無哺乳動物源成分的溶組織梭菌生長培養基的制作方法

專利名稱：無哺乳動物源成分的溶組織梭菌生長培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及以前Bond，M.，D.，van Wart，H.，E.，Biochemistry 23(1984)，3077-3085和Bond，M.，D.，van Wart，H.，E.，Biochemistry 23(1984)，3085-3091中給出的I型和II型溶組織梭菌膠原酶(EC 3.4.24.3)。
本發明描述和權利要求中使用的術語“包括”表示“包括但不必要限于”的意義。
冠詞“一個(a)”和“一種(an)”在此用于指該冠詞的一個或多于一個(即至少一個)語法對象。例如，“一個化合物”指一個化合物或多于一個化合物。
當指定數值范圍例如濃度范圍時，以尾隨第一個值n1和第二個值n2的詞語“之間”表示該范圍。將指定范圍的下限理解為等于或高于第一個值的值。將指定范圍的上限理解為等于或低于第二個值的值。因此，將指定的范圍值x給定為n1≤x≤n2。
如果沒有另外聲明，應當理解術語“約”和字符“～”與數值n組合(“約n”、“～n”)指值x在該值數值±5％所給定的區間內，即n-0.05*n≤x≤n+0.05*n。如果沒有另外指出，倘若術語“約”或字符“～”與數值n組合描述本發明的優選實施方案，那么值n是最優選的。
細菌“生長”是一個細菌在稱為二分分裂的過程期間分裂為兩個相同的子細胞。因此，出現細菌群體的局部加倍。分裂而來的兩個子細胞都不必要存活。然而，如果存活數目平均超過一，那么細菌群體進行指數生長。可以使用廣為人知的實踐監控分批培養中指數細菌生長曲線的測量，所述實踐例如通過直接和個別(顯微鏡、流式細胞術)、直接和大批(生物量)、間接和個別(菌落計數)、或間接和大批(最大可能數、混濁度、營養物攝取)方法的細菌枚舉(細胞計數)。可以將分批培養的細菌生長構造成具有四個不同期的模型滯后期(A)、指數或對數期(B)、穩定期(C)和死亡期(D)。
(A)在“滯后期”過程中，細菌自我適應生長條件。這是個別細菌成熟但尚不能分裂的時間段。(B)“指數期”(有時也稱為“對數期”)是以細胞加倍為特征的時間段。每個單位時間出現的新細菌數與現有群體成比例。如果生長不受限制，加倍將在恒定速率繼續，因此細胞數和群體增加速率隨每個連續時間段加倍。實際生長速率取決于生長條件，所述生長條件影響細胞分裂事件的頻率和兩個子細胞存活的可能性。然而，指數生長不能無限地繼續，因為培養基很快耗盡營養物，并且富集了廢物。(C)在“穩定期”過程中，作為營養物耗盡及毒性產物積累的結果，生長速率減緩。當細菌開始耗盡其可獲得的資源時，達到該期。(D)在死亡期，細菌用完營養物并且死亡。孢子形成物種在該期中經歷孢子形成。
實際上，即使在分批培養中，這四個期也沒有很好定義。細胞不在沒有明確且連續刺激下同步繁殖，而其對數期生長通常不會總是恒定速率，而是緩慢衰減的速率，這是面對營養物濃度降低及廢物濃度增加時對針對繁殖和休眠的壓力的持續隨機反應。
將“蛋白胨”理解為各種水溶性化合物的任一種的混合物，所述水溶性化合物作為蛋白質水解為氨基酸期間的中間物形成。經常通過酶促消化或酸水解自然產物例如動物組織、乳、植物或微生物培養物而獲得蛋白胨。有大量可促進和維持大多數生物生長的可利用的蛋白胨和提取物。蛋白胨包含蛋白質片段，且該片段的組成取決于水解開始時存在的蛋白質組成。
用于蛋白胨生產的蛋白質來源通常是肉類和乳制品生產過程中出現的廢物形式。然而，多種蛋白胨可以從植物來源獲得。取決于來源材料及其水解處理前的任何加工(例如純化到一定程度的該來源的蛋白質組分)，除了肽或氨基酸外，許多化合物可以是蛋白胨的部分。
