專利名稱：L-蛋氨酸的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種L-蛋氨酸的制備方法。特別是，本發明包括制備L-蛋 氨酸的循環酶法。
背景技術：
L_蛋氨酸主要用于營養學領域，例如，在滲析溶液中的腸外注入液或 作為飼料添加劑和食物添加劑。對于本領域技術人員，已知有多種方法制備L-蛋氨酸。然 而適用于工業化的的制備方法卻很少。現有技術中制備L-蛋氨酸的工業化方法均包括至 少一個酶法步驟。現有為公眾所知的工業化方法為酶拆分外消旋的N-乙酰基-D，L-蛋氨 酸和酶裂解外消旋的D，L-甲基硫乙基己內酰胺(US6114163和US6524837)。在這些方法 中，酰基轉移酶路線已被實現，從而在工業水平上獲得幾乎完全純的對映異構體L-蛋氨酸 (TO 97/21 667)。在Μ^ ΛΜΘβ中，公開了制備L-氨基酸和L-蛋氨酸的優化方法，其中 優選將制得的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸通過外消旋步驟循環至乙酰轉移酶的酶裂解中，從 而利用了所有的原料。中國專利申請CN200610084263. 0公開了一種優化的L-蛋氨酸生產 方法，其包括a)乙酰化D，L-蛋氨酸的外消旋或幾乎外消旋的混合物；b)酶裂解所述混合物；c)結晶并分離由此制得的L-蛋氨酸；d)任選地，乙酰化所得的結晶母液；e)離子交換純化所得的乙酰化的母液；f)外消旋在步驟e)中的所述純化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸；g)循環步驟乃的外消旋混合物至步驟b)中；該申請聲稱其改進的生產方法能夠獲得原料的高產率以及更少的廢物流。但我們 發現其工藝所有步驟均為現有技術，而該制備方法是對現有技術的簡單組合，并且不能提
高原料產率。
發明內容
本發明提供了一種改進的L-蛋氨酸的制備方法，包括以下步驟1)乙酰化D，L-蛋氨酸的外消旋或幾乎外消旋的混合物；2)酰基轉移酶裂解該乙酰化混合物，所述的酶裂解反應產物進行超濾以分離酶；3)將步驟2)得到的產物流采用荷負電納濾膜進行過濾，得到截留液和透過液；4)對步驟3)得到的透過液進行結晶并分離由此制得的L-蛋氨酸；5)離子交換純化步驟3)所得的截留液；6)乙酰化步驟4)所得的結晶母液，并循環至步驟2)中進行酶解7)外消旋步驟5)純化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，并將該產物循環至步驟2)進 行酶解。尤其是在步驟3)中使用荷負電納濾膜對L-蛋氨酸與N-乙酰-D-蛋氨酸進行分 離，直接降低了兩者后期通過重結晶進行分離的難度，提高了 L-蛋氨酸成品的純度，簡化 了操作工藝。
步驟1)乙酰化D，L-蛋氨酸的外消旋或幾乎外消旋的混合物；L-氨基酸的乙酰化是本領域技術人員所知的。許多文獻涉及從游離氨基酸通過 Schotten-Baumann 或 Einhorn-方法獲得 N-乙酉先基氨基酸(Organikum, VEB Deutscher Verlag derffissenschaften, 16. Auflage, Berlin 1986，S. 407)。同樣，蛋氨酸可以被乙酰 化(US6114163 ；1097/21667)。優選采用固體形式或以30-50%的堿溶液的形式供應D，L-蛋 氨酸，采用D，L-蛋氨酸鈉鹽溶液。另外，也可以使用含有D，(L)-, (D)，L-或D，L-蛋氨酸 的母液。通過向D，L-蛋氨酸的水溶液中加入乙酸酐或乙酰氯，和堿(例如氫氧化鈉/鉀) 在20-40°C下進行乙酰化。對于接下來的酶拆分，可以直接使用來自于乙酰化步驟的N-乙 酰基-D，L-蛋氨酸的堿性鹽溶液。在此情況中，不需要分離N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。2)酰基轉移酶裂解該乙酰化混合物
