專利名稱：土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵工程技術領域，具體的說是涉及一種土霉素單菌落冷凍菌 的制備工藝。
背景技術：
土霉素(Oxytetracycline)為四環類廣譜抗生素，國內從20世紀60年代開始規 模化發酵生產，至今已經成為我國規模最大的抗生素發酵產品之一，在醫療、畜牧業和農業 方面有著廣泛的用途。土霉素產品的市場前景廣闊，生產企業眾多，市場競爭激烈，因此改 進生產工藝、降低生產成本是該產品面臨的重大課題。土霉素的產生菌種是龜裂鏈霉菌(Sti^ptomyces rimosus Sobinetal)。目前國內 企業土霉素發酵生產的菌種選育、制備及保藏工藝仍然沿用傳統的工藝方法。在以上菌種 選育過程中，從單菌落經搖瓶初篩和搖瓶復篩到沙土斜面要靠斜面傳代來維持菌種的新鮮 和活性，同時初篩斜面和復篩斜面要放置4°C冰箱保藏，最終沙土斜面要埋制成沙土管用于 長期保藏菌種。以上工藝的缺點是菌種在斜面傳代及保藏過程中產量會下降，沙土管保藏 菌種保藏期短、死亡率高、菌種容易退化。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供減少菌種傳代次數，防止菌種退化， 保持菌種優良高產性狀，減少菌種在保藏過程中的死亡率和死亡速度，保證菌種發酵生產 的穩定的一種土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝。本發明的目的是這樣實現的一種土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，包括以下步 驟a.平板培養基的制備按照全麥粉3. 5 4. 5%、酵母浸膏粉0. 1 0. 3%、磷酸 二氫鉀0. 1 0. 3%、瓊脂1. 5 2. 5%、余量為水的比例配制平板培養基，將平板培養基經 過滅菌裝入滅菌后的培養皿中；b.單孢子懸液的制備取預先選定的出發菌種，接種3 5只茄瓶斜面，培養出發 斜面孢子，然后選取外觀質量合格的出發斜面孢子制成單孢子懸液；c.單菌落的培養將單孢子懸液按10倍的濃度梯度稀釋至10_7、10_8、10_9 ；將以上 三個濃度的單孢子懸液分別接種到不同培養皿的平板培養基上，在溫度為36 37°C、相對 濕度為40 50%的條件下培養；d.單菌落孢子懸液的制備選擇菌落直徑較大、白色、孢子豐滿、邊緣整齊的主型 單個菌落，制成單菌落孢子懸液，分裝在4只試管中，塞上棉塞、包好封口膜并編號；e.單菌落冷凍菌的超低溫凍存將裝好單菌落孢子懸液的試管按照編號順序擺 放在鋁制的試管架上，浸入_70°C丙酮中預凍，再迅速放入_70°C的超低溫冰箱保藏；f.搖瓶初篩和搖瓶復篩取步驟e中單菌落冷凍菌中的其中2只試管，采用與生 產相近的培養基和培養條件，進行單菌落冷凍菌的搖瓶初篩和搖瓶復篩，選出生產能力強的單菌落冷凍菌；g.生產用凍干管菌種的制備根據步驟f搖瓶初篩和搖瓶復篩的篩選結果，選擇 生產能力強的單菌落冷凍菌編號對應的另外2只單菌落冷凍菌試管，制備生產用的凍干管 菌種。所述平板培養基的制備，包括全麥粉的加工方法，該方法是選用加拿大產地的小 麥，逐粒挑選粒大、飽滿、無蟲蛀及無霉變的小麥顆粒，粉碎為80目以上。所述平板培養基的制備，培養基的配方更優化的方案是全麥粉4%、酵母浸膏粉 0. 2%、磷酸二氫鉀0. 2%、瓊脂2 %、余量為水。所述的平板培養基的制備，平板培養基的滅菌方法是在0. lMPa、120 122°C的條 件下滅菌30分鐘，滅菌結束后保壓降溫。所述的單菌落的培養更進一步的方案是在恒溫室或生化培養箱內進行，培養1天 后將培養皿翻轉培養，培養溫度36. 5°C、相對濕度42 48%、培養周期5天。所述的單菌落孢子懸液的制備更進一步的方案是，單菌落孢子懸液的制備過程是 用接種環挑下選擇的單個主型菌落，放入預先加有滅菌玻璃珠的規格為18X 180mm的試管 中，振蕩打下孢子，再加2ml 10%的甘油保護劑，搖動制成單菌落孢子懸液；用0. 5ml滅菌 移液管將懸液分別吸入4只規格為12X 120mm的試管中，平均每只約裝0. 5ml。本發明的優點在于本發明是通過優化土霉素菌種的單菌落培養基，發明了全新 的培養基配方，使單菌落平均直徑從Φ3. 2mm增大到Φ6. 3mm、分生孢子數量增加，為實現 單菌落冷凍菌的制備提供了基本條件。本發明單菌落孢子懸液分裝于四只試管中，置于超低溫冰箱中成為單菌落冷凍 菌。其中兩只試管的單菌落冷凍菌分別用于搖瓶初篩和搖瓶復篩，另外兩只試管的單菌落 冷凍菌直接用于生產用凍干管菌種的制備，它減少了菌種在復壯選育過程中和制備過程中 的傳代次數，提高了土霉素的發酵單位；防止菌種的生產能力在菌種保藏過程中發生退化， 最大限度地保持了菌種的優良高產性狀；減少和減慢了菌種分生孢子在保藏過程中的死亡 率和死亡速度，保證了對車間的菌種供應及土霉素發酵生產的穩定；減少了菌種制備過程 中的許多無菌操作環節，從而大大降低了菌種的染菌率。本發明把菌種的超低溫保藏和冷凍干燥保藏兩項新技術應用到土霉素的菌種選 育及制備工藝中，增加了菌種的選育、制備和保藏效果，最終達到提高工作效率和增產降耗 的目的。
