專利名稱：血液基因組磁珠小提試劑盒及其提取方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，特別是提供了一種血液基因組磁珠小提試劑盒及其提取方法，快速小量提取血液基因組DNA的試劑盒。
背景技術：
DNA作為遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象。提取基因組DNA是許多分子生物學實驗的基礎，為了進行諸如基因組測序，Southern雜交(包括RFLP)、基因的PCR分離、構建BAC文庫等常規操作試驗中，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提。隨著分子生物學技術的深入發展，在基因水平上對疾病進行診斷已經成為臨床診斷技術的一項基本技術手段。尤其是法醫學中的個體識別、親子鑒定等，對提取基因組DNA的完整性及純度要求會更高，因為其基因組DNA用量不高，開發出快速小量提取基因組DNA試劑盒，就可以達到快速檢測的目的。
由于血液取材方便可靠，因此上述研究通常是從血液中提取完整的基因組DNA。簡單地說，基因組DNA提取有以下幾個原則1、保證提取的DNA具有一定的長度；2、純化后不應存在對酶有抑制作用的物質；3、排除有機溶劑和金屬離子的污染；4、蛋白質，多糖，脂類等降低到最低程度；5、排除其他核酸分子的污染。目前的血液基因組提取方法有傳統的苯酚氯仿抽提法、蛋白酶/SDS法、以及基于介質的Silica吸附柱法和磁性微粒(磁珠)法等等。隨著商品化DNA提取試劑盒的使用，尤其針對小樣品量的基因組提取可以完全取替了傳統苯酚氯仿抽提的方法，而磁性微粒(磁珠)法以其獨有的優勢正在被越來越多的人廣泛接受。
基于磁性微粒(磁珠)的DNA提取技術是利用親水性磁性微粒(磁珠)吸附樣品溶液中的DNA分子，在外加磁場作用下將吸附DNA的磁性微粒(磁珠)從樣品溶液中分離出來，經適當清洗后，加入適當的溶液使得DNA從磁性微粒上(磁珠)脫附即得到純凈的DNA。基于磁性微粒(磁珠)的提取方法使得DNA提取過程大為簡化，不僅可以在常規的試管中以手工方式進行，也可以在96孔或382孔微孔板中以自動化方式進行，已經在歐美國家獲得了廣泛的應用。磁性微粒(磁珠)法DNA提取試劑盒以其操作簡便快捷和省時省力的特點，將會成為目前分子生物學和臨床醫學研究的理想的輔助工具。
發明內容
本發明的目的在于提供一種血液基因組磁珠小提試劑盒及其提取方法，基于磁珠提取血液基因組DNA的試劑盒。特別針對小樣品量(50-200微升)的全血材料，無需對紅細胞進行預處理直接裂解全血細胞，通過細胞蛋白沉淀液去除大部分血紅蛋白及其它雜質，再利用單分散磁性微球特異性吸附基因組DNA，僅需簡單的漂洗步驟后，就可以將磁性微球上的基因組DNA洗脫下來。本試劑盒提取的基因組DNA產量高、純度好、片段完整，適合于PCR檢測、酶切反應、核酸雜交等下游試驗。
本發明的試劑盒包括細胞裂解液、RNA酶工作液、細胞蛋白沉淀液、磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液等七種組分，各組分內容如下 細胞裂解液10-20mmol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)鹽，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合劑、50-100mmol/L Na鹽、質量濃度2-4％的SDS(十二烷基硫酸鈉)和終濃度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K； RNA酶工作液為核糖核酸酶A，其終濃度10-20mg/mL； 細胞蛋白沉淀液5-8mol/L胍鹽、0.5-2mol/L Na鹽、1-3mol/LKAC(醋酸鉀)、4-6mol/L HAC(醋酸)，PH值5.0-6.0； 磁珠粒徑1-2μm的單分散磁性微球； 異丙醇分析純的異丙醇； 漂洗液10-20mmol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)，PH值8.0-9.0、100-200mmol/L Li鹽、1-4mmol/L螯合劑與無水乙醇按1∶3-5的體積比混合而成； DNA洗脫液10-20mmol/LTris(三羥甲基氨基甲烷)鹽，PH7.5-8.5。