<formula>formula see original document page 4</formula>該步驟對于本領域技術人員來說是已知的，按照US6114163公開的方法進行。優 選通過將大約0. 4-2. Omol/L的N-乙酰基_D，L-蛋氨酸的堿性水溶液，優選pH值在6. 0和 7. 5之間的鈉鹽，與酰基轉移酶接觸而進行。在此，N-乙酰基-L-蛋氨酸選擇性地被酶拆分 成乙酸鹽和L-蛋氨酸，而N-乙酰基-D-蛋氨酸不受影響。優選酶拆分之前，將pH值被調 節為7. 0-7. 5的來自于外消旋步驟7)的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸鹽溶液循環至待酰基轉移 酶裂解的混合物中，并且所述混合物可以經活性炭和過濾處理。然后將懸浮液在壓濾機上 過濾，并將澄清濾液收集于罐中。可以加入痕量的氯化鋅或氯化鈷作為酶拆分反應的催化 齊U。用水將所述溶液稀釋至N-乙酰基-D，L-蛋氨酸堿性鹽的濃度為約0. 5-1. Omol/L,優選 0.6-0.9mol/L，并供應至用于酶裂解反應的反應器中。所述反應器可以包括具有膜的超濾 單元，所述膜具有5000-20000道爾頓，優選7500-12000道爾頓的截留值(cut-off)。用泵 將所述N-乙酰基-D，L-蛋氨酸鹽溶液供入所謂的酶膜反應器(Enzyme Membrane Reactor) (EPl 170277及其引用的文獻)中，并混合入其中含有酰基轉移酶，優選Amano 酰基轉移酶 或其等價物的濃縮流(concentrate stream)(意指其中存在酶的那部分混合物)中。也可以在酶選擇性地裂解N-乙酰基-L-蛋氨酸后再通過過濾器進行過濾。所述酶選擇性地裂 解N-乙酰基-L-蛋氨酸堿金屬鹽，優選鈉鹽，以形成L-蛋氨酸和堿金屬乙酸鹽。具有分子 量為約80000道爾頓的酰基轉移酶不能透過超濾膜，因此而留在濃縮流中。所有其它更小 的的化合物可以透過所述膜而進入產物流中。該酶促反應有利地在溫度為20-40°C和pH值 范圍為7. 0-7. 5下進行。3)將步驟2)得到的產物流采用截留值500-1000道爾頓的荷負電納濾膜進行過 濾，得到截留液和透過液；所述的荷負電納濾膜即含有陰離子活性基團，顯負電性的的納濾膜，所述納濾膜 選自交聯芳香聚酰胺、交聯聚酰胺、交聯聚哌嗪酰胺、交聯聚哌嗪酰胺、磺化聚砜、聚酰胺、 芳香聚酰胺納濾膜中的一種，所述的陰離子活性基團選自磺酸基(-SO3H)或，羧基(-C00H)， 優選磺化聚砜納濾膜，所述納濾膜為采用截留值500-1000道爾頓的荷負電納濾膜，優選截 留值為800-1000道爾頓的荷負電納濾膜，更優選截留值為1000道爾頓的磺化聚砜納濾膜。 所述納濾膜在過濾時操作壓力為0.25-1. 2Mpa。截留液與透過液的體積比為1 4至1 1， 優選1 1. 5至1 1。通過將步驟2)得到的產物流采用截留值500-1000道爾頓的荷負 電納濾膜進行過濾，得到截留液和透過液，透過液為通過納濾膜的物質，主要是L-蛋氨酸， 而截留液為不能通過納濾膜的物質，主要是N-乙酰-L-蛋氨酸。在過濾過程中，優選加壓 進行過濾。4)對步驟3)得到的透過液進行結晶并分離由此制得的L-蛋氨酸；將步驟3)得到的透過液在減壓條件下泵送入蒸發裝置進行結晶，所述的蒸發裝 置可以是普通的薄膜蒸發器或降膜蒸發器等，類似工藝可以參考US6114163。