蛋白胨可以例如來自由一個或多個蛋白水解酶消化的動物乳或肉類。除了含有小肽之外，產生的噴霧干燥材料可以包括脂肪、金屬、鹽、維生素和許多其他生物化合物。含蛋白胨培養基的另一個實例是腦心浸液肉湯(broth)，在此也稱為“BHI”。BHI是高營養的多用途生長培養基，其尤其可用于需要復雜營養的微生物。其通過從煮沸的牛心和腦回收營養物而制備。可溶性因子在煮沸程序過程中被釋放到肉湯中。然后可以將肉湯變成粉末以易于分發。
術語“明膠”指從含有膠原的多細胞動物(后生動物)結締組織提取的固體或半固體物質。膠原蛋白質，在此統稱為“膠原”，在細胞外基質中具有結構功能。已知膠原蛋白質不僅出現在例如哺乳動物的高等動物中，甚至也出現在非常原始的海洋海綿動物中。
膠原是在所有動物的皮膚和骨中發現的主要結構蛋白質。膠原分子由3個個別的多肽鏈(α鏈)組成，所述多肽鏈相互環繞以三螺旋構象纏繞。所述三螺旋由膠原分子之間的氫鍵穩定，這隨著動物衰老而發生。三個α鏈的膠原分子測量為長度3000埃(0.3微米)及直徑15埃。各α鏈具有大約1050個連接在一起的氨基酸。各α鏈中有20個不同的氨基酸，而且對于各種動物類型的明膠，這些氨基酸具有特定的重復模式。代表三分之一氨基酸內容物的甘氨酸位于含有其他兩個氨基酸的重復序列中。可以將此表示為甘氨酸-x-y。x為脯氨酸且y為羥脯氨酸并非罕見的。
明膠是膠原蛋白質的不可逆水解形式，并且由從皮膚、骨、軟骨、結締組織、器官和一些腸提取的膠原的部分水解而產生。明膠的化學組成與膠原類似。當在個別膠原鏈之間的天然分子鍵斷裂為更易重排的形式時，就形成明膠。因此，明膠在加熱時熔化，并在再次冷卻時固化。它和水一起形成半固體膠體凝膠。取決于其濃度，明膠可以在水中形成高粘度溶液，其在冷卻后形成凝膠。
某些形式的明膠被用作食物工業的成分。為了這個目的，從例如牛、豬和馬的哺乳動物生產大量明膠。然而，已知來自可選擇的來源的明膠，例如魚明膠。從魚提取明膠的方法已為人所知一些年了。在這種方法中，處理富含膠原的魚皮(尤其是暖水魚物種)以及在較低程度上處理鰾，以形成并提取明膠。對于傳統的猶太人、穆斯林和許多素食者，具有鰭和鱗的魚(清潔可食的魚(kosher fish))代表更美味的來源。
在生長例如細菌和真菌的微生物的營養培養基中，蛋白胨和明膠可以起到有機源例如碳和/或氮的作用。
在生物技術工業中，以大規模發酵方法生產許多用于藥物程序的技術酶。因此一個實例是溶組織梭菌膠原酶，其用于解離器官組織以及繼而從解離的器官組織分離靶細胞。因為產生技術酶的微生物培養物從生長培養基攝取組分，所以需要開發無哺乳動物病原試劑的蛋白胨和提取物。關于朊病毒和BSE尤其具有安全相關的顧慮。
關于本發明，該文件作者對來自非哺乳動物源的蛋白胨作為溶組織梭菌培養基中的營養物進行了評價。本研究的目標是提供液體培養基，所述液體培養基(i)支持細菌生長并且(ii)刺激具有膠原酶活性的酶向培養基中的分泌。特別優選的培養基刺激培養物上清液中的高體積活性。為了這個目的，以不同濃度使用表1a中列出的大量植物衍生的成分(見實施例3)以制備列于表2中的基于蛋白胨的營養培養基。將植物衍生的蛋白胨與BHI進行比較，所述BHI作為已知支持溶組織梭菌的生長及膠原酶的分泌的參考蛋白胨。在下文實施例5中描述了比較培養實驗，且關于上清液中細胞密度(以OD測量)和膠原酶活性的結果也在表2中給出。
培養該培養物直至到達穩定期。在各培養物的生長(指數)期和穩定期期間監控前述參數。
