專利名稱：高效解磷的丁酸梭菌a5-4及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬農業微生物技術領域，具體涉及一株丁酸梭菌，尤其是涉及一株可在厭 氧條件下高效溶解磷酸鈣和植酸鈣的丁酸梭菌的分離篩選，其制備方法與用途。
背景技術：
磷對植物的生長發育至關重要，而磷供給不足已逐漸成為限制農業產出的最重要 因素之一。土壤中總磷含量大約為0. 04 0. 1%，但是只有其中的1. 0 2. 5%能夠被植 物吸收利用，絕大多數為無效態(難溶態)在土壤中積累，很難被植物直接吸收利用。為解 決磷素缺乏獲得高產，全球每年施用將近3000萬噸磷素化肥，但是其中的80%由于吸附、 沉積或固定為植物難以吸收利用的無效磷，磷肥的低利用率使得農田中施用的磷肥越來越 多，不僅提高了農業成本，還造成了嚴重的環境及生態問題。解磷微生物是土壤中能夠將無效磷轉化為植物可以吸收利用的有效磷的一類特 殊微生物功能群體，在自然及農業生態的磷素生物地化循環中起到了關鍵作用；它們通 過酸解、螯合、置換及分泌磷酸酶等方式將無效磷轉化為能被植物利用的有效磷(主要是 HP042_*H2P04_形式)。大量研究表明，施用含有解磷菌的微生物肥料對促進植物生長、改善 土壤結構效果顯著。因此研究新型、高效的解磷微生物，以保持農業生態環境的平衡，對發 展持續高效農業具有深遠的戰略意義。土壤中的無效磷包括無機磷和有機磷，而有機磷又主要以植酸鹽的形式存在于動 物糞便、農業副產物、生活垃圾中。農業中施入的磷肥和有機磷源有很大部分隨雨水、灌溉 進入厭氧環境，成為難被作物利用的無效磷。目前研究的解磷菌主要是好氧菌，而對厭氧解 磷菌的研究尚未見報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一株可以在厭氧條件下溶解磷酸鈣和植酸鈣的細菌，該菌 株能夠有效提高土壤中的有效磷含量，促進植物生長，從而提高磷肥的利用率，節約磷礦資 源，改善生態環境，確保農業生產的可持續發展。本發明的技術方案如下本發明通過分離篩選得到一株一株該菌株高效解磷的丁酸梭菌 (Clostridiumbutyricum)A5-4，該菌株已于2010年3月12日送交湖北省武漢市武漢大學 內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC N0:M2010052。該細菌分離自 化糞池底泥中，在厭氧條件下具有高效溶解磷酸鈣和植酸鈣的能力。該菌營養需求范圍廣、 易培養、成本低、耐儲存，重新施入環境中也不會導致環境污染。本發明的菌株能夠開發成 一種新型的應用于水生作物栽培或水產養殖的微生物菌劑。本發明分離的丁酸梭菌A5-4的生物學特征本發明分離的丁酸梭菌A5-4，為革蘭陽性厭氧菌，菌體初期桿狀，產芽胞，芽胞中 生，菌體中部膨大而呈梭狀；RCM培養基上菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑。本發明的丁酸梭菌A5-4株與丁酸梭菌標準株(Clostridium butyricum)主要生物學特征對比 見表1。丁酸梭菌A5-4的16SrDNA序列在NCBI GenBank中的序列號為GU227149。其核 苷酸序列見序列表SEQ ID NO 1所示。申請人:提供了一種丁酸梭菌的制備方法，其步驟如下所述制備丁酸梭菌A5-4—級種子液取甘油管保藏的保藏號為CCTCC NO :M2010052的 丁酸梭菌菌種A5-4200ii L，接種于裝有15ml RCM液體培養基的試管中，于35 45°C下靜置 培養8 12小時，得到丁酸梭菌A5-4—級種子液，一級種子液的活菌數> 3X108f/mL ；制備丁酸梭菌A5-4 二級種子液將丁酸梭菌A5-4 —級種子液按體積份3 5% 接種量接入裝有丁酸梭菌A5-4 二級種子培養基的培養瓶中，于35 45°C下靜置培養8 12小時，制成丁酸梭菌A5-4 二級種子液，二級種子液的活菌數> 2. 5 X 108個/mL ；丁酸梭菌A5-4發酵培養將丁酸梭菌A5-4 二級種子液按體積份3 5%接種量 接入裝有發酵培養基的發酵罐中于35 45°C下靜置培養48 72小時，發酵液中的丁酸梭 菌A5-4的活菌數彡1 X 109個/mL ；其中丁酸梭菌A5-4RCM液體培養基的組分及其配比如下葡萄糖5. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母粉3. 0g，胰蛋白胨10. 0g，可溶性淀粉1. 0g，醋酸 鈉3. 0g, NaCl 3. 0g，補充蒸餾水至1L，調pH至7. 0 7. 5。丁酸梭菌A5-4 二級種子培養基的組分及其配比如下葡萄糖20. 0 25. 0g，酵母粉 3. 0 5. 0g，蛋白胨 4 6g，K2HP04 2. 0 4. 0g， NaCl 0. 3 0. 5g, MgS04 7H20 0. 5 0. 6g, KC1 0. 2 0. 3g, FeS04 7H20 0. 02 0. 03g, MnS04 H20 0. 02 0. 03g，補充蒸餾水至 1L，調 pH 至 7. 0 7. 5 ;為降低生產成本，本發明中的丁酸梭菌A5-4發酵培養基采用更為經濟的原料，例 如如豆粕、玉米淀粉、玉米漿等，發酵培養基組分及其配比如下葡萄糖15. 0 25. 0g，玉米淀粉5. 0 10. 0，豆粕30. 0 40. 0g，酵母粉3. 0 5. 0g,玉米菜 5. 0 10. 0g,蛋白胨 4. 0 8. 0g, K2HP04 2. 0 4. 0g, NaCl 0. 3 0. 5g, MgS04 7H20 0. 5 0. 6g, FeS04 7H20 0. 02 0. 03g, MnS04 H20 0. 02 0. 03g,補充蒸溜 水至1L，調pH至7. 0 7. 5。作為優選方案之一，上述丁酸梭菌A5-4發酵培養基的組分及其配比為葡萄糖 19. 0g，玉米淀粉 8. 0g，豆粕 35. 0g，酵母粉 5. 0g，蛋白胨 6. 0g，K2HP04 3. 0g, NaCl 0. 3g, MgS04 '7H200. 5g，FeS04 '7H20 0. 03g，MnS04 *H20 0. 02g，補充蒸餾水至水 1L，調 pH 至 7. 0 7. 5。作為優選之方案二，上述丁酸梭菌A5-4發酵培養基的組分及其配比為葡萄糖 24. 0g,玉米淀粉 5. 0g 豆粕 38. 0g,玉米漿 8. 0g,蛋白胨 4. 0g, K2HP04 4. 0g, NaCl 0. 3g， MgS04 '7H200. 5g，FeS04 '7H20 0. 02g，MnS04 *H20 0. 02g，補充蒸餾水至水 1L，調 pH 至 7. 0 7. 5。上述所有的培養基均按照常規方法滅菌(即在115°C下高溫蒸汽滅菌30min)。本發明所述的丁酸梭菌A5-4能夠在厭氧條件下高效溶解磷酸鈣和植酸鈣等無機 磷和有機磷。施用該菌發酵液可提高土壤中的有效磷含量，從而促進植物生長。
序列表SEQ ID NO 1是丁酸梭菌A5-4的16s rDNA序列，序列號是GU227149 (參 見NCBI genbank 鏈接 http //www, ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/281484423)。圖1 本發明的技術流程圖。圖2 在以植酸鈣為唯一磷源的改良PVK培養基中接種丁酸梭菌A5-4，發酵液中植 酸酶、磷酸酶酶活變化曲線。圖中〇為植酸酶；★為堿性磷酸酶；■為酸性磷酸酶。圖3 在以磷酸鈣為唯一磷源的改良PVK培養基中接種丁酸梭菌A5-4，發酵液中氣 相色譜檢測有機酸譜圖。圖中(1)毛細管柱Thermo TR-WAX分離有機酸譜圖；(II)毛細管 柱Thermo TR-5分離有機酸譜圖。a為乙酸；b為丁酸；1為乳酸；f為富馬酸；s為丁二酸； a為a-酮戊二酸；g為葡萄糖醛酸；u為未能鑒定物質。
