛溶液，振搖2分鐘，置37t:條件滅活24 小時。期間定時攪拌混勻。
2.滅活后半成品檢驗 無菌檢驗按《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》附錄301頁進行，無菌生 長。 滅活檢驗滅活后，以無菌操作從病毒滅活液中取樣，按1 %比例接種健康VERO細
胞單層，37t:培養3天，按此方法，連續傳代3代，細胞不應出現病變為合格。 3.疫苗制造和成品檢驗按《豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎二聯滅活疫苗制造和檢
驗規程》要求進行。
權利要求
一種豬流行性腹瀉病毒的生產方法，其特征在于選擇生物反應器作為培養工具；選擇微載體作為細胞貼附的生長載體；選擇VERO細胞作為制苗用細胞系；并包括如下步驟(1)制苗用細胞的傳代與培養取VERO細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液培養，培養溫度為35-38℃；形成良好細胞單層時，用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養；(2)細胞毒種的繁殖用病毒培養液將豬流行腹瀉病毒種毒按0.5-5％比例接種到步驟(1)形成的良好細胞單層繼續培養，至細胞50-100％以上病變時收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細胞上進行細胞適應性連續傳代復壯，每次傳代產物進行病毒TCID50和無菌檢測，傳至病毒TCID50穩定且達到107.0TCID50/mL以上時停止復壯，作為生產種子；(3)VERO細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養生物反應器按總體積的30％-80％加入無菌細胞生長液，且每升無菌細胞生長液中按3-10g/L濃度加入微載體，啟動生物反應器，低轉速攪拌30分鐘后，取步驟(1)轉瓶上生長良好的VERO細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按1～3×105個/mL的密度接種到反應器中，設定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量等培養參數，進行反應器自動控制培養；(4)制苗毒液的繁殖待觀察微載體上細胞長滿80％-90％，空球率低于5％，，滿球率大于80％，細胞狀態良好，且細胞計數結果達到3～5×106個/mL以上進行接毒操作，按0.5-5％比例介入步驟(2)制備好的豬流行性腹瀉病毒種毒，設定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量等培養參數，進行反應器自動控制培養；接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，并檢測樣品的TCID50；待觀察微載體上細胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，停止反應器攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，收獲上清液和微載體；(5)收獲病毒液的處理病毒液和微載體經2-3次凍融后，離心或過濾去除細胞碎片后-20℃冷凍保存備用。
2. 根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產方法，其特征在于所述的生物反 應器為能夠自動控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參數，適用于微載體懸浮培養的生物反應 器，容積為3L-3000L。
3. 根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產方法，其特征在于所述的微載體 為Cytodex系列微載體，微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下1)用PBS浸泡微載體三 小時以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，12rC蒸汽滅菌三十分鐘。
4. 根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產方法，其特征在于所述的 EDTA-胰酶細胞分散液配方為質量體積分數分別是0.25%的規格為1 : 250的胰酶、 0. 02 %的EDTA的Hank' s液。細胞生長液的配方為質量分數分別是90% -98% DMEM液、2X _10%牛血清、終濃度 為100-200IU/mL的抗菌素，PH為6. 8_7. 6。
5. 根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產方法，其特征在于所述的種毒接 種量為0. 5-5%，病毒培養液配方為含血清l-4X的DMEM液、終濃度為100-200IU/mL的抗 菌素，ra調整為7. 2-7.4。
6.根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產方法，其特征在于所述的生物反應器設定參數為培養溫度33-38。C、P朋.5-7. 68、溶氧30% _70%、攪拌速度30-80rpm。
全文摘要
本發明公開了一種應用生物反應器微載體培養VREO細胞生產豬流行性腹瀉病毒的生產工藝，本發明包涵不同豬流行性腹瀉病毒毒株的生產工藝。本發明包括如下技術步驟(1)選擇VERO細胞作為制苗用細胞系；(2)制苗用細胞的傳代與培養；(3)豬流行性腹瀉病毒細胞毒種的繁殖；(4)VERO細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養；(5)豬流行性腹瀉病毒抗原的繁殖；(6)收獲病毒抗原液的處理。本發明可以大量降低生產成本，投入產出比提高5-10倍。而且生產周期短，占用場地小，易于快速擴大生產規模，環境污染少且易于處理，自動化程度高，用人少，質量易于實現均衡穩定。可顯著降低生產成本、提高疫苗產量和質量。
文檔編號C12N7/02GK101748102SQ201010103700
公開日2010年6月23日 申請日期2010年2月1日 優先權日2010年2月1日
發明者劉玉才, 徐宏軍, 胡來根 申請人:成都天邦生物制品有限公司