盡管含有3.7％BHI的基于蛋白胨的營養培養基產生關于體積活性的最佳結果并不是非常令人驚訝的，但令人驚訝的結果是，含有5％VG100(培養號(culture no.)82)或2.5％SP6、2.5％VG100(培養號185a)或1.5％SP6、1.5％VG100(培養號195)或5％BP(培養號145)的營養培養基產生了非常類似的結果，即，超過400U/l至約495U/l之間的體積活性。因此，本發明的一個方面是支持溶組織梭菌生長和膠原酶分泌的組合物，該組合物包含水和來自植物來源的蛋白胨營養物，所述來自植物來源的蛋白胨營養物選自(a)濃度5％[w/v]的來自豌豆的VG100植物蛋白胨No.1(VG100)，(b)濃度5％[w/v]的蠶豆(Broad bean)蛋白胨(BP)，(c)VG100與大豆蛋白胨No110木瓜蛋白酶消化物(SP6)的組合，濃度各2.5％，以及VG100和SP6的組合，濃度各1.5％[w/v]。在本發明的優選實施方案中，該組合物是液體組合物。在本發明的另一個優選實施方案中，該組合物具有約7.2至約7.4之間的pH，而甚至更優選的是該組合物不包含其他成分。這樣的組合物為在完全沒有動物衍生的成分時經濟地以分批培養生長溶組織梭菌并產生具有膠原酶活性的酶提供了首要基礎。
為了進一步最優化培養物上清液中的膠原酶體積活性，在生長實驗中測試培養基，由此使用基于蛋白胨的營養物與不同明膠的組合。明膠列于表1b中(見實施例3)。以3.7％[w/v]BHI和3％G1的組合作為參考。
非常令人驚訝的是，魚明膠能夠顯示增強培養物上清液中的膠原酶體積活性(見實施例6，表3)。因此，本發明的另一方面是在營養培養基中使用魚明膠用于培養溶組織梭菌，并由其分泌具有膠原酶活性的酶。本發明的另一方面是含有水、來自非哺乳動物源的蛋白胨和魚明膠的組合物。在本發明的優選實施方案中，該組合物是液體營養培養基。在這一點，應當理解在根據本發明的組合物中，將化合物(即蛋白胨和明膠以及任何其他成分)溶于水中，即，形成溶液。由于任何明膠成分，該溶液的粘度可以高于純水。
魚明膠在其氨基酸含量方面不同于哺乳動物源的傳統明膠。盡管所有明膠都由相同的20種氨基酸組成，但與來自哺乳動物源的明膠相比，魚明膠含有較低量的亞氨基酸、脯氨酸和羥脯氨酸。在本發明的優選實施方案中，與小牛皮明膠相比，魚明膠的羥脯氨酸含量在約78％到約56％之間。在本發明的另一個優選實施方案中，與小牛皮明膠相比，魚明膠的脯氨酸含量在約93％到約74％之間。
可以通過商業途徑獲得不同類型的魚明膠，其可用于本發明的營養培養基。在本發明的非常優選的實施方案中，魚明膠選自(i)高分子量魚明膠，(ii)液體魚明膠，(iii)來自魚的清潔可食物種的明膠，以及其混合物。魚必須具有鰭和鱗才是清潔可食的；有殼的水生動物，即水生無脊椎動物例如軟體動物、甲殼動物、棘皮動物和其他非魚水生動物區系不是清潔可食的。因此，在本發明的優選實施方案中，來自魚的清潔可食的物種的明膠是來自具有鰭和鱗的魚物種(魚綱(pisces))的明膠。
在本發明非常優選的實施方案中，魚明膠在本發明組合物中的濃度在約2％至約10％之間，其中的百分比在分離的魚明膠是干物質時指重量比體積，且在分離的魚明膠是液體物質時指體積比體積。在本發明的甚至更優選的實施方案中，魚明膠濃度在約3％至約8％之間。
根據本發明，營養組合物中的蛋白胨是來自非哺乳動物源的蛋白胨。在本發明的非常優選的實施方案中，蛋白胨是植物產物。甚至更優選的，該蛋白胨來自植物源，所述植物源選自大豆、蠶豆、豌豆、馬鈴薯及其混合物。最優選的，蛋白胨選自來自豌豆的Oxoid VG100植物蛋白胨No.1(VG100)、來自豌豆的Oxoid VG200植物蛋白胨磷酸鹽肉湯(VG200)、Merck TSB CASO-Bouillion無動物(TSB)、Invitrogen大豆蛋白胨No110木瓜蛋白酶消化物(SP6)、Fluka蠶豆蛋白胨(BP)、來自馬鈴薯的Organotechnie植物蛋白胨E1(E1P)、及其混合物。
