專利名稱：一株抗苜蓿病害灰黃鏈霉菌及其篩選方法
技術領域：
本發明屬微生物技術領域，具體涉及一株抗苜蓿病害灰黃鏈霉菌及其篩選方法。
背景技術：
自上世紀50年代以來，大量廣泛使用化學農藥造成病原菌對化學農藥產生抗性， 高殘留引起環境污染，以及化學農藥對人畜產生毒害等加速了人們尋求新的、安全有效的 植物病害防治途徑。在防治植物病害的各種措施中，生物防治具有對環境、生態和人類健康 較為安全的優點，因此，世界各國十分的重視生防微生物研究的開展和利用。生防微生物具 有不易使病原菌產生耐藥性、對環境安全、生產工藝較簡單以及不少微生物同時具有促進 作物生長的特點而引起人們的關注和重視，它將在病害防治中發揮越來越重要的作用。利 用拮抗微生物對病原菌的抗生作用、營養和空間競爭、重寄生作用及其誘導植物產生的系 統抗病性等作用，來防治植物病害是植物病害生物防治的一個最重要的組成部分。在植物 病害的生物防治中，放線菌是眾多拮抗微生物中最具競爭能力的生防菌之一，放線菌由于 能產生化學結構多樣的具有抗生素活性的代謝產物而廣泛應用于農業生物防治中。自Cohn(1872)發現放線菌至今，已經報道了 69個屬1687種。在已知的放線菌中， 半數以上發現具拮抗性，其中應用于生物防治的主要是鏈霉菌屬Str印tomyces的一些種 類，其次有諾卡菌屬Nocardia、游動放線菌屬Actinoplanes、小單孢菌屬Micromonospora 等。近10年來從微生物中發現的新活性物質中放線菌產生占70%以上，生防放線菌的篩選 和應用已成為植物病理學領域的研究重點。放線菌對靶標菌發揮生防作用一般通過兩種途徑在寄主體外通過抗生作用、競 爭作用、捕食和重寄生作用，導致病原菌的致病性及侵染效率降低；放線菌也可在寄主植物 組織內，誘發其產生抗性或者產生抑菌物質，影響病原菌的生長、繁殖，最后導致其死亡。利用放線菌防治植物病害，特別是土傳病害已有許多成功事例。早在1950年， Cooper V E就發現放線菌對甘蔗根腐病Fusarium arrkenomnes有顯著的拮抗作用。用放線 菌的孢子和菌絲制成的活細胞制劑，具有無毒、無殘留、不傷害非靶標微生物、與環境兼容 性好、防病持效期長等優點。世界上已廣泛應用的放線菌活體制劑Mycostop，就是由芬蘭的 Kemira(1989)從泥煤中分離到的灰綠鏈霉菌S. griseovidis的孢子和菌絲制成的活細胞 制劑，主要用來防治鐮孢菌Fusarium sp.、疫霉菌Phytophthora sp.和絲核菌Rhizoctonia sp.等一些常見的土傳病原菌，通過種子處理、土壤噴灑或灌根等措施處理后，Mycostop可 在植物根部定殖、生長和繁殖，阻止病原菌的侵入，并可產生激素促進寄主植物的生長，從 而提高作物的產量。1953年中國科學院用從我國陜西涇陽縣苜蓿根土中分離獲得的細黃鏈 霉菌Str印tomycesmicroflavus制成的“5406”抗生菌推廣的面積最大。通過拌種將其施 于田間，具有防病、保苗和增產的效應。近年來，國內外已對辣椒疫病、棉花立枯病、棉花枯萎病、黃瓜枯萎病、小麥全蝕 病、香蕉枯萎病及大豆疫霉根腐病等土傳病害的拮抗放線菌篩選與生防應用等進行了研 究。Mark A. Roberts (2001)分離、篩選出700株具有抑制和殺滅多種植物病原菌能力的放
5線菌，尤其對真菌引起的根部病害效果顯著。易龍等從辣椒根際土壤中分離篩選出對辣椒 疫病有較強拮抗作用的放線菌7株，其中菌株CQ21-3的溫室盆栽控病效果達73. 2% ；宗兆 鋒等從土壤中分離的58株放線菌篩選出了 2株對棉花立枯病、黃萎病有較好的防治作用 的幾丁質酶產生菌；潘榮光等從208株放線菌篩選出對黃瓜枯萎病菌有拮抗性菌株12株， 其中菌株PM-1的抑菌譜廣，對靶標菌菌絲有明顯致畸作用；喬宏萍等從新疆保護地蔬菜和 棉田采集的土樣中分離篩選12株對小麥全蝕病具有拮抗作用的放線菌，3株抑菌效果達到 80%以上，防病促生作用明顯；曹理想等(2003)對香蕉內生放線菌進行分析發現，玫瑰淺 灰鏈霉菌對尖孢鐮刀菌有明顯的拮抗活性。此外，放線菌產生的抗生素廣泛應用于工業、農業和醫學領域，很大一部分在在農 作物病蟲害防治方面也起著至關重要的作用，并取得了巨大的社會效益、經濟效益和生態 效益。由于其具有無污染、無殘留、可再生、不易使有害生物產生抗藥性、成本低、易于產業 化等特點已成為無公害農藥的主體和未來農藥的發展方向之一。鑒于放線菌及其代謝產物 在防治病害、促進作物的生長、提高作物產量等方面的重要作用，正越來越多地被人們開發 和應用。苜蓿Medicago sativa L.是重要的優質豆科牧草，被譽為“牧草之王”，兼具改良 土壤、減少水土流失等生態功能，在我國西部生態建設中具有重要作用。近年來，隨著作物 布局、氣候條件與生態環境的變化，以及苜蓿生產中的品種單一化與多年連作，為病害的發 生與流行創造了條件。苜蓿根腐病普遍發生于各苜蓿栽培區，由其引發的苜蓿草地衰退導 致其利用期縮短，該病已成為苜蓿生產的主要限制因素之一。如何對該病害進行科學有效 的防治，使苜蓿人工草地最大限度地發揮生產、經濟和社會效益，已成為越來越迫切需要解 決的問題。對苜蓿根腐病的防治目前主要依靠選育抗性品種和化學藥劑加以控制。但目前 生產中缺乏真正有效的抗病品種，或者是抗病品種的抗病性極易喪失。化學殺菌劑的過量 應用易使病原菌抗藥性，草產品農藥殘留超標，生態環境污染加重，致使其應用受到局限。 因此符合環保、健康要求的生物農藥的研究與應用日益受到關注。為開發拮抗放線菌殺菌劑，需建立一套有效的篩選模型對大量的放線菌菌株進行 結果可靠的抗活性篩選。現有技術中，大多只采用平板抑菌實驗法(如平板對峙法、抑菌 圈法、牛津杯法、管碟法、挖塊法、瓊脂塊法或濾紙片法)、孢子萌發法等單一離體篩選模型 對活性菌株進行篩選，其篩選結果不可靠，使得后續研究結果不能真正服務于農業生產。因 此，需要尋找更加有效的拮抗放線菌篩選方法。
發明內容
本發明的一個目的是提供一株灰黃鏈霉菌。本發明所提供的灰黃鏈霉菌菌株為灰黃鏈霉菌(Str印tomyces griseoflavus) NMG6-3-9，其保藏編號為 CGMCC No. 3441。該菌株已于2009年11月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所， 郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 3441。該菌株的分類命名為灰黃鏈霉菌(Streptomyces griseof lavus)，菌株名稱為 NMG6-3-9。本發明的另一個目的是提供一種菌的拮抗劑。
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本發明所提供的菌的拮抗劑，其活性成分為灰黃鏈霉菌 (Streptomycesgriseoflavus)NMG6-3-9 CGMCC No. 3441 ；所述菌為苜蓿茄鐮孢菌Fusarium solmi、苜蓿尖鐮孢菌Fusarium oxysporum、燕麥德抱菌 Fusarium avenaceum、苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum、 立枯絲核菌 Rhizoctonia solani、禾谷鐮孢菌 Peronospora aestivalis、半裸鐮 刀菌 Fusariumsemitectum、香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense、瓜果 腐霉 Pythiumaphanidermatum、苜猜殼針抱 Septoria medicaginis、瓜類殼二抱 Ascochytacitrullina、大 HI3 輪枝抱 VerticiIlium dahlia、禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis、膠抱炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides、禾彎抱霉菌 Curvularia lunata、大斑突贓抱 Exserohilumleonard turcicum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、灰葡萄抱 Botrytis cinerea、核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum、粉紅聚端 孢Trichothecium roseum、丁香假單胞菌Pseudomonas syringae、胡蘿卜軟腐歐文氏 菌 Erwinia carotovora var. carotovora、首猜黃單胞桿菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae、青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum、禾P/或燕麥嗜酸菌西瓜亞種 Acidovorax avenae subsp. citrulli、禾口 / 或金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureaus。上述拮抗劑中，所述燕麥鐮孢菌Fusarium avenaceum為燕麥鐮孢菌 Fusariumavenaceum ACCC 30065，所述立枯絲核菌 Rhizoctonia solani 為立枯絲核菌 Rhizoctonia solani ACCC 30332，所述禾谷鐮孢菌 Peronospora aestivalis 為禾谷鐮孢 菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068，所述半裸德刀菌 Fusariumsemitectum 為半裸 德刀菌 Fusarium semitectum ACCC 31945，所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 為香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubenseACCC 36369，所述瓜果腐霉 Pythium aphan i derma turn 為瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum ACCC 36125，所述瓜類殼 二孢 Ascochyta citrullina 為瓜類殼二孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440，所述大麗 輪枝孢 Verticillium dahlia 為大麗輪枝孢 Verticillium dahlia ACCC 36109，所述禾頂 囊殼 Gaeumannomycesgraminis 為禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310，所述 禾彎孢霉菌Curvularia lunata為禾彎孢霉菌Curvularia lunata ACCC 36580，所述辣
Phytophthora capsiciPhytophthora capsici ACCC 36279, Bf
述灰葡萄孢Botrytis cinerea為灰葡萄孢Botrytis cinerea ACCC 30091，所述核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum 為核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC30096，所述粉紅 聚端孢 Trichothecium roseum 為粉紅聚端孢 Trichothecium roseumACCC 36459，所述古月 蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora為胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora ACCC 01443，所述青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum為 青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearumACCC 01470，所述金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureaus 為金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。灰黃鏈霉菌(Str印tomycesgriseoflavus)NMG6-3-9 CGMCC No. 3441 在制備如下 菌中至少一種菌的拮抗劑中的應用也屬于本發明的保護范圍苜猜前鐮孢菌Fusarium solani、苜猜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum、燕麥鐮孢 菌 Fusarium avenaceum、苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum、立枯絲核菌 Rhizoctonia solani、禾谷德抱菌 Peronospora aestivalis、半裸德刀菌 Fusariumsemitectum、香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、 苜猜殼針孢Septoria medicaginis、瓜類殼二孢Ascochytacitrullina、大麗輪枝孢 Verticillium dahlia、禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis、膠抱炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides、胃 胃 Curvularia lunata^ 大■突 M f包 Exserohilumleonard turcicum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、灰葡萄抱 Botrytis cinerea、核盤 菌 Sclerotinia sclerotiorum、粉紅聚端抱 Trichothecium roseum、丁香假單胞菌 Pseudomonas syringae、古月蘿卜軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora var. carotovora、 苜猜黃單胞桿菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae、青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum、禾口/或燕麥嗜酸菌西瓜亞禾中Acidovorax avenae subsp. citrulli、禾口/或金 胃王求胃 Staphylococcusaureauso上述應用中，所述燕麥鐮孢菌Fusarium avenaceum為燕麥鐮孢菌 Fusariumavenaceum ACCC 30065，所述立枯絲核菌 Rhizoctonia solani 為立枯絲核菌 Rhizoctonia solani ACCC 30332，所述禾谷鐮孢菌 Peronospora aestivalis 為禾谷鐮孢 菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068，所述半裸德刀菌 Fusariumsemitectum 為半裸 德刀菌 Fusarium semitectum ACCC 31945，所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 為香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubenseACCC 36369，所述瓜果腐霉 Pythium aphan i derma turn 為瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum ACCC 36125，所述瓜類殼 二孢 Ascochyta citrullina 為瓜類殼二孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440，所述大麗 輪枝孢 Verticillium dahlia 為大麗輪枝孢 Verticillium dahlia ACCC 36109，所述禾頂 囊殼 Gaeumannomycesgraminis 為禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310，所述 禾彎孢霉菌Curvularia lunata為禾彎孢霉菌Curvularia lunata ACCC 36580，所述辣
Phytophthora capsiciPhytophthora capsici ACCC 36279, Bf