具體實施例方式實施例1 丁酸梭菌A5-4的分離篩選及鑒定從湖北省武漢市洪山區獅子山地區華中農業大學養豬場的化糞池底泥中采集樣 品，經LB液體培養基，37°C靜置、富集培養12小時后，將所得的丁酸梭菌A5-4菌液稀釋后 涂布于改良PVK固體培養基平板(見后所述)，于37°C厭氧培養7天，挑取溶磷圈直徑與菌 落直徑比值較大的菌株，并對其解磷能力進行定量分析。采用改良PVK液體培養基(液體培 養基中不添加瓊脂)37°C下靜置培養7天，用鉬銻抗比色法(張祥勝，鉬銻抗比色法測定磷 細菌發酵液中有效磷含量測定值影響的因素分析，安徽農業科學，2008，36 (12) 4822-4823 ； 趙小蓉等，細菌解磷能力測定方法的研究，微生物通報，2001,28 (1) 1-3)檢測發酵液中可溶 性磷的含量。根據溶解磷酸鈣和植酸鈣能力的高低，篩選高效厭氧解磷菌，即獲得A5-4候 選菌株(該候選菌株的解磷能力見表2所述)。上述分離篩選的丁酸梭菌A5-4的LB培養基組分及配比牛肉膏3g(單位)，蛋白 胨10g (單位)，NaCl 5g (單位)，補充蒸餾水至1L，調pH至7. 2。上述改良PVK培養基組及配比為葡萄糖5g，酵母粉3g，(NH4)2S04 2g,NaCl 0. 3g， MgS04 7H20 0. 3g, KC1 0. 2g, MnS04 H20 0. 03g, FeS04 7H20 0. 03g, Ca3 (P04) 2 或植酸鈣 5g， 補充蒸餾水至1L，調培養基的pH至7. 3，即得到改良PVK培養基的液體培養基。其中添加 18g/L瓊脂粉的即為改良PVK固體培養基。上述所有的培養基均按照常規方法滅菌(即在121°C下高溫蒸汽滅菌20min，下 同)。本發明利用形態學、生理生化實驗檢測和16SrDNA序列分析，對本發明制備的丁 酸梭菌A5-4的分類進行分子生物學輔助鑒定，具體結果如表1所示16SrDNA 序列 PCR 擴增采用通用引物 27FP1 (5，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，)和 1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)。PCR 反應體系為10mM 的 dNTP 0. 5 u L,模板 DNA 1 u L, 10XPCR buffer 5u L,25mM Mgcl23 ii L，引物各 1 ii L，TaqDNA 聚合酶 0. 25 ii L，ddH20 37. 5uL ；預變性:95°C 3分鐘，循環1次；變性:95°C 1分鐘，退火55 °C 1分鐘，延伸72 °C 2分鐘，循環35次；終延伸72°C 5分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分離、提取目標條帶，送華大基因 公司(武漢)測序，序列見SEQ ID N0:1所示，申請人:將該候選菌株鑒定為丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，見表1.保藏該菌株，備用。表1 丁酸梭菌A5-4菌株與丁酸梭菌標準株(Clostridium butyricum)主要生物 學特征鑒定對比 注明丁酸梭菌生物學特征描述參照第八版《伯杰氏細菌學鑒定手冊》，科學出版 社，1984,761-766 頁。實施例2 丁酸梭菌A5-4的種子培養及發酵生產試驗1(1)制備丁酸梭菌A5-4 —級種子液取甘油管保藏的丁酸梭菌菌種A5-4200 u L， 接種于裝有15mLRCM液體培養基的試管(18X180mm)中，37°C靜置培養10小時，制成丁酸 梭菌A5-4—級種子液，一級種子液的活菌數達到3X108f/mL ；(2)制備二級種子液將步驟(1)的一級種子液按體積份3%接種量接入裝有二級 種子培養基的培養瓶中，于37°C下靜置培養10小時，制成二級種子液，二級種子液的活菌 數達到2. 5X108個/mL;丁酸梭菌A5-4 二級種子培養基的組分及其配比如下葡萄糖22. 0g，酵母粉 4g，蛋白胨 6g，K2HP04 3g，NaCl 0. 3g，MgS04 7H20 0.5g，KCl 0. 3g, FeS04 7H20 0. 03g, MnS04 H20 0. 03g，水 1L, pH7. 3。(3)發酵培養將步驟⑵的丁酸梭菌A5-4 二級種子液按體積份的3%接種量接 入裝有發酵培養基培養瓶中，37°C靜置培養60小時。獲得的發酵液中丁酸梭菌A5-4活菌 數彡 1.0X109f/mL。發酵培養基配方為葡萄糖19. 0g,玉米淀粉8. 0g，豆粕35. 0g，酵母粉5. 0g，蛋白 胨 6.0g，K2HP04 3. 0g，NaCl 0. 3g，MgS04 7H20 0. 5g，FeS04 7H20 0. 03g，MnS04 H20 0. 02g, 水 1L, pH7. 0。上述所有的培養基均按照常規方法滅菌(即在115°C下高溫蒸汽滅菌30min，下 同)