關于營養培養基的配置且特別是蛋白胨濃度，本發明非常優選的實施方案是根據本發明的組合物包括兩種或更多種不同的蛋白胨，由此該組合物中植物蛋白胨的總濃度為重量比體積約2％至約10％之間。甚至更優選的，該組合物中植物蛋白胨的總濃度為重量比體積約3％至約5％之間。
在本發明另一個非常優選的實施方案中，在本發明的營養組合物中存在單個類型的蛋白胨，其中蛋白胨選自BP、E1P、大豆蛋白胨E110、VG100和VG200，且其中組合物中蛋白胨濃度約為重量比體積5％。在本發明另一個非常優選的實施方案中，在本發明的營養組合物中存在單個類型的蛋白胨，其中蛋白胨是VG100，且其中組合物中該蛋白胨濃度約為重量比體積2％。
在本發明的優選實施方案中，該組合物的pH在pH7至pH8之間。甚至更優選的是pH在約pH7.2至約pH7.4之間。
在另一個優選實施方案中，根據本發明的組合物經過滅菌，即，使該組合物不含任何自我復制的生物。可以通過本領域技術人員已知的標準方法實現滅菌，例如通過熱處理比如高壓滅菌。
根據本發明的組合物尤其對于培養溶組織梭菌細菌有用。本發明最優選的實施方案因此是額外包含溶組織梭菌細菌接種物的根據本發明的組合物。在此方面一樣優選的是使用根據本發明的組合物用于培養溶組織梭菌并由其分泌具有膠原酶活性的蛋白酶。
因此，本發明的另一方面是從溶組織梭菌產生一種或多種純化的具有膠原酶活性的蛋白酶的方法，包括步驟(a)提供具有溶組織梭菌細菌接種物的根據本發明的滅菌的組合物；(b)生長和培養該細菌，其中細菌將一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；(c)從液相分離細胞和其他特定物質，從而獲得培養物上清液；(d)從培養物上清液純化一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶；從而從溶組織梭菌產生一種或多種純化的具有膠原酶活性的蛋白酶。
本發明的另一方面是含有一種或多種來自溶組織梭菌、具有膠原酶活性的蛋白酶的培養物上清液，所述培養物上清液可通過下述方法獲得(a)提供具有溶組織梭菌細菌接種物的根據本發明的滅菌的組合物；(b)生長和培養該細菌，其中細菌將一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；(c)從液相分離細胞和其他特定物質；從而獲得含有一種或多種來自溶組織梭菌、具有膠原酶活性的蛋白酶的培養物上清液。根據本發明的培養物上清液是不僅包含膠原酶而且也包含其他分泌的蛋白質的復雜混合物。在本發明非常優選的實施方案中，在穩定期從液體培養物獲得上清液。
根據本發明的上清液可直接用于純化其中含有的一種或多種成分。備選地，可將上清液以例如冷凍形式儲存。然而，最優選的是儲存上清液的凍干物(lyophilizate)。因此，本發明的另一方面是根據本發明的上清液的凍干物。
通過代表其優選實施方案的下列項目更加詳細地描述本發明。
1.含有水、來自非哺乳動物源的蛋白胨和魚明膠的液體組合物。
2.根據項目1的組合物，其特征在于魚明膠選自高分子量魚明膠、來自魚的清潔可食物種的明膠、液體魚明膠及其混合物。
3.根據項目2的組合物，其特征在于魚明膠選自高分子量魚明膠、來自魚的清潔可食物種的明膠、及其混合物。
4.根據項目1至3任一項的組合物，其特征在于該組合物中魚明膠濃度在約2％至約10％之間，其中百分比在分離的魚明膠是干物質時指重量比體積，且在分離的魚明膠是液體物質時指體積比體積。
5.根據項目4的組合物，其特征在于魚明膠濃度在約3％至約8％之間。
6.根據項目1至5任一項的組合物，其特征在于非哺乳動物源蛋白胨不是魚蛋白胨。