述灰葡萄孢Botrytis cinerea為灰葡萄孢Botrytis cinerea ACCC 30091，所述核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum 為核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC30096，所述粉紅 聚端孢 Trichothecium roseum 為粉紅聚端孢 Trichothecium roseumACCC 36459，所述古月 蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora為胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora ACCC 01443，所述青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum為 青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearumACCC 01470，所述金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureaus 為金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。本發明的最后一個目的是提供一種篩選拮抗苜蓿根腐病的放線菌的方法。本發明所提供的篩選拮抗苜蓿根腐病的放線菌的方法，包括如下步驟1)從待分離樣品中得到純培養放線菌；2)用平板對峙法、抑菌圈法、牛津杯法、管碟法、挖塊法、瓊脂塊法或濾紙片法，從 步驟1)中所述純培養放線菌中篩選對靶標菌具有拮抗作用的放線菌菌株，得到拮抗靶標 菌的放線菌菌株；所述靶標菌為引起苜蓿根腐病的菌；3)用孢子萌發法，從步驟2)中所述拮抗靶標菌的放線菌菌株中篩選抑制所述靶 標菌孢子萌發的放線菌菌株，得到抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株；4)用溫室盆栽活體法對步驟3)得到的放線菌菌株進行檢測，得到拮抗苜蓿根腐 病的放線菌。
上述方法中，所述溫室盆栽活體法包括如下步驟a)發酵培養所述抑制所述靶標 菌孢子萌發的放線菌菌株，得到含有所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株的發酵 液，將所述含有所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株的發酵液接種于土壤中，得到 土壤和所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株的混合物；b)將苜蓿種子接種于步驟 a)中所述混合物中，培養；c)待所述苜蓿種子出苗30d后，用所述靶標菌的孢子懸浮液進行 傷根接菌，繼續培養，檢測防治率，防治率大于等于75%的放線菌菌株即為拮抗苜蓿根腐病 的放線菌。上述方法中，所述步驟a)中，所述土壤和所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌 菌株的混合物中所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株的濃度為108cfu/g ；和/或，所述步驟c)中，所述傷根接菌的接種量為106cfu/g 土壤。上述方法中，所述步驟3)中所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株為對所 述靶標菌孢子的萌發抑制率大于等于80%的放線菌菌株。上述方法中，所述靶標菌為苜蓿根腐病菌；所述苜蓿根腐病菌為苜蓿茄鐮孢菌 Fusarium solani、苜猜尖德抱菌 Fusarium oxysporum 或燕麥德抱菌 Fusariumavenaceum ； 所述待分離樣品為土壤。平板抑菌實驗中，本發明菌株對靶標菌苜蓿茄鐮孢菌Fusarium solmi的抑 菌圈直徑為32. 68mm;孢子萌發抑制實驗中，本發明菌株對靶標菌苜蓿茄鐮孢根腐病菌 (F.solmi)的抑制率為100% ；活體盆栽防病效果檢測實驗中，本發明菌株作用組，植株 病情指數為16. 35，發病率為39. 68%，防效為81. 50%，效果顯著好于對照組(井崗霉 素、發酵培養基、清水)。另外，本發明菌株具有廣譜的抗菌性，對如下菌均具有很好的 拮抗性苜蓿茄鐮孢根腐病菌F. solrni，苜蓿尖鐮孢根腐病菌F. oxysporum,燕麥鐮孢菌 F. avenaceum，苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum,立枯絲核菌 Rhizoctonia solani， 禾谷德刀菌F. graminearum，半裸德刀菌F. semitectum，香蕉枯萎菌F. oxysporum f. sp. cubense，瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum，苜猜殼針抱 Septoria medicaginis，瓜類殼 二抱 Ascochyta citrullina，大HI3輪枝抱 Verticilliumdahlia,禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis,I^Jfe^；Colletotrichumgloeosporioides,TR^Jfe^^Curvularia lunata， 大斑突Mf包 Exserohilumleonardturcicum,辣椒疫毒菌 Phytophthora capsici,灰葡萄 抱 Botrytis cinerea，核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum，粉紅聚端抱 Trichothecium roseum ；丁香假單胞菌Pseudomonas syringae，古月蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora,首猜黃單胞桿菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae，青枯雷爾氏菌 Ralstoniasolanacearum，燕麥嗜酸菌西瓜亞禾中 Acidovorax avenae subsp. citrulli，金黃
Staphylococcus aureaus0因此，本發明菌株對苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用，能夠用于生物防 治苜蓿根腐病及其它多種植物病害，在生物防治病害領域具有廣闊的應用前景。本發明 為苜蓿根腐病的生物防治奠定基礎，進而為該病生防放線菌制劑的研制與應用提供科學依 據。本發明屬植物病害生物防治技術領域。本發明將離體篩選模型(平板抑菌實驗 法、孢子萌發法)與活體篩選模型(溫室盆栽活體抑菌試驗)相結合，建立了一套結果可靠 的抗放線菌的篩選方法。本發明方法包括平板抑菌法初篩活性菌株步驟、孢子萌發法復篩活性菌株步驟，及室內盆栽活體試驗驗證步驟。首先采用平板抑菌法初篩出對靶標菌(苜 蓿根腐病菌)抑菌效果較強的活性放線菌菌株；其次用孢子萌發法復篩經初篩入選的活性 放線菌菌株，篩出對靶標菌孢子萌發抑制率> 80%以上的活性放線菌菌株；將孢子萌發法 篩選得到的活性放線菌菌株進行發酵培養，將活性菌株的發酵液接種于滅菌育苗土壤，在 盆栽供試苜蓿植株接種靶標菌(苜蓿根腐病菌)進行活體活性驗證，采用溫室活體防效試 驗篩選出防治效果好的抗苜蓿根腐病的放線菌。本方法篩選出的具有較好抗苜蓿根腐病活 性的放線菌菌株，入選菌株在抗離體及活體篩選模型上均具有高拮抗活性，為進一步探討 拮抗放線菌活性物質的分離、提純與應用提供了可靠結果。實驗證明，通過本發明的方法， 篩選到了一批具有較好抗活性的放線菌菌株，入選菌株在離體及活體模型上均具有較好活 性，為追蹤分離活性化合物提供了可靠結果。本方法結果可靠、還具有操作簡便、能快速有 效地篩選出防治苜蓿根腐病的放線菌等優點。
圖1為菌株NMG6-3-9氣生菌絲形態(光學顯微鏡下200 X)。圖2為菌株NMG6-3-9孢子形態(掃描電鏡下10000X)。圖3為菌株NMG6-3-9孢子絲形態(掃描電鏡下10000X)。圖4為依據16S rDNA基因序列構建的菌株NMG6-3-9的系統發育樹。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、菌株的分離與鑒定一、分離高氏1號培養基瓊脂15g、可溶性淀粉20g、NaCl 0. 5g、KN03 lg、 K2HP04 3H200. 5g、MgS04 7H20 0. 5g、FeS04 7H20 0. Olg、蒸溜水 lOOOmL，pH7. 2-7. 4。PDA瓊脂培養基馬鈴薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、蒸餾水lOOOmL、pH
值自然。苜蓿茄鐮孢菌(Fusarium solani)；(曹麗霞，趙存虎，白全江，等.內蒙古中部地 區苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].華北農學報，2008，23 (6) 105-107.)(一 )從土壤中分離得到放線菌純培養物采用稀釋平板分離法從采自內蒙古鄂爾多斯市境內毛烏素沙地土壤樣品中分離 菌株。采集土壤，將采集的土樣經自然風干，過篩，稱重。采用瓊脂平板稀釋法獲得土壤 中主要放線菌類群。具體方法將預處理的土壤樣品用無菌水稀釋成KTuoIUOAKT4、 10_5、10_6倍的懸浮液，置200r/min搖床振蕩5min，取0. 2mL上清液，用三角玻棒在制好在高 氏1號瓊脂平板上涂抹均勻。置于28°C恒溫培養箱中培養7-10d。觀察菌落生長情況，挑 取平皿中占優勢的菌落于試管中純化，將純化的單菌落轉接到高氏一號斜面上培養后，編 號保存，共計得到294株純培養放線菌。( 二)平板抑菌法初篩活性菌株