優選地，在低 于會發生外消旋的溫度下進行濃縮，尤其是低于90°C。可以通過活性炭和壓濾機的過濾純 化所述的透過液以在優選70-90°C之間脫色除雜質。為了得到L-蛋氨酸，可以進行通過微 纖維過濾器的過濾，所述過濾器具有至少0. 2μπι的截留值；也可以通過常規的濾紙或濾布 的方法得到。用于此目的優選的膜由聚醚颯或聚丙烯或本領域技術人員已知的其它材料制 成。冷卻時L-蛋氨酸可以被結晶(US6114163)。隨后，它可以通過離心而過濾，經清洗并干 燥。優選地，清洗溶液由甲醇水溶液(甲醇含量65-90重量％)構成。清洗溶液可以被回 收并且可以通過蒸餾回收甲醇。最優選的是，將獲得的晶體懸浮于甲醇溶液中以除去最后 的雜質并保證微生物的質量。優選在低于40°C的溫度下進行懸浮步驟。懸浮的晶體再一次 通過離心而過濾，并用上述的甲醇溶液清洗。可以通過蒸餾再一次循環甲醇清洗溶液。作 為產物的L-蛋氨酸含量可以達到98%以上。5)離子交換純化步驟3)所得的截留液步驟3)所得的截留液包括未反應的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸和少量的L-蛋氨 酸。為了不浪費后者，必須對該材料進行進一步純化。有利地，通過陽離子交換方法進行 該純化。為了獲得純化的副產物，對與截留液成分組成類似的混合溶液進行離子交換處理 是本領域技術人員已知的(EP 276392 ；WO 97/21667)。通過將所述截留液經受陽離子交換 樹脂，未保護的L-蛋氨酸和堿金屬離子則被吸附至靜態相，而剩余的產物如N-乙酰基-D， (L)-蛋氨酸和乙酸鹽被洗脫。在一個優選的方式中，所述溶液被加熱到45-80°C并泵送至 填充有陽離子樹脂的柱上。L-蛋氨酸和堿金屬(優選鈉)離子被吸附，而N-乙酰基-D，(L) 蛋氨酸和乙酸的酸性部分通過該柱。有利地，該過程可以通過三個獨立的離子交換柱進行。在第一柱中，來自晶體分離的母液如上述處理以分離L-蛋氨酸和對溶液去礦化。隨后，在 陰離子樹脂和陽離子樹脂上成功處理N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸和乙酸部分。陰離子樹脂 旨在從混合物中除去所有的陰離子，典型的，尤其是在外消旋步驟7)中會損壞不銹鋼設備 的氯化物。陽離子樹脂用來除去會導致步驟7)中不完全外消旋的最后痕量的堿金屬離子 和L，(D)蛋氨酸。根據本領域技術人員己知的方法，離子交換樹脂可以重新載有H+或0H_。 含有L-蛋氨酸的部分仍然存在于第一根陽離子柱中，通過本領域技術人員的常識被洗脫、 收集。離子交換純化得到的L-蛋氨酸任選地可以被例如通過結晶分離，優選加入步驟4) 中進行結晶。6)乙酰化步驟4)所得的結晶母液，并將其加入步驟2)進行酶解。結晶過程步驟4)的母液包括少量的D-蛋氨酸，還有可能存在少量的N-乙酰 基-D，(L)-蛋氨酸。為了提高收率，D-蛋氨酸有時需要被乙酰化并重新結合進入所述過 程。如果存在少量的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，可以直接將其加入步驟2)進行酶解，也 可以進行外消旋后加入步驟2)進行酶解。針對少量的D-蛋氨酸，需要將母液的pH值調節 至8. 0-12. 0，并向此混合物加入相應量的乙酰氯或乙酸酐(己述的Schotten-Baumarm-方 法)。完成后，濃縮所得的混合物，并將其循環至步驟2)中進行酶解。任選地，外消旋化所 述的乙酰化結晶母液混合物，再將其循環至步驟2)中進行酶解。7)外消旋步驟5)純化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，并將該外消旋 產物循環至步 驟2)