7.根據項目6的組合物，其特征在于非哺乳動物源蛋白胨是植物產物。
8.根據項目7的組合物，其特征在于蛋白胨的植物源是選自大豆、蠶豆、豌豆、馬鈴薯及其混合物的植物源。
9.根據項目8的組合物，其特征在于蛋白胨選自來自豌豆的VG100植物蛋白胨No.1(VG100)、來自豌豆的VG200植物蛋白胨磷酸鹽肉湯(VG200)、TSB CASO-Bouillion無動物(TSB)、大豆蛋白胨No110木瓜蛋白酶消化物(SP6)、蠶豆蛋白胨(BP)、來自馬鈴薯的植物蛋白胨E1(E1P)及其混合物。
10.根據項目9的組合物，其特征在于該組合物包含兩種或更多不同蛋白胨，其中該組合物中植物蛋白胨總濃度在重量比體積約2％至約10％之間。
11.根據項目10的組合物，其特征在于植物蛋白胨總濃度在重量比體積約3％至約5％之間。
12.根據項目9的組合物，其特征在于蛋白胨選自BP、E1P、大豆蛋白胨E110、VG100和VG200，且其中組合物中的蛋白胨濃度約為重量比體積5％。
13.根據項目9的組合物，其特征在于蛋白胨為VG100，其中組合物中的蛋白胨濃度約為重量比體積2％。
14.根據項目1至13任一項的組合物，其特征在于該組合物的pH在pH7和pH8之間。
15.根據項目1至14任一項的滅菌的組合物。
16.根據項目15的組合物，另外包含溶組織梭菌細菌接種物。
17.根據項目15或項目16的組合物在培養溶組織梭菌并由其分泌具有膠原酶活性的蛋白酶中的用途。
18.產生溶組織梭菌液體培養物上清液的方法，所述上清液含有一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶，所述方法包括步驟 (a)提供根據項目16的具有接種物的滅菌的組合物； (b)生長并培養該細菌，從而細菌將一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶分泌到液相中； (c)將細胞和其他特定物質從液相分離，由此獲得培養物上清液； 從而產生具有一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶的培養物上清液。
19.從溶組織梭菌產生一種或多種純化的具有膠原酶活性的蛋白酶的方法，包括步驟 (a)提供根據項目16的具有接種物的滅菌的組合物； (b)生長并培養該細菌，從而細菌將一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶分泌到液相中； (c)將細胞和其他特定物質從液相分離，由此獲得培養物上清液； (d)從培養物上清液分離一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶；從而從溶組織梭菌產生一種或多種純化的具有膠原酶活性的蛋白酶。
20.培養物上清液，包含一種或多種來自溶組織梭菌的具有膠原酶活性的蛋白酶，可通過下述方法獲得 (a)提供根據項目16的具有接種物的滅菌的組合物； (b)生長并培養細菌，從而該細菌將一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶分泌到液相中； (c)將細胞和其他特定物質從液相分離； 從而獲得包含一種或多種來自溶組織梭菌的具有膠原酶活性的蛋白酶的培養物上清液。
提供下列實施例以幫助對本發明的理解，其真實范圍列舉在附加的權利要求中。應當理解可以在不背離本發明的精神的情況下在所述程序中進行修飾。