本發明上述試劑盒的提取方法步驟如下 取添加抗凝劑的新鮮血液200μl，加細胞裂解液150-300μl，混勻，55-70℃、15min；加入5-15μl RNA酶工作液，25～35℃放置5-10min；加細胞蛋白沉淀液250-400μl，上下顛倒數次，離心12000r/min，3-5min，貼近溶液上表面小心吸取350-700μl上清，放到另一離心管中；依次加入10-20μl磁珠、200-400μl異丙醇，水平轉動1～1.5min；磁分離25～35s，吸去上清，加漂洗液600-800μl，重懸磁珠核酸復合物，清洗2-3次；放在磁分離器上盡量吸去乙醇，室溫～37℃放置數分鐘，直至聞不到酒精氣味；加50-80μl DNA洗脫液，至離心管于55-65℃水浴鍋中5-10min，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30-40s，小心吸取上清于另一離心管中，備用或-20℃儲存。
本發明具有以下優點 本試劑盒操作簡便、無需對紅細胞進行預處理直接裂解全血細胞、快速提取1h即可完成操作； 本試劑盒不使用苯酚氯仿等有機試劑，對操作人員無毒副作用； 本試劑盒提取的基因組DNA，在純度有保證的情況下，DNA產率更高、片段更完整。
圖1為兩種試劑盒提取DNA瓊脂糖電泳比較。
具體實施例方式 小鼠、人抗凝全血基因組DNA提取 實驗材料采集新鮮的小鼠、人血液樣本1mL，添加適量的抗凝劑EDTA鉀鹽，充分混勻后，于4℃備用。
基因組DNA提取步驟取添加抗凝劑的新鮮血液200μl，加細胞裂解液200μl，混勻，58℃、15min；加入10μl RNA酶工作液，室溫放置5-10min；加細胞蛋白沉淀液350μl，上下顛倒數次，離心12000r/min，3min，貼近溶液上表面小心吸取350μl上清，放到另一離心管中；依次加入20μl磁珠、200μl異丙醇，水平轉動1min；磁分離30s，吸去上清，加漂洗液750μl，重懸磁珠核酸復合物，清洗2次；放在磁分離器上盡量吸去乙醇，37℃放置數分鐘，直至聞不到酒精氣味；加50μl DNA洗脫液，至離心管于65℃水浴鍋中10min，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30s，小心吸取上清于另一離心管中，備用或-20℃儲存。
試劑盒提取步驟 取抗凝全血100-250μl至1.5ml的EP管中，加入4倍體積的RBL Buffer，上下顛倒充分混合均勻，室溫孵育5min。(2)孵育結束后，3000rpm離心10min；棄上清，留取底部細胞團塊(少量殘留的紅細胞不影響后續操作)。(3)加入50μl Pre-Lysis buffer用槍頭充分吹打松散，無可見細胞團快(重要)。(4)加入600ul gDNA Extraction Buffer上下顛倒混合均勻，室溫放置10min，使溶液變為透明狀，無可見細胞團快，必要時延長孵育時間(重要)。(5)將上述溶液加入到離心柱中，13000rpm離心5min。(6)棄收集管中液體，向離心柱中加入500μl Washing Buffer(確認已經加入無水乙醇)，13000rpm離心1min。(7)重復步驟6一次。(8)取出內套管，棄去外套管中液體，仍然套回內套管，不加洗液，13000rpm空離2min。(9)將內套管移入新的eppendorf管中，室溫靜置1min，使殘留乙醇揮發，在膜中央加入Elution Buffer 40-100μl，室溫靜置1min，12,000rpm離心2min，獲得基因組DNA。
結果分析 提取的基因組DNA產量及純度檢測 分別吸取200μl新采集的小鼠、人抗凝全血，使用本試劑盒和A公司試劑盒進行基因組DNA的提取，得到的基因組DNA經紫外分光光度計檢測260nm及280nm的吸光度值，DNA純度用OD260nm/OD280nm比值來衡量(1.8-2.0)、DNA濃度(μg/mL)＝OD260nm*稀釋倍數*50、DNA產量＝DNA濃度*洗脫體積。