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r為了相比于外消旋的蛋氨酸，使制得的L-蛋氨酸的比例最大化，必須將分離的 N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸循環至過程中。然而，為了完成此目的，所述重新結合僅可通過其 中在循環的混合物中增加N-乙酰基-L-蛋氨酸的量的步驟而進行，也即必須進行外消旋。 外消旋N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸對本領域技術人員來說是已知的(乙酰-D-蛋氨酸消旋 工藝的研究，張清玉等，化學工業與工程，2004年3月，第21卷第2期，91-95 ；WO 97/21650 ；EP 175840 ;US6114163)。優選用離子交換過程的各自濃縮和去礦化的部分進行N-乙酰 基-D，(L)-蛋氨酸的外消旋。更優選，通過加入少量的乙酸酐外消旋所得到的N-乙酰基-D， (L)-蛋氨酸的熔融物以形成N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。該混合物被加熱至約120-150°C，并 隨后在稀釋的堿金屬(優選鈉)氫氧化物的溶液中驟冷。或者將在堿金屬氫氧化物中的稀 釋的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸溶液加入步驟2)進行酶解。在使用堿金屬氫氧化物的情況 中，用于酶拆分的溶液的PH值可以僅通過加入N-乙酰基-D，L-蛋氨酸堿金屬氫氧化物溶 液進行調節。或者，在本發明的另一優選的實施方式中，將步驟5)離子交換純化的L-蛋氨酸溶 液加入至步驟4)的結晶溶液。在結晶前，優選在活性炭處理前，將步驟5)離子交換純化得 到L-蛋氨酸溶液被加入至步驟4)的溶液是有利的。本發明的另一優選的變體涉及如下，在 酶裂解前，將鋅離子和/或鈷離子加入至混合物。這種方法明顯地增加了酶裂解能力。有 利的是，利用每升反應混合物ICT3-IO-5M的鋅離子。在此情形中，使用的鈷離子的量可以是 每單位酶10_3-10_5的鈷離子。為了進一步最小化來自反應過程的廢物流，優選在純化L-蛋 氨酸晶體的過程中，收集使用的甲醇清洗溶液和蒸餾可以再利用的甲醇。剩余的重相包括 大量的L-蛋氨酸和N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。該重相可以任選地被循環至步驟6)的乙酰 化過程中。結果是該材料被重新結合至總的L-蛋氨酸的制備過程中。從上述描述的方法 可以看出，本發明提供的L-蛋氨酸的制備方法由于其產生最小的廢物量和得到極高產率 的高質量的產品，可以在技術上高度多樣化地運作。方法步驟的結合使獲得L-蛋氨酸較高 的總收率，這明顯優于現有技術，并有助于獲得上述有利的結果。術語，D，(L)-, (D)，L-或D，L-是指具有不同量的D-和L-異構體的對映異構體的 混合物。在D，(L)-混合物中，D-對映異構體是相對于L-形式主要存在的。同樣，在(D)， L-混合物中，L-對于D-異構體的比例大于1。D，L-混合物是外消旋或幾乎外消旋的混合 物。與現有技術不同，本發明提供的L-蛋氨酸制備方法在將酶裂解N-乙酰基-D， L-蛋氨酸的產物經過超濾膜過濾以分離酶等大分子雜質后，再采用納濾膜進行進一步的過 濾，將L-蛋氨酸與N-乙酰-D(L)-蛋氨酸分離開，與現有技術中大量的L-蛋氨酸在離子 交換步驟進行回收相比，本發明提供的制備方法提高了 L-蛋氨酸的回收率和L-蛋氨酸的 質量，同時降低了后續步驟6)中進行離子交換時所用的樹脂量及相應的洗脫、再生樹脂所 用的化學試劑量，因此也降低了生產的成本，通過循環套用步驟7)得到外消旋的N-乙酰 基-D，L-蛋氨酸至步驟2)的酶裂解步驟中，可以使得符合《中國藥典》2005版要求的藥用 級L-蛋氨酸的收率達到95%以上(相對于N-乙酰基-D，L-蛋氨酸的摩爾百分比收率)。