實施例1 一般工作條件 通常，在采用微生物學標準實驗室實踐的無菌條件下實施涉及細菌或細菌培養的所有工作步驟。厭氧培養在培養箱中于30℃溫度保持在氮氣氛中。在環境(即含氧)氣氛中于層流罩超凈臺下實施接種物的轉移。在本文件中所述的所有培養基均以高壓滅菌來滅菌。在高壓滅菌之前調節pH，如果沒有另外指出，所述pH在pH7.2-pH7.4范圍內。如果沒有另外指出，任何各自的培養基內均每1升加入1mM CaCl2。常規檢查高壓滅菌培養基等分試樣的pH變化。
實施例2 溶組織梭菌細菌的種子培養、種子庫和起子培養物 使用衍生自ATCC 21000的溶組織梭菌菌株BMTU 1175作為100ml體積的液體生長培養基的接種物，所述液體培養基由溶解于水中的3.7％的BHI和3.0％的G1組成，pH調節為pH7.2。將培養物在厭氧條件下溫育約26小時，直至578nm處光密度(＝OD578nm)達到5.6。將該液體培養物的1ml等分試樣密封在安瓿中，冷凍并儲存在液氮的氣相中。將該等分試樣作為以后用作起子培養物的最初種子庫。
通過用1ml種子庫安瓿內容物接種100ml含有5％[重量/體積]VG100的液體培養基，并將細菌在厭氧條件下于30℃溫育過夜或在37℃溫育約8小時，制備不同培養基中的生長實驗起子培養物。用約2-4ml之間的起子培養物各自接種如下文進一步描述的液體培養基(通常為100ml或200ml體積)。
實施例3 不同培養基中的溶組織梭菌培養 評價溶組織梭菌在不同生長培養基中的生長。將液體培養物在瓶中無攪拌地溫育。如果沒有另外指出，培養物的溫育持續40小時。在各個試驗的過程中在不同時間點，從培養物取出一個或多個樣品，且測定液體培養物的OD578nm、培養物上清液的pH、以及培養物上清液中的膠原酶蛋白水解活性(見實施例4)。
使用表1a和1b中列出的成分制備液體培養基。如果沒有另外指出，以百分比給出的成分濃度指重量比體積[w/v]％，在高壓滅菌前調整。例如，給定化合物的濃度3％[w/v]對應于3g/100ml培養基。對于液體成分G4的情況，以百分比給出的濃度指體積比體積％。
如果沒有另外指出，在高壓滅菌前將pH調整在pH7.2-pH7.4范圍內。如果沒有另外指出，任何各自的培養基中均每1升加入1mMCaCl2。
表1a 生長培養基中測試的可商業獲得的蛋白胨化合物
表1b 生長培養基中測試的可商業獲得的明膠


Roche Applied Science(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國)的重組產生的胰蛋白酶。
實施例4 確定膠原酶蛋白水解活性的測定 使用合成肽底物通過標準方法以Wuensch單位(Wuensch，E.，Heidrich，H.，Z.，Physiol.Chem.333(1963)149-159)測量膠原酶蛋白水解活性。膠原酶蛋白水解活性催化經過修飾的底物(“Wuensch”)肽4-苯偶氮基-芐氧羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg(Bachem M1715)在Leu和Gly殘基之間的水解。將在25℃、pH7.1下每分鐘水解1μM肽定義為一個活性單位(U)。
將底物肽(也稱為“底物”)在溶液中且以1mg/ml的濃度提供。首先將10mg底物肽溶解在0.2ml甲醇中。通過加入0.1M TrisHCl，pH7.1將溶液體積增加到10ml。其他試劑是0.1M CaCl2水溶液和由5體積份乙酸乙酯和一體積份0.025M檸檬酸水溶液組成的提取混合物。作為含有0.35-0.4g(NH4)2SO4的試管提供干燥管。使用前以石蠟膜將干燥管密封。
根據下列移液方案和工作流程在試管中設立對照和樣品反應 步驟溶液 對照試管 樣品試管 1 底物肽 1ml 1ml CaCl2 0.2ml0.2ml 混合，加溫到25℃ 2 樣品材料