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苜蓿茄鐮孢菌(Fusarium solani)的培養方法將苜蓿茄鐮孢菌(F. solani)接種 于PDA培養基，于28°C恒溫培養箱中培養5-6d，得到苜蓿茄鐮孢菌菌餅。將分離到的294株放線菌分別接種于高氏1號瓊脂平板上于28°C下培養5d，待 長好后用打孔器將菌苔打成直徑5mm的菌餅，并將放線菌菌餅置于PDA平板中心，使帶有 菌絲的一面貼在培養基表面，3d后在距中心2. 5cm均勻反貼同樣大小4塊苜蓿茄鐮孢菌 (F. solani)菌餅，對峙接于放線菌周邊，每個菌株重復5次，25V下培養，觀察是否產生抑 菌(溶菌)圈，定期觀察、測量抑菌(溶菌)圈的直徑。采用十字交叉法測量抑菌(溶菌) 圈的直徑。根據直徑大小決定菌株的取舍。放線菌的拮抗性強度體現在其產生的抑菌(溶 菌)圈的直徑大小。放線菌的拮抗性強度統計標準R為拮抗圈直徑，分以下4個等級分類10mm < R彡20mm (拮抗性極強)，5mm < R彡10mm (拮抗性較強)，0mm < R彡5mm(拮抗性弱) 和R = 0(無拮抗性)。在以上標準下，選取拮抗性極強、較強的放線菌進行后續篩選。拮抗性即為放線菌對苜蓿根腐病菌的抗性。結果表明，此步驟中從294株菌中共篩選得到8株符合拮抗性要求的放線菌菌株， 其中3株為拮抗性極強，5株為拮抗性較強。上述平板抑菌實驗法初篩活性菌株采用常規的平板對峙法、牛津杯法、管碟法、挖 塊法、瓊脂塊法或濾紙片法等均可。(三)孢子萌發法復篩活性菌株1.苜蓿根腐病菌孢子懸浮液的制備PDA培養基馬鈴薯200g、葡萄糖(或蔗糖)10 20g、瓊脂17 20g、蒸餾水 1000mL, pH7. 0。將苜蓿茄鐮孢菌(Fusarium solani)接種于PDA培養基，于28°C恒溫培養箱中培 養5-6d，待菌絲長滿培養基后用無菌水洗去氣生菌絲，400nto日光燈照射下培養產孢，待 2-3d產孢后，用無菌水洗下孢子，經細菌過濾器無菌過濾除去菌絲并加入0. 02% Tween-20 制成孢子懸浮液在4°C下保存備用，孢子懸浮液中孢子濃度為106cfu/mL。2.拮抗放線菌的制備(1)放線菌菌株的制備本實驗中所用菌株為實驗二中得到的8株菌。斜面培養基高氏1號合成培養基。瓊脂15g，可溶性淀粉20g，NaCl 0. 5g，KN03lg， K2HP04 3H20 0. 5g, MgS04 7H20 0. 5g, FeS04 7H20 0. 01g，蒸溜水 lOOOmL, pH7. 3。種子培養基酵母膏4g、葡萄糖10g、蛋白胨3g、牛肉膏3g、CaC03 4g、蒸餾水 lOOOmL, pH7. 2-7. 4。發酵培養基葡萄糖5g、甘油5g、可溶性淀粉5g、蛋白胨5g、酵母膏5g、黃豆粉5g、 KH2P04 0. 5g、CaC03 0. 5g、NaCl 0. 5g、MgS04 0. 5g，蒸餾水 lOOOmL, pH7. 0-7. 2。可溶性淀 粉購自內蒙古鴻之惠商貿有限公司，產品目錄號為HX169 ；蛋白胨購自內蒙古鴻之惠商貿 有限公司，產品目錄號為SH0010;酵母膏購自內蒙古鴻之惠商貿有限公司，產品目錄號為 SH0348 ；黃豆粉購自超市。1)斜面培養分別將菌株接種于高氏1號斜面上，在28°C培養5-6d ；2)種子培養從生長好的放線菌斜面接種于100mL種子培養基中，220r/min、28°C
11振蕩培養48h，得到種子培養液；3)發酵培養按10% (v/v)的接種量將種子培養液接種于100mL發酵培養基中， 220r/min、28°C振蕩培養120h，得到含有放線菌菌株的發酵液。3.拮抗放線菌的篩選將上述方法2中制得的發酵液，與上述方法1中制得的孢子懸浮液等體積混合，取 一滴上述混合液滴加在表面用火棉膠處理過的蓋玻片上，每處理5個重復。在25°C下保濕 培養6h后檢查空白對照孢子的萌發，當空白對照孢子的萌發率達到85%后，檢查所有處理 的苜蓿根腐病菌孢子萌發率(以孢子芽管長度大于孢子長度一半者為萌發)。空白對照組 以無菌水與上述方法1中制得的孢子懸浮液等體積混合配制獲得。試驗重復5次。按以下公式計算孢子萌發抑制率
孢子萌發抑制率(%)=對照孢子子萌發率纏
對照孢子明發率實驗二中獲得的8株拮抗放線菌與苜蓿根腐病菌的處理中，苜蓿根腐病菌孢子萌 發抑制率依次為 33. 85%,49. 46%,62. 72%,68. 98%,76. 45%,81. 36%,84. 60%,100% ； 選取孢子萌發抑制率大于80%的菌株進行如下實驗四，共3株。(四)溫室盆栽活體試驗本實驗對步驟三中篩選得到的3株菌進行進一步的篩選。(1)放線菌懸浮液制備將步驟三得到的4株放線菌菌株分別在發酵培養基中振 蕩培養7d，制成濃度為108cfu/mL的孢子懸浮液。(2)靶標菌孢子懸浮液的制備將指示菌株(F. solani)用燕麥片培養基于28°C恒 溫培養箱中培養5-6d，待菌絲長滿培養基后，交替培養(黑暗-光照)7d，產生大量的分生 孢子，用無菌水洗下孢子，經細菌過濾器無菌過濾除去菌絲，加入0. 02% Tween-20制成濃 度為106cfu/mL的孢子懸浮液。燕麥片培養基燕麥片30g，瓊脂17_20g，蒸餾水1000mL(燕麥片30g加蒸餾水 lOOOmL，在沸水浴上加熱lh，紗布過濾后加水補足lOOOmL，加瓊脂熔化后分裝，121°C滅菌 20min)。(3)溫室盆栽防效試驗苜蓿(中苜1號)種子由國家種質牧草中期庫提供，產品目錄號為00068。將苜蓿(中苜1號)種子進行消毒處理，用0. 的新潔爾滅表面消毒3min，蒸餾 水沖洗3次，在25-28°C培養箱內催芽，待種子露白時點播種。育苗土壤先經121°C下高壓 滅菌2h，而后用放線菌孢子懸浮液拌勻，土壤中放線菌的接種量為108cfu/g。出苗30d后 以靶標菌孢子懸浮液進行傷根接菌，接種量為106cfu/g，以清水為對照1 (CK1)，培養放線菌 所用的發酵培養基為對照2 (CK2)，每處理重復10次。接種靶標菌45d后檢查苜蓿苗發病 情況，計算病情指數和防治率。通過防效分析，從復篩出的高活性菌株中篩選出室內防治率 彡75%的抗活性菌株。病情分級標準0級-健株，表觀無癥狀；1級-根莖或主根局部有病斑，但不連片；
2級_主根、側根及根莖部有病斑且連片，但不超過1/3 ；3級-1/3 /2根莖及根部被侵染變色，側根多被侵染變色，且側根明顯減少；4 級_根莖及根部變色，局部腐爛，維管束明顯變褐，植株生長受抑制且矮小枯黃；5級-根部 腐爛，維管束變黑且植株萎蔫死亡。
發病率、病情指數和防治效果的計算公式
發病率(％)=發i^f xioo% 總株數
病情指數數級代_值)X1Q0% (植株總數X最高代表級值)iUU/°
防治率=(1一xioo% (對照病情指數是指水對照)
對照病情指數
當計算出的防治效果(％ ) ^ 75%時，可認為該菌株發酵液供試樣品具有較好的 抗苜蓿根腐病活性，該菌株即為目的菌株。結果，獲得1株對苜蓿根腐病防治效果大于75%的拮抗放線菌菌株，將該菌株命 名為 NMG6-3-9。二、鑒定(一 )形態特征觀察將待鑒定的菌株作插片培養，進行形態特征觀察。將所觀察到的氣生菌絲形態進 行光學顯微照相，對孢子絲進行掃描電子顯微鏡照相。菌株NMG6-3-9菌落呈灰色絨粉狀，經插片培養觀察NMG6_3_9的菌絲較長，氣生 菌絲多分枝，螺旋形(圖1)。孢子圓形、橢圓形或長柱形，孢子絲直、柔曲或呈松敞螺旋形， 其掃描電鏡照片如圖2、圖3所示。( 二)培養特征觀察將待鑒定的菌株，分別接種在高氏一號、察氏、葡萄糖-天冬素、克氏一號、馬鈴薯 浸汁、葡萄糖酵母膏瓊脂斜面上及馬鈴薯塊培養基上，置于28°C培養，觀察其培養特征和顏 色變化。取穩定成熟的顏色特征作為其培養特征，作為鑒定種的依據。觀察記載氣生菌絲 的顏色、基質絲體的顏色和可溶性色素的顏色。結果記入鑒定表。此外，尚應觀察菌株的生 長狀況，如生長好壞，氣生菌絲呈現何等外貌-絨狀、粉狀或絮狀等作為參考特征。菌株NMG6-3-9在大多數培養基上生長良好，該菌在不同的培養基上的培養性狀 特征如下表1 ；另外該菌除在察氏瓊脂培養基上會產生可溶性色素外，在其他幾種供試培 養基上都不產生色素。表1菌株NMG6-3-9的培養特征 注以最后一次觀察結果為準。(三)生理生化特性測定明膠液化能力測定將菌株接種于柱形明膠培養基表面，28°C下培養，分別在5、 10、20、及30d，各觀察一次液化程度。觀察前應將菌種管冷凍20 30min。如明膠不液化 仍是固體狀態，若呈現液體即為液化。牛奶凝固與胨化測定將待測定菌株接種于脫脂牛奶中，28°C培養，分別在第3、 6、10、20、及30d各觀察一次。淀粉水解測定將培養基熔化后，冷卻至50°C倒成平板，凝固后將菌種點種于平 板上，適溫培養2 4d，形成菌苔后在平板上滴加路哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍為宜，平板 呈藍色，而菌落周圍有無透明圈出現說明淀粉是否被水解，透明圈的大小能夠說明水解淀 粉能力的大小。纖維素水解試驗配制適合放線菌生長而不含碳源的合成基礎培養液，分裝試管 后，以新華一號濾紙作纖維素(碳源)，把它切成寬1cm、長6cm濾紙條，加入試管中，一半浸 在液內，一半露在液外，將鑒定菌株接種在液外一段濾紙條上，置28 °C培養30d后觀察。若 該菌能將濾紙條分解成一團松散的纖維，或使之折斷，碎裂成質狀者為陽性，說明該菌株產 生纖維素酶使之水解。反之，濾紙無變化者為陰性。