表1.兩種試劑盒提取DNA結果比較
從表1可以看出兩種試劑盒提取得到的基因組DNA純度上來說，都達到了一定的要求，OD260nm/OD280nm比值都在1.8-1.9之間，A公司試劑盒結果要略好一些，但本發明所得的DNA產量明顯提高，為A公司試劑盒DNA產量的1.5倍左右。
基因組DNA片段完整性檢測 分別取2μl提取的基因組DNA，于0.8％的瓊脂糖凝膠上100V電壓，電泳15min，用紫外凝膠成像系統進行照相，如圖1所示。
從圖1可以看到，兩種試劑盒提取得到的基因組DNA片段都在23Kb以上，A公司試劑盒提取得到的基因組DNA片段大約30Kb左右，而本試劑盒提取得到的基因組DNA片段在50Kb以上。
權利要求
1.一種血液基因組磁珠小提試劑盒，試劑盒包括細胞裂解液、RNA酶工作液、細胞蛋白沉淀液、磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液七種組分
細胞裂解液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合劑、50-100mmol/L Na鹽、質量濃度2-4％的十二烷基硫酸鈉和終濃度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；
RNA酶工作液為核糖核酸酶A，其終濃度10-20mg/mL；
細胞蛋白沉淀液5-8mol/L胍鹽、0.5-2mol/LNa鹽、1-3mol/L醋酸鉀、4-6mol/L醋酸，PH值5.0-6.0；
磁珠粒徑1-2μm的單分散磁性微球；
異丙醇分析純的異丙醇；
漂洗液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，PH值8.0-9.0、100-200mmol/L Li鹽、1-4mmol/L螯合劑與無水乙醇按1∶3-5的體積比混合而成；
DNA洗脫液10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽，PH8.0。
2.一種權利要求1所述試劑盒的提取方法，其特征在于，工藝步驟為取添加抗凝劑的新鮮血液200μl，加細胞裂解液150-300μl，混勻，55-70℃、15min；加入5-15μl RNA酶工作液，25～35℃放置5-10min；加細胞蛋白沉淀液250-400μl，上下顛倒數次，離心12000r/min，3-5min，貼近溶液上表面小心吸取350-700μl上清，放到另一離心管中；依次加入10-20μl磁珠、200-400μl異丙醇，水平轉動1～1.5min；磁分離25～35s，吸去上清，加漂洗液600-800μl，重懸磁珠核酸復合物，清洗2-3次；放在磁分離器上盡量吸去乙醇，室溫～37℃放置數分鐘，直至聞不到酒精氣味；加50-80μl DNA洗脫液，至離心管于55-65℃水浴鍋中5-10min，以完全洗脫基因組DNA；磁分離30-40s，小心吸取上清于另一離心管中，備用或-20℃儲存。
全文摘要
一種血液基因組磁珠小提試劑盒及其提取方法，屬于分子生物學技術領域。試劑盒包括細胞裂解液、RNA酶工作液、細胞蛋白沉淀液、自研磁珠、異丙醇、漂洗液、DNA洗脫液七種組分。特別針對50-200微升小樣品量的全血材料，無需對紅細胞進行預處理直接裂解全血細胞，通過細胞蛋白沉淀液去除大部分血紅蛋白及其它雜質，再利用單分散磁性微球特異性吸附基因組DNA，僅需簡單的漂洗步驟后，就可以將磁性微球上的基因組DNA洗脫下來。本試劑盒提取的基因組DNA產量高、純度好、片段完整，適合于PCR檢測、酶切反應、核酸雜交等下游試驗。
文檔編號C12P19/34GK101812444SQ201010153890
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者陳丹, 陳海生, 張華英, 陳寶俊 申請人:北京博邁世紀生物技術有限公司