-0.05ml 0.1M TrisHCl，pH7.10.05ml - 混合，于25℃溫育15分鐘；溫育后，將溫育的溶液的等分試樣轉移到一個體積的提取混合物中 3步驟2溫育的溶液 0.5ml 0.5ml 提取混合物 6ml 6ml 通過渦旋20秒立即混合，將約3ml乙酸乙酯相轉移到干燥管中，通過渦旋混合并轉移上清液到杯中；在320nm測量消光(A)，杯光程＝1cm。
4計算體積活性[U/ml]＝ΔA*d*0.794 A測量的消光值 d稀釋因子 ΔA＝A樣品-A對照

含有一種或多種具有膠原酶蛋白水解活性的酶的溶液。如果需要，通過稀釋該溶液制備用于測定中的樣品材料。對于每次測量，為了最終導致在0.3至1.0之間的消光值，調整并選擇各自的稀釋因子(d)。然而，通常測定沒有細菌細胞和碎片的未經稀釋的培養物上清液。另外，測試具有已知量膠原酶和已知活性的標準作為參考。
當使用Wuensch肽作為底物實施活性測定時，在含有膠原酶I型和II型酶的混合物中，膠原酶II的測量的活性一般大于膠原酶I的活性。因此，在應用的條件下，任何測量的蛋白水解活性主要反映膠原酶II型。
實施例5 溶組織梭菌在不同培養基中的生長不添加明膠的基于蛋白胨的培養基 表2提供了溶組織梭菌培養的許多培養基。該表每個條目顯示各個培養基的成分。在一些情況下，在培養基滅菌和接種前調節pH。對于沒有將pH值列表的情況，如果沒有另外指出，以KOH調整pH至pH7.2和pH7.4之間的值后，接種培養基。將培養物培養到穩定期，對應于在標準條件下溫育約40小時。在培養終止時確定578nm的光密度(也稱為“OD”)，以及培養物上清液中的膠原酶酶促活性(見實施例4)。在表中以每升培養基的Wuensch單位給出體積活性(在列表數據中也稱為“U/l”)。
表2 液體培養基接種前的組成和pH、溶組織梭菌生長得率和培養物上清液中膠原酶活性；根據膠原酶體積活性排列培養基 指出在僅含有蛋白胨(即沒有加入任何明膠)的培養基中，BHI在刺激溶組織梭菌膠原酶向培養物上清液中的分泌是最有效的。也發現膠原酶的體積活性不僅僅是培養物OD的函數。
實施例6 溶組織梭菌在不同培養基中的生長有明膠的基于蛋白胨的培養基 將來自不同來源的不同類型明膠加入蛋白胨培養基。表3提供了溶組織梭菌培養的許多培養基。該表每個條目顯示各個培養基的成分。在一些情況下，在培養基滅菌和接種前調節pH。對于沒有將pH值列表的情況，如果沒有另外指出，以KOH調整pH至pH7.2和pH7.4之間的值后，接種培養基。將培養物培養到穩定期，對應于在標準條件下溫育約40小時。在培養終止時確定578nm的光密度(也稱為“OD”)，以及培養物上清液中的膠原酶酶活性(見實施例4)。在表中以每升培養基的Wuensch單位給出體積活性(在列表數據中也稱為“U/l”)。
表3 液體培養基接種前的組成和pH、溶組織梭菌生長得率和培養物上清液中膠原酶活性；根據膠原酶體積活性排列培養基



以NH4OH調節pH $以KOH調節pH 注意到，具有某種植物蛋白胨與魚明膠的組合的組合物，在膠原酶體積活性方面至少等于并通常高于含有3.7％BHI和3％G1的標準培養基，所述BHI和G1均來自哺乳動物源。因此，提供多種新培養基以用于生長和培養溶組織梭菌，并從這類培養物的上清液產生膠原酶蛋白酶。
權利要求
1.液體組合物，所述液體組合物包含水、魚明膠和來自非哺乳動物源的蛋白胨，其中不包括魚蛋白胨。
2.根據權利要求1的組合物，其特征在于所述魚明膠選自高分子量魚明膠、來自魚的清潔可食物種的明膠、液體魚明膠、及其混合物。
3.根據權利要求1和2任一項的組合物，其特征在于該組合物中魚明膠濃度在約2％至約10％之間，其中百分比在分離的魚明膠是干物質時指重量比體積，且在分離的魚明膠是液體物質時指體積比體積。