硫化氫產生試驗將待測菌株接種到含檸檬酸鐵的有機斜面上，置28°C培養10d 左右(視菌苔生長成熟為宜)觀察結果。若培養基中出現黑褐色沉淀，表示實驗為陽性。反 之，不變色者為陰性。碳源利用試驗將待鑒定菌株的孢子懸浮液1 2滴，接種在無碳源培養基上，用 無菌涂布棒涂布均勻，然后劃線挖溝，以溝為界，把平板培養基分成若干小區，每小區分別 加入一種碳源。常用的碳源有9種阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、果糖、蔗糖、山梨糖、甘 露醇和肌醇等。每皿需設無糖對照區。置28°C培養7、14d后，分別觀察記載生長利用情況。研究結果見表2 菌株NMG6-3-9能液化明膠，不能使牛奶凝固，也不能使其胨化， 淀粉水解較弱，不利用纖維素，硝酸鹽還原，不產生酪氨酸酶、H2S。除對葡萄糖和肌醇利用 較差外，對阿拉伯糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、木糖、甘露醇和半乳糖都能很好的利用。表2菌株NMG6-3-9的生理生化特征 注“_”表示未反應，“ + ”、“++”、“+++”分別表示反應的強弱。(四)細胞壁化學組分的鑒定紙層析法細胞壁氨基酸分析根據G+細菌細胞壁肽聚糖分子中第3位氨基酸的種 類，將放線菌劃分為九個類群(見表3)。表3放線菌細胞壁的主要類型 注LL-DAP 外消旋二氨基酸基庚二酸；meso-DAP 內消旋二氨基庚二酸；DAB :1， 4_ 二羥基丁酸。主要步驟為
(1)菌體制備刮取培養好的菌株放入1. 5mL的離心管中；(2)菌體水解在用于全細胞氨基酸分析的菌體中加入6mol/L的HC1 100 u L，放 入滅菌鍋中120°C，15min ；(3)點樣取4 y L用于氨基酸分析的水解液于新華1號濾紙上點樣，再分別取標 準氨基酸樣品二氨基庚二酸DAP (含有LL-DAP，Meso-DAP和DD-DAP)、賴氨酸、鳥氨酸、天冬 氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸各1 P L依次在濾紙上間隔點樣。(4)展層用于全細胞氨基酸水解液分析的展層系統為甲醇水HC1(6N)吡 啶=16 5. 2 0. 8 2，展層 2 次；(5)顯色氨基酸分析用0.4%茚三酮丙酮溶液，100 110°C加熱2 3min，觀察。紙層析法細胞壁糖分分析根據放線菌細胞壁的化學組分和全細胞水解液糖型， 將放線菌劃分為四個糖型(見表4)。表4放線菌全細胞的主要糖型
15 主要步驟為(1)菌體制備刮取培養好的菌株放入1. 5mL的離心管中；(2)菌體水解菌體中加入0. 25mol/L的HC1 100 ii L，放入滅菌鍋中120°C， 15min ；(3)點樣取4 y L用于氨基酸分析的水解液于新華1號濾紙上點樣，再分別取標 準糖樣品木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、核糖各1PL依次在濾紙上間 隔點樣。(4)展層用于全細胞氨基酸水解液分析的展層系統為正丁醇水吡啶甲醇 =10 6 6 1，展層 2 次；(5)顯色顯色劑鄰苯二甲酸苯胺水飽和的正丁醇(3. 25 2 100)，120°C 加熱3min。對菌株NMG6-3-9進行紙層析法細胞壁氨基酸分析，結果如表5 表5菌株NMG6-3-9全細胞氨基酸分析結果 注“_”表示未反應，“ + ”表示反應。對菌株NMG6-3-9進行紙層層析法細胞壁糖分分析，結果如表6 表6菌株NMG6-3-9的全細胞壁糖分 注“-”表示未反應，“ + ”表示反應。綜合表5、表6結果可知菌株NMG6-3-9細胞壁中含有氨基酸的種類為 LL-DAP(LL-二氨基庚二酸)、甘氨酸(GLY)和谷氨酸(GLU)，對照文中表3可知該菌株細胞 壁屬于I型；細胞壁中除含有葡萄糖外不含有表4中其它糖的種類，無特征性糖，該菌株糖 型為C型，符合鏈霉菌Str印tomyces的化學分類特性。(五)rDNA序列分析DNA膜板的制備DNA 提取純化后的生防放線菌株NMG6-3-9接種于高氏一號培養皿中，28°C培養至生長中 期，備用。提取的主要步驟如下(1)皿內刮取少量菌體，加60 iiL 2XCATB緩沖液，冰浴研缽中研磨至漿液，移入1.5mL離心管中(每菌做3管)。(2)加500 u L溶菌酶處理液(溶菌酶2mg/mL, RNase溶液50 u g/mL,蔗糖0. 3M， Tris-HCl 1M, pH8. 0)置于 37°C保溫 2h。(3)加入250 ii L 20% SDS溶液，震蕩混合。(4)55°C 保溫 60min。(5)加等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)充分搖勻，4°C Tris-HCl 1M， pH8. 0 下離心(8000rpm, 5min)。(6)取上清液移至另一離心管中，加10% NaAC液，2. 5倍體積冰凍乙醇沉淀。(7)4°C離心(10，000rpm，5min)，棄上清液。(8)重復步驟(5) (7) 1次。(9)用70%乙醇洗2 3次，晾干，加TE緩沖液60 u L，充分溶解后取3 u L檢測 并-20°C下保存。PCR 擴增 16S rDNA (l)PCR 儀型號:ALD_1244、rev、C. B(2)擴增弓| 物16S rDNA通用引物(50 y M)正向Pf■為 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(對應于 E. coli8 27 位堿基)，反向 Pr 為 5，-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，(對應于 E. colil492 1514 位堿基)，由中科院微生物 所基因工程中心合成。(3)擴增體系表716S rDNA PCR 擴增體系.- 注25iiL體系PCR擴增參數及程序按擴增體系(表7)依次加入各組分，瞬時離心混勻，加入Taq酶后瞬時離心混勻。 95°C預變性5min，進入循環:94°C變性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸2min。35個循環后， 72°C延伸lOmin。擴增產物_20°C儲存。PCR擴增產物的電泳檢查電泳條件為0.8%的瓊脂糖凝膠(含EB 0. 5u g/mL)，1 X TAE電泳緩沖液，80V電 壓電泳40min，PCR產物上樣量為4 y L，與2 y L上樣緩沖液混勻后點樣。在254nm紫外下觀察結果，以TaKaRa公司DNA Marker [DL2000]為核酸標準分子 量參照物，確定擴增片段長度。擴增產物帶應在標準物1500bp左右位置上。16S rDNA PCR產物全序列測定
PCR產物的純化與序列測定由上海英駿生物技術有限公司進行。測序時以擴增引 物作為正反向引物，由上海英駿生物技術有限公司用計算機引物設計軟件，根據所測出的 樣品的序列搜索設計出中間弓丨物并合成。系統進化樹的構建將所測的16S rDNA序列與GenBank基因庫中已測定的原核生物的16S rDNA序列 進行比較，調出與其序列同源性較高的菌株的16S rDNA序列。采用CLUSTAL X 1.8軟件對 所測定的同源序列進行多匹配排列，通過Treeview軟件進行系統進化樹的構建。與菌株 NMG6-3-9序列同源性較高的菌株見表8。進一步采用分子生物學技術手段對菌株NMG6-3-9 進行分子鑒定，經16S rDNA基因測序分析，共測定1433個有效堿基，如序列表1所示，構建 的系統進化樹如圖4所示。與菌株NMG6-3-9序列同源性較高的菌株見表8。由表8可以看出，與供試菌株相 似性達99%均為鏈霉菌屬的菌株，可得知菌株NMG6-3-9屬于鏈霉菌屬。通過16SrDNA序 列分析發現，菌株NMG6-3-9與灰黃鏈霉菌S. griseoflavus親緣關系比較近，同源性達到了 99. 90%，且同在系統進化樹一個單獨的分支上。表8構建系統發育樹所用的Str印tomyces 16S rDNA GenBanK登陸號 綜上，由形態特征、培養特征、生理生化特性和細胞壁成分分析，并 結合分子生物學鑒定結果，最后將菌株NMG6-3-9定為鏈霉菌屬灰黃鏈霉菌 (Streptomycesgriseoflavus)0該菌株已于2009年11月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所， 郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 3441。該菌株的分類命名為灰黃鏈霉菌(Streptomyces griseoflavus)，菌株名稱為 NMG6-3-9。四、菌株NMG6-3-9的培養斜面培養基高氏1號合成培養基。瓊脂15g，可溶性淀粉20g，NaCl 0. 5g，KN03lg， K2HP04 3H20 0. 5g, MgS04 7H20 0. 5g, FeS04 7H20 0. 01g，蒸溜水 lOOOmL, pH7. 3。種子培養基酵母膏4g、葡萄糖10g、蛋白胨3g、牛肉膏3g、CaC03 4g、蒸餾水 lOOOmL, pH7. 2-7. 4。發酵培養基葡萄糖5g、甘油5g、可溶性淀粉5g、蛋白胨5g、酵母膏5g、黃豆粉5g、 KH2P04 0. 5g、CaC03 0. 5g、NaCl 0. 5g、MgS04 0. 5g，蒸餾水 lOOOmL, pH7. 0-7. 2。