具體實施例方式實施例1 一種土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，包括以下步驟a.平板培養基的制備(1)選用加拿大產地的小麥，逐粒挑選粒大、飽滿、無蟲蛀及無霉變的小麥顆粒，粉 碎為80目以上制備成全麥粉；(2)按照全麥粉4 %、酵母浸膏粉0.2%、磷酸二氫鉀0. 2 %、瓊脂2 %、余量為水的 比例配制平板培養基；(3)將上面配制好的培養基一邊搖勻一邊分裝于規格為500ml三角瓶內，每瓶培 養基裝量200ml ；在0. lMPa、121°C的條件下滅菌30分鐘，滅菌結束后保壓降溫；
(4)將滅菌的平板分離培養基趁熱搖勻，待冷卻至60°C左右一邊搖一邊分別倒入 規格為Φ90πιπι滅菌培養皿中，每只培養皿大約倒25ml培養基；倒好的培養皿放平加蓋，待 培養基冷卻凝固后備用。b.單孢子懸液的制備取預先選定菌號的凍干管1只做出發菌種，接種茄瓶斜面3-5只，按照要求培養成 斜面孢子，保藏備用；選取外觀質量合格的出發斜面孢子1支，用滅菌移液管加入20ml無菌水 ，再用滅 菌接種環將分生孢子輕輕刮下，搖動制成孢子懸液。用滅菌移液管吸出孢子懸液加入裝有 滅菌玻璃珠的三角燒瓶中搖動3-5分鐘，倒入滅菌漏斗加脫脂棉或濾紙過濾制成單孢子懸 液。c.單菌落的培養用滅菌移液管吸取單孢子懸液，按10倍的濃度梯度稀釋至10-7、10_8、10-9。分別吸 取以上三個濃度的懸液加在平板培養基上，每個平板加0. 1 0. 3ml，然后用滅菌接種耙涂 布均勻，接種好的平板加蓋，正面向上集中用牛皮紙包扎。將牛皮紙包扎好的平板正面向上水平放置在恒溫培養室或生化培養箱內，溫度 36. 5°C、相對濕度40 50%，1天后將培養皿翻轉培養，培養周期5天。d.單菌落孢子懸液的制備取12X 120mm的試管，放入的鹽酸溶液中浸泡12小時，用自來水清洗干凈，再 用去離子水沖洗至中性，烘干，用脫脂棉做棉塞，包扎、滅菌備用。取培養好的平板單菌落，選擇菌落直徑較大、白色、孢子豐滿、邊緣整齊的主型菌 落，用接種環挑下，放入預先加有滅菌玻璃珠的規格為18X 180mm的試管中，振蕩打下孢 子，再加2ml 10%的甘油保護劑，搖動制成單菌落孢子懸液。用0. 5ml滅菌移液管將懸液分 別吸入4只12X 120mm的試管中，平均每只約裝0. 5ml，塞上棉塞包好封口膜并編號。e.單菌落冷凍菌的超低溫凍存將裝好單菌落孢子懸液的試管按照編號順序擺放在鋁制的試管架上，浸入-70°C 丙酮中預凍，再迅速放入-70°C的超低溫冰箱保藏。f.搖瓶初篩和搖瓶復篩取步驟e中單菌落冷凍菌中的其中2只試管，采用與生產相近的培養基和培養條 件，進行單菌落冷凍菌的搖瓶初篩和搖瓶復篩，選出生產能力強的單菌落冷凍菌。g.生產用凍干管菌種的制備根據步驟f搖瓶初篩和搖瓶復篩的篩選結果，選擇與生產能力強的單菌落冷凍菌 編號對應的另外2只單菌落冷凍菌試管制備供生產使用的凍干管菌種。
權利要求
一種土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，包括以下步驟a.平板培養基的制備首先選用加拿大產地的小麥，逐粒挑選粒大、飽滿、無蟲蛀及無霉變的小麥顆粒，粉碎為80目以上制備成全麥粉，再按照全麥粉3.5～4.5％、酵母浸膏粉0.1～0.3％、磷酸二氫鉀0.1～0.3％、瓊脂1.5～2.5％、余量為水的比例配制平板培養基，將平板培養基經過滅菌倒入滅菌后的培養皿中；b.單孢子懸液的制備取預先選定的出發菌種，接種3～5只茄瓶斜面，培養出發斜面孢子，然后選取外觀質量合格的出發斜面孢子制成單孢子懸液；c.單菌落的培養將單孢子懸液按10倍的濃度梯度稀釋至10-7、10-8、10-9；將以上三個濃度的單孢子懸液分別接種到不同培養皿的平板培養基上，在溫度為36～37℃、相對濕度為40～50％的條件下培養；d.單菌落孢子懸液的制備選擇菌落直徑較大、白色、孢子豐滿、邊緣整齊的主型單個菌落，制成單菌落孢子懸液，分裝在4只試管中，塞上棉塞、包好封口膜并編號；e.單菌落冷凍菌的凍存將裝好單菌落孢子懸液的試管按照編號順序擺放在鋁制的試管架上，浸入-70℃丙酮中預凍，再迅速放入-70℃的超低溫冰箱保藏；f.搖瓶初篩和搖瓶復篩取步驟e中單菌落