具體實施例方式所述具體實施方式
僅為本發明提供L-蛋氨酸制備方法的實施舉例，不能解釋為 對本發明實施方式的限制，本發明提供的制備方法，可以在結合任何公知常識基礎上以任 何有利的方式進行實施。本實施方式在循環運行后符合中國藥典2005版要求的L-蛋氨酸 的收率可達95%以上(相對于N-乙酰-D，L蛋氨酸的摩爾收率)。1)乙酰化D，L-蛋氨酸的消旋混合物按照US6114163所公開的方法乙酰化D，L-蛋氨酸，得到N-乙酰基_D，L-蛋氨酸。
2)酶裂解該乙酰化混合物按照US6114163所公開的方法，將N-乙酰_D，L_蛋氨酸配制成pH值為7. 0-7.5， 濃度為0.6mol/L的鈉鹽水溶液。按照鋅離子濃度為10_3mo/L的比例向N-乙酰-D，L-蛋氨 酸鈉鹽水溶液中加入氯化鋅。采用商品名為Amano 的酰基轉移酶，酶活力為30000U/g，操 作溫度為37°C，最終轉化率為85%，用截留值為10000道爾頓的超濾膜對最終轉化后的反 應液進行超濾以將產物流中的酶等大分子化合物除去。3)將步驟2)得到的產物流采用荷負電納濾膜進行過濾，得到截留液和透過液；采用截留分子量為1000的磺化聚砜納濾膜(NTR7450，Nitto Denko, Japan)對步 驟2)得到的產物流進行過濾，得到截留液與透過液，操作壓力為0. 8Mpa,操作溫度為35°C， 所述截留液與透過液的體積比為1 1。4)對步驟3)得到的透過液進行結晶并分離由此制得的L-蛋氨酸根據US6114163，將步驟3)和得到的透過液和步驟5)的陽離子樹脂洗脫液在 70°C條件下用活性炭脫色，脫色液壓濾后在減壓條件下泵送入薄膜蒸發器進行濃縮結晶， 結晶溫度低于90°C。所得結晶進行離心過濾，并于常溫下用90%甲醇溶液清洗所得的L-蛋 氨酸結晶，再一次離心過濾，甲醇回收蒸餾后循環使用，得到L-蛋氨酸結晶減壓干燥，干燥 溫度110°C。得到的L-蛋氨酸含量為98.8%。5)離子交換純化步驟3)所得的透過液將步驟3)所得的透過液按照EP276392 ；W097/21667所公開的方法進行離子交換 純化將透過液被加熱到后70°C通過陽離子樹脂柱1進行處理，然后將處理過的透過液再 分別經過陰離子樹脂柱和陽離子樹脂柱2進行處理，洗脫陽離子樹脂柱1和2，洗脫液中加 入到步驟4)活性炭脫色前的溶液中一起進行結晶，制備L-蛋氨酸。洗脫陰離子樹脂柱，洗 脫液為步驟7)備用。6)乙酰化步驟4)所得的結晶母液；將步驟4)得到的結晶母液進行乙酰化，用氫氧化鈉將母液的pH值調至10，采用 US6114163中公開的方法用乙酸酐進行乙酰化。將酰化后的產物按照張清玉等(乙酰-D-蛋 氨酸消旋工藝的研究，化學工業與工程，2004年3月，第21卷第2期，91-95)公開的方法進 行。乙酰化后的產物可以加入步驟2)中進行酶解，也可以進行外消旋化處理，并循環至步 驟2)中進行酶解。這主要根據步驟4)得到的結晶母液中D-蛋氨酸與L-蛋氨酸之間的比 例決定，當D-蛋氨酸較多時就乙酰化后需要進行外消旋化處理，當L-蛋氨酸較多時可以乙 酰化后循環至步驟2)中進行酶解。7)外消旋步驟5)純化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，循環進入步驟2)。將步驟5)陰離子樹脂柱中的洗脫液(含有純化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸)按 照WO 97/21650 ；EP 175840 ；US6 114163和張清玉等(化學工業與工程，2004年3月，第 21卷第2期，91-95)公開的方法采用乙酸酐進行外消旋得到幾乎外消旋的N-乙酰基-D， L-蛋氨酸。用氫氧化鈉溶液和水調節N-乙酰基-D，L-蛋氨酸的濃度為0. 6-0. 9mol,pH為 7. 0-8. 0，按照鋅離子濃度為10_3mO/L加入氯化鋅，加入步驟2)進行酶解反應。