實施例3 丁酸梭菌A5-4的擴大培養和發酵生產試驗2根據實施例1和實施例2的方法，本實施例中的二級種子培養和發酵生產的培養 基配方如下二級培養培養基葡萄糖20. 0g,玉米淀粉 3g，酵母粉 4. 0g，蛋白胨 4. 5g，K2HP04 3g，NaCl 0. 3g， MgS04 7H200. 5g, KC1 0. 3g, FeS04 7H20 0. 03g, MnS04 H20 0. 03g，水 1L, pH7. 3。于 37°C 下靜置培養12小時，所得二級種子液中的活菌數達到2. 8X 108個/mL ；發酵培養基葡萄糖24. 0g,玉米淀粉5. 0g豆粕38. 0g,玉米漿8. 0g,蛋白胨4. 0g, K2HP04 4. 0g， NaClO. 3g, MgS04 7H20 0. 5g, FeS04 7H20 0. 02g, MnS04 H20 0. 02g，水 1L, pH7. 5。37°C靜 置培養60小時，獲得的發酵液中丁酸梭菌A5-4菌數彡1. 2X 109個/ml。實施例4 丁酸梭菌A5-4在水稻盆栽試驗的應用在盆栽土壤中按每克土 107個活菌的接種量接入丁酸梭菌A5-4菌液，對照接入等 體積不含菌體的發酵培養基；混勻后播種“汕優63”稻種(一個中國大面積推廣應用的水 稻品種)，于溫室中培養。溫室培養條件為培養室晝夜循環為16h光照/8h黑暗，室溫晝夜控制在 26士2°C-20士2°C，相對濕度控制在70士5%。盆栽試驗結束后(歷時49d)，收獲植株，測 量株高、根長、鮮重，70°C烘干至恒重后測干重，消化、檢測葉片含磷量。取根際士樣檢測 其可溶性磷含量，試驗結果見表3。試驗結果表明，本發明分離的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)A5-4能顯著促進水稻生長，鮮重、干重、株高、根長及含磷量與對照相比分別 提高了 48. 4 %、70 %、99. 4 %、106 %，52. 6 %。而根際土壤有效磷含量比對照組提高了 53. 2 %，。表2 丁酸梭菌A5-4在固體平板和液體培養基上的解磷指數和解磷能力 *解磷指數HD/CD =溶磷圈直徑/菌落直徑解磷能力發酵液中可溶性磷含量表3 丁酸梭菌A5-4發酵液對水稻促生長效果(盆栽試驗)
權利要求
一株能在厭氧條件下溶解磷酸鈣和植酸鈣的丁酸梭菌，其特征在于，該菌株為丁酸梭菌(Clostridium butyricum)A5-4，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM2010052。
2.包含權利要求1所述菌株的微生物菌劑。
3.權利要求1所述的丁酸梭菌A5-4在溶解磷酸鈣和植酸鈣中的應用。
4.權利要求2所述的菌劑在溶解磷酸鈣和植酸鈣中的應用。
全文摘要
本發明屬于農業微生物技術領域，公開了一株高效解磷的丁酸梭菌，其制備方法及應用。本發明通過分離得到一株該菌株高效解磷的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)A5-4，該菌株保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM2010052。該細菌分離自化糞池底泥中，在厭氧條件下具有高效溶解磷酸鈣和植酸鈣的能力。該菌營養需求范圍廣、易培養、成本低、耐儲存，重新施入環境中也不會導致環境污染。本發明的菌株能夠開發成一種新型的應用于水生作物栽培或水產養殖的微生物菌劑。
文檔編號C12R1/145GK101851596SQ201010153419
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月21日 優先權日2010年4月21日
發明者信建, 冀志霞, 周光林, 柯云, 陳守文, 馬昕 申請人:華中農業大學