可溶性淀粉購自內蒙古鴻之惠商貿有限公司，產品目錄號為HX169 ；蛋白胨購自 內蒙古鴻之惠商貿有限公司，產品目錄號為SH0010 ；酵母膏購自內蒙古鴻之惠商貿有限公 司，產品目錄號為SH0348 ；黃豆粉購自超市。1)斜面培養將菌株NMG6-3-9接種于高氏1號斜面上，在28°C培養5_6d ；2)種子培養從生長好的放線菌斜面接種于100mL種子培養基中，220r/min、28°C 振蕩培養48h，得到種子培養液；3)發酵培養按10% (v/v)的接種量將種子培養液接種于lOOmL發酵培養基中， 220r/min、28°C振蕩培養120h，得到發酵液。實施例2、菌株NMG6-3-9的應用一、菌株NMG6-3-9的抗菌譜測定PDA瓊脂培養基馬鈴薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、蒸餾水1000mL、pH自然。將放線菌菌株NMG6-3-9接種于高氏1號瓊脂平板上于28°C下培養5d，得到菌苔； 用打孔器將菌苔打成直徑5mm的菌餅，并將菌餅置于PDA平板中央，使帶有菌絲的一面貼 在培養基表面，30°C下培養3d，然后將同樣大小靶標菌菌餅對峙接于菌株NMG6-3-9四周， 28°C下培養，至靶標菌長滿培養皿為止。采用十字交叉法測量抑菌(溶菌)圈的直徑。上述平板抑菌實驗采用常規的平板對峙法、牛津杯法、管碟法、挖塊法、瓊脂塊法 或濾紙片法等均可。每種靶標菌重復3次，結果取平均值。結果表明，菌株NMG6-3-9對20種不同類型的植物病原真菌都有不同程度的抑制 作用(表9)，并且該菌株對6種細菌也有一定的抑制效果(表10)。證明菌株NMG6-3-9的 抑菌譜較廣，且對不同種類病原菌具有選擇性。表9菌株NMG6-3-9對20種植物病原真菌的抑菌效果 表10菌株NMG6-3-9對6種細菌的抑菌效果 表9和10中的下述菌株均購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(簡稱ACCC) 燕麥鐮孢菌 Fusarium avenaceum ACCC 30065、立枯絲核菌 Rhizoctonia so 1 aniACCC 30332、禾谷鐮孢菌 Peronospora aestivalis ACCC 30068、半裸鐮刀菌 Fusarium semitectum ACCC 31945、香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense ACCC 36369、 瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum ACCC 36125、瓜類殼二抱 Ascochyta citrullina ACCC 36440、大麗輪枝孢 Verticillium dahliaACCC 36109、禾頂囊殼 Gaeumannomyces graminis ACCC 30310、禾彎孢霉菌 Curvularia lunata ACCC 36580、辣椒疫霉菌Phytophthora capsiciACCC 36279> MM^M Botrytis cinerea ACCC 30091、胃 Sclerotiniasclerotiorum ACCC 30096、粉紅聚端抱 Trichothecium roseum ACCC36459、 胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora ACCC 01443、青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum ACCC 01470、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus ACCC 01336。苜蓿殼針孢S印toria medicaginis (侯天爵.我國北方草地病害調查及主要病害 防治[J].中國草地，1993，3:56-60.)(中國農業科學院草原研究所)膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides (劉正坪，胡俊，高翔，等.枸杞炭 疽病菌生物學特性研究[J].北京農學院學報，2005，20 (3) :36-39.)(中國農業科學院草原 研究所)大斑突臍孢Exserohilummleonard turcicum(周洪友，劉正坪，胡俊，等.蘇丹草 大斑病菌的生物學特性研究[J].華北農學報，2009，24(1) :174-177.)(中國農業科學院草 原研究所)丁香假單胞菌Pseudomonas syringae (侯天爵.我國北方草地病害調查及主要病 害防治[J].中國草地，1993，3:56-60.)(中國農業科學院草原研究所)苜蓿黃單胞桿菌XMithomoriEis campestris pv. alfalfae (侯天爵.我國苜蓿病害 發生現狀及防治對策[J].內蒙古草業，1994，3 4-8.)(中國農業科學院草原研究所)燕麥嗜酸菌西瓜亞種Acidovorax avenae subsp. Citrulli (胡俊，黃俊霞，劉雙 平，等.不同哈密瓜品種對細菌性果斑病抗病性及發展動態的研究[J].華北農學報，2006， 21 (6) 107-110.)(中國農業科學院草原研究所)苜蓿茄鐮孢菌Fusarium solani (曹麗霞，趙存虎，白全江，等.內蒙古中部地區苜 蓿根腐病病原研究(英文)[J].華北農學報，2008，23 (6) :105-107.)(中國農業科學院草 原研究所)苜蓿尖鐮孢菌Fusarium oxysporum(曹麗霞，趙存虎，白全江，等.內蒙古中部地 區苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].華北農學報，2008，23 (6) 105-107.)(中國農業科學 院草原研究所)苜蓿匍柄霉Stemphylium botryosum(侯天爵.我國北方草地病害調查及主要病 害防治[J].中國草地，1993，3:56-60.)(中國農業科學院草原研究所)二、對靶標菌孢子的萌發抑制1.苜蓿根腐病菌孢子懸浮液的制備PDA培養基馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、蒸餾水lOOOmL，pH7. 0。將苜蓿茄鐮孢菌(Fusarium solani)接種于PDA培養基，于28°C恒溫培養箱中培 養5-6d，待菌絲長滿培養基后用無菌水洗去氣生菌絲，400nto日光燈照射下培養產孢，待 2-3d產孢后，用無菌水洗下孢子，經細菌過濾器無菌過濾除去菌絲并加入0. 02% Tween-20 制成孢子懸浮液在4°C下保存備用，濃度為106cfu/ml。2.拮抗放線菌的制備(1)菌株發酵液的制備將菌株NMG6-3-9接入發酵培養基，28°C下振蕩培養4-5d，將發酵液離心取上清 液，將上清液過濾，收集濾液，將濾液記作菌株NMG6-3-9發酵濾液，菌株NMG6-3-9發酵濾液
21中的孢子濃度為108cfu/mL。3.拮抗放線菌的篩選將發酵濾液與上述實驗1中制得的孢子懸浮液等體積混合，取一滴上述混合液 滴加在表面用火棉膠處理過的蓋玻片上，每處理5個重復。在25°C下保濕培養6h后檢 查空白對照中苜蓿茄鐮孢菌(Fusarium solani)孢子的萌發，當空白對照中苜蓿茄鐮孢 菌(Fusarium solani)孢子的萌發率達到85%后，檢查所有處理苜蓿茄鐮孢菌(Fusarium solani)的孢子萌發率(以孢子芽管長度大于孢子長度一半者為萌發)。試驗重復5次。按以下公式計算孢子萌發抑制率
孢子萌發抑制率(Q/0) 二對照孢子子萌發率x 100%
對照孢子明發率空白對照組方法方法與實驗組一致，只是將發酵液替換為無菌水。實驗設3次重復。結果對照組，有85 %的孢子萌發，形成細長且均勻的菌絲；實驗組菌株 NMG6-3-9對孢子萌發抑制率達100%，并且使孢子萌發速率降低，并使分生孢子細胞及其 萌發出的芽管畸形，進而可以降低其侵染寄主的能力。三、菌株NMG6-3-9對植物病害的生物防治采用室內苗期灌根接種法對NMG6-3-9進行防治苜蓿根腐病試驗。苜蓿根腐病是 由苜蓿茄鐮孢菌Fusarium solani引起的。苜蓿茄鐮孢菌Fusarium solani (曹麗霞，趙存虎，白全江，等.內蒙古中部地區苜 蓿根腐病病原研究(英文)[J].華北農學報，2008，23 (6) :105-107.)(中國農業科學院草 原研究所)。苜蓿(中苜1號)種子購自國家種質牧草中期庫，產品目錄號為00068。井崗 霉素購自農資商店；Czapek，s 培養液(蔗糖 30g、NaN03 2g、KC1 0. 5g、K2HP04 3H20 lg、 MgS04 7H20 0. 5g、FeS04 7H20 0. 01g、蒸餾水 lOOOmL, pH 自然。靶標菌孢子懸液的制備將病原菌用Czapek’ s培養液28°C，120r/min搖瓶培 養96h，得到病原菌的孢子懸液，用血球計數板計算孢子懸液濃度，孢子懸液中孢子濃度為 106cfu/mLo菌株NMG6-3-9發酵濾液的制備將菌株NMG6-3-9接入發酵培養基，28°C下振蕩培 養4-5d，將發酵液離心取上清液，將上清液過濾，收集濾液，將濾液記作菌株NMG6-3-9發酵 濾液，菌株NMG6-3-9發酵濾液中的孢子濃度為108cfu/mL。供試土樣自然土滅菌后待用。滅菌后的土壤分裝于不同的育苗杯中(高15cm， 直徑8cm)，每杯裝入滅菌土 200g，放在邊緣較高的搪瓷盤內。播種前兩天沿盆邊緣充分澆 水，使其自然吸水。苗期管理苜蓿種子用0. 新潔爾滅消毒3min，用清水沖洗干凈，放入28-30°C 溫箱中，待其露白后或芽長0. 5cm時播種。在人工氣候室內育苗，白天溫度保持在24-26°C， 夜間15-18°C，土壤濕度保持在60% -80%。接種方法待苜蓿幼苗生長30d后(將播種當天記作第0天)，將菌株NMG6-3-9的 發酵濾液(108cfu/mL)灌于幼苗根部，每株10mL ；3d后同樣將病原菌懸液(106cfu/mL)灌根接種，每株10m]+。以5％井岡霉素水劑(濃度為50 u g／mL)灌根處理的植株為農藥對照、以發酵培養基及清水灌根處理的植株作為空白對照。每20個育苗杯為一處理，每杯4株，每處理3次重復。定期調查發病情況，45d后統計病情指數及相對防治效果。病害分級參照如下標準進行