4.根據權利要求1至3任一項的組合物，其特征在于所述非哺乳動物源蛋白胨是植物產物。
5.根據權利要求4的組合物，其特征在于所述蛋白胨的植物源是選自大豆、蠶豆、豌豆、馬鈴薯及其混合物的植物源。
6.根據權利要求5的組合物，其特征在于該組合物包含兩種或更多不同的蛋白胨，其中該組合物中植物蛋白胨總濃度在重量比體積約2％至約10％之間。
7.根據權利要求6的組合物，其特征在于所述蛋白胨選自BP、E1P、大豆蛋白胨E110、VG100和VG200，其中組合物中的蛋白胨濃度約為重量比體積5％。
8.根據權利要求6的組合物，其特征在于所述蛋白胨為VG100，其中組合物中的蛋白胨濃度約為重量比體積2％。
9.根據權利要求1至8任一項的組合物，其特征在于該組合物的pH在pH7和pH8之間。
10.根據權利要求1至9任一項的滅菌的組合物。
11.根據權利要求10的組合物，另外包含溶組織梭菌細菌接種物。
12.根據權利要求10或權利要求11的組合物在生長和培養溶組織梭菌并由其分泌具有膠原酶活性的蛋白酶中的用途。
13.產生溶組織梭菌液體培養物上清液的方法，所述上清液含有一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶，所述方法包括步驟
(a)提供具有溶組織梭菌細菌接種物的根據權利要求10的滅菌的組合物；
(b)生長并培養該細菌，其中細菌將一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；
(c)從液相分離細胞和其他特定物質；
從而產生具有一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶的培養物上清液。
14.培養物上清液，其包含一種或多種來自溶組織梭菌的具有膠原酶活性的蛋白酶，可通過下述方法獲得
(a)提供具有溶組織梭菌細菌接種物的根據權利要求10的滅菌的組合物；
(b)生長并培養該細菌，從而該細菌將一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；
(c)從液相分離細胞和其他特定物質；
從而獲得包含一種或多種來自溶組織梭菌的具有膠原酶活性的蛋白酶的培養物上清液。
15.從溶組織梭菌產生一種或多種純化的具有膠原酶活性的蛋白酶的方法，包括步驟
(a)提供具有溶組織梭菌細菌接種物的根據權利要求10的滅菌的組合物；
(b)生長并培養該細菌，其中細菌將一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；
(c)從液相分離細胞和其他特定物質，由此獲得培養物上清液；
(d)從培養物上清液分離一種或多種具有膠原酶活性的蛋白酶。
從而從溶組織梭菌產生一種或多種純化的具有膠原酶活性的蛋白酶。
全文摘要
本發明涉及無哺乳動物源成分的溶組織梭菌生長培養基。本發明提供了溶組織梭菌培養的改進的培養基以及用于膠原酶生物技術生產的培養物上清液。根據本發明的營養培養基包含一種或多種來自非哺乳動物源的蛋白胨，優選植物衍生的蛋白胨。該培養基可以另外包含魚明膠。本發明提供了培養基、含有溶組織梭菌膠原酶的培養物上清液、以及產生所述膠原酶的方法。
文檔編號C12N9/52GK101603020SQ200910149229
公開日2009年12月16日 申請日期2009年6月10日 優先權日2008年6月11日
發明者W·霍爾克, A·霍夫曼, T·馬克斯, K·桑, B·蘇普曼, J·-P·薩爾霍弗 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司