權利要求
一種L-蛋氨酸的制備方法，包括以下步驟1)乙酰化D，L-蛋氨酸的消旋混合物；2)酰基轉移酶裂解該乙酰化混合物，所述的酶裂解反應產物進行超濾以分離酶；3)將步驟2)得到的產物流采用荷負電納濾膜進行過濾，得到截留液和透過液；4)對步驟3)得到的透過液進行結晶并分離由此制得的L-蛋氨酸；5)離子交換純化步驟3)所得的截留液；6)乙酰化步驟4)所得的結晶母液，并循環至步驟2)中進行酶解；7)外消旋步驟5)純化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，并將該外消旋產物循環至步驟2)進行酶解。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征是對步驟6)的乙酰化結晶母液的產物進行外 消旋化處理，并循環至步驟2)中進行酶解。
3.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征是對步驟5)離子交換純化得到L-蛋氨 酸加入步驟4)中進行結晶。
4.如權利要求1-3任一所述的制備方法，其特征是所述步驟3)所采用的荷負電納濾膜 的截留值為500-1000道爾頓。
5.如權利要求4述的制備方法，其特征是所述步驟3)所采用的荷負電納濾膜的截留值 為800-1000道爾頓。
6.如權利要求4或5所述的制備方法，特征是所述步驟3)所采用的荷負電納濾膜選自 交聯芳香聚酰胺、交聯聚酰胺、交聯聚哌嗪酰胺、交聯聚哌嗪酰胺、磺化聚砜、聚酰胺、芳香 聚酰胺納濾膜中的一種。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征是所述步驟3)所采用的荷負電納濾膜優選磺 化聚砜納濾膜。
8.如權利要求6所述的制備方法，其特征是所述步驟3)所采用的荷負電納濾膜截留值 為1000道爾頓的磺化聚砜納濾膜。
9.如權利要求1-8中任一所述的制備方法，其特征是所述步驟3)中截留液與透過液的 體積比為1 4至1 1。
10.如權利要求9所述的制備方法其特征是所述步驟3)中截留液與透過液的體積比優 選為1 1. 5至1 1。
全文摘要
L-蛋氨酸的制備方法，采用以下步驟1)乙酰化D，L-蛋氨酸的消旋混合物；2)酰基轉移酶解該乙酰化混合物，所述的酶裂解反應產物進行超濾以分離酶；3)將步驟2)得到的產物流采用荷負電納濾膜進行過濾，得到截留液和透過液；4)對步驟3)得到的透過液進行結晶并分離由此制得的L-蛋氨酸；5)離子交換純化步驟3)所得的截留液；6)乙酰化步驟4)所得的結晶母液，并循環至步驟2)中進行酶解；7)外消旋步驟5)純化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，并將該外消旋產物循環至步驟2)進行酶解。
文檔編號C12P41/00GK101831483SQ201010150399
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月20日 優先權日2010年4月20日
發明者林立生, 袁英, 黃鳳華 申請人:天津金耀集團有限公司