病情分級標準
o級一健株，表觀無癥狀；
l級一根莖或主根局部有病斑，但不連片；
2級一主根、側根及根莖部有病斑且連片，但不超過l／3；
3級一l／3一l／2根及根莖部被侵染變色，且側根明顯減少；
4級一根及根莖部變色、局部腐爛，維管束明顯變褐，植株生長受抑制且矮小枯黃；
5級一根部腐爛、維管束變黑且植株萎蔫死亡。
發病率‘％，’醫×100％
熊撇駕>--器鸚器×100
防治效果‘％， ‘工一等驪，x lOO％‘對照指清水對照，
上述計算公式中對照均指清水。
各級代表級值為o、l、2、3、4、5，最高代表級值為5。
試驗結果(表11)表明，供試拮抗菌I'xN(；6—3—9的發酵液可以降低苜蓿根腐病的發病率和病情指數，病情指數為16．35，相對防效達81．50％，高于CK3(5％井崗霉素水劑)的處理防效60．78％。另外從表中結果可以看出CK2(發酵培養基)的病情指數雖然比清水對照的低，但是差異很小，其對植株的發病雖有影響卻不是防病的主要因素，防病的主要因素為拮抗菌k~Vl(-；6—3—9的代謝產物。在盆栽試驗中，拮抗菌能夠有效減輕病情，顯示出較為理想的應用潛力。
表11拮抗菌I'xN(；6—3—9對苜蓿根腐病的盆栽防病效果
權利要求
灰黃鏈霉菌(Streptomyces griseoflavus)NMG6-3-9，其保藏編號為CGMCC No.3441。
2.菌的拮抗劑，其活性成分為灰黃鏈霉菌(Sti^ptomycesgriseof lavus) NMG6-3-9CGMCC No. 3441 ；所述菌為苜猜前鐮孢菌Fusarium solani、苜猜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum、燕麥鐮 抱菌Fusarium avenaceum、苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、禾谷德抱菌 Peronospora aestivalis、半裸德刀菌 Fusariumsemitectum、香 蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、 苜猜殼針孢Septoria medicaginis、瓜類殼二孢Ascochytacitrullina、大麗輪枝孢 Verticillium dahlia、禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis、膠抱炭疽菌 Coiletotrichum gloeosporioides、胃 包 β 胃 Curvularia lunata、大■突 M 包 Exserohilumleonard turcicum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、灰葡萄抱 Botrytis cinerea、核盤 菌 Sclerotinia sclerotiorum、粉紅聚端抱 Trichothecium roseum、丁香假單胞菌 Pseudomonas syringae、古月蘿卜軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora var. carotovora、 苜猜黃單胞桿菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae、青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum、禾口 / 或燕麥嗜酸菌西瓜亞禾中 Acidovorax avenae subsp. citrulli、禾口 / 或金 胃求胃 Staphylococcusaureausο
3.根據權利要求2所述的拮抗劑，其特征在于所述燕麥鐮孢菌Fusariumavenaceum 為燕麥鐮孢菌 Fusarium avenaceum ACCC 30065，所述立枯絲核菌 Rhizoctonia solani 為立枯絲核菌Rhizoctonia solani ACCC 30332，所述禾谷鐮孢菌Peronospora aestivalis 為禾谷鐮孢菌Peronospora aestivalis ACCC30068，所述半裸鐮刀菌Fusarium semitectum 為半裸,廉刀菌 Fusarium semitectumACCC 31945，所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 為香蕉枯萎菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense ACCC 36369， 所述瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum 為瓜果腐霉 Pythium aphani derma turn ACCC 36125，所述瓜類殼二孢 Ascochyta citrullina 為瓜類殼二孢 Ascochyta citrullina ACCC 36440，所述大麗輪枝孢 Verticillium dahlia 為大麗輪枝孢 Verticillium dahlia ACCC36109，所述禾丁頁囊殼Gaeumannomyces graminis 為禾丁頁囊殼Gaeumannomycesgraminis ACCC 30310，所述禾彎孢霉菌 Curvularia Iunata 為禾彎孢霉菌 Curvularia lunata ACCC 36580，所述辣椒疫霉菌Phytophthora capsici 為辣椒疫霉菌Phytophthora capsici ACCC 36279, fff^MM^^ Botrytis cinereaBotrytis cinerea ACCC 30091, 所述核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum 為核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC 30096，所述粉紅聚端孢 Trichotheciumroseum 為粉紅聚端孢 Trichothecium roseum ACCC 36459，所述胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora為胡蘿卜 軟腐歐文氏菌Erwiniacarotovora var. carotovora ACCC 01443，所述青枯雷爾氏菌 Ralstoniasolanacearum 為青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum ACCC 01470，所述金 黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus 為金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureausACCC 01336ο
4.灰黃鏈霉菌(Str印 tomyces griseof lavus) NMG6-3-9 CGMCC No. 3441 在制備如下菌 中至少一種菌的拮抗劑中的應用苜猜前鐮孢菌Fusarium solani、苜猜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum、燕麥鐮孢菌 Fusarium avenaceum、苜猜匍柄霉 Stemphyllium botryosum、立枯絲核菌 Rhizoctonia solani、禾谷德抱菌 Peronospora aestivalis、半裸德刀菌 Fusariumsemitectum、香 蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense、瓜果腐霉 Bythiumaphanidermatum、 苜猜殼針孢Septoria medicaginis、瓜類殼二孢Ascochytacitrullina、大麗輪枝孢 Verticillium dahlia、禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis、膠抱炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides、胃 包 β 胃 Curvularia lunata、大■突 M 包 Exserohilumleonard turcicum、辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici、灰葡萄抱 Botrytis cinerea、核盤 菌 Sclerotinia sclerotiorum、粉紅聚端抱 Trichothecium roseum、丁香假單胞菌 Pseudomonas syringae、古月蘿卜軟腐歐文氏菌 Erwinia carotovora var. carotovora、 苜猜黃單胞桿菌 Xanthomonas campestris pv. alfalfae、青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum、禾口 / 或燕麥嗜酸菌西瓜亞禾中 Acidovorax avenae subsp. citrulli、禾口 / 或金 胃求胃 Staphylococcusaureausο
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述燕麥鐮孢菌Fusariumavenaceum為 燕麥鐮孢菌 Fusarium avenaceum ACCC 30065，所述立枯絲核菌 Rhizoctoniasolani 為 立枯絲核菌 Rhizoctonia solani ACCC 30332，所述禾谷鐮孢菌 Peronospora aestivalis 為禾谷鐮孢菌Peronospora aestivalis ACCC 30068，所述半裸鐮刀菌Fusarium semi tectum 為半裸,廉刀菌 Fusarium semi tectum ACCC31945，所述香蕉枯萎菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense 為香蕉枯萎菌 Fusariumoxysporum f. sp. cubense ACCC 36369， 所述瓜果腐霉 Pythium aphani derma turn 為瓜果腐霉 Pythium aphani derma turn ACCC 36125，所述瓜類殼二孢Ascochytacitrullina為瓜類殼二孢Ascochyta citrullina ACCC 36440，所述大麗輪枝孢 Verticillium dahlia 為大麗輪枝孢 Verticillium dahlia ACCC 36109，所述禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis 為禾丁頁囊殼 Gaeumannomyces graminis ACCC30310，所述禾彎孢霉菌 Curvularia Iunata 為禾彎孢霉菌 Curvularia IunataACCC 36580，所述辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 為辣椒疫霉菌 Phytophthoracapsici ACCC 36279, fff^MM^^ Botrytis cinerea ^MM ^ ^ Botrytiscinerea ACCC 30091, 所述核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum 為核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum ACCC 30096，所述粉紅聚端孢 Trichotheciumroseum 為粉紅聚端孢 Trichothecium roseum ACCC 36459，所述胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora var. carotovora為胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwiniacarotovora var. carotovora ACCC 01443，所述青枯雷爾氏菌 Ralstoniasolanacearum 為青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum ACCC 01470，所述金 黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureaus 為金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureausACCC 01336ο
6.—種篩選拮抗苜蓿根腐病的放線菌的方法，包括如下步驟1)從待分離樣品中得到純培養放線菌；2)用平板對峙法、抑菌圈法、牛津杯法、管碟法、挖塊法、瓊脂塊法或濾紙片法，從步驟 1)中所述純培養放線菌中篩選對靶標菌具有拮抗作用的放線菌菌株，得到拮抗靶標菌的放 線菌菌株；所述靶標菌為引起苜蓿根腐病的菌；3)用孢子萌發法，從步驟2)中所述拮抗靶標菌的放線菌菌株中篩選抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株，得到抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株；4)用溫室盆栽活體法對步驟3)得到的放線菌菌株進行檢測，得到拮抗苜蓿根腐病的 放線菌。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述溫室盆栽活體法包括如下步驟a) 發酵培養所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株，得到含有所述抑制所述靶標菌孢子 萌發的放線菌菌株的發酵液，將所述含有所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株的發 酵液接種于土壤中，得到土壤和所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株的混合物；b) 將苜蓿種子接種于步驟a)中所述混合物中，培養；c)待所述苜蓿種子出苗30d后，用所述 靶標菌的孢子懸浮液進行傷根接菌，繼續培養，檢測防治率，防治率大于等于75%的放線菌 菌株即為拮抗苜蓿根腐病的放線菌。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟a)中，所述土壤和所述抑 制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株的混合物中所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌 菌株的濃度為108cfu/g ；和/或，所述步驟c)中，所述傷根接菌的接種量為106cfu/g 土壤。
9.根據權利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，所述步驟3)中 所述抑制所述靶標菌孢子萌發的放線菌菌株為對所述靶標菌孢子的萌發抑制率大于等于 80%的放線菌菌株。
10.根據權利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述靶標菌為苜蓿根腐病菌； 所述苜猜根腐病菌為苜猜爺鐮孢菌Fusarium solani、苜猜尖鐮孢菌Fusariumoxysporum 或燕麥鐮孢菌Fusarium avenaceum ；所述待分離樣品為土壤。
全文摘要
本發明公開了一株抗苜蓿病害灰黃鏈霉菌及其篩選方法。該菌株為灰黃鏈霉菌(Streptomyces griseoflavus)NMG6-3-9，其保藏編號為CGMCC No.3441。本發明菌株對苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用，能夠用于生物防治苜蓿根腐病及其它多種植物病害，在生物防治病害領域具有廣闊的應用前景。本發明為苜蓿根腐病的生物防治奠定基礎，進而為該病生防放線菌制劑的研制與應用提供科學依據。
文檔編號C12R1/465GK101851597SQ20101015592
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月21日 優先權日2010年4月21日
發明者劉星, 劉愛萍, 劉雅學, 周玉雷, 塔娜, 張禮生, 徐林波, 李薇, 李鵬, 狄彩霞, 王寧, 石雅琴, 荊瑞勇, 趙海霞, 閆麗英, 陳紅印, 高書晶 申請人:中國農業科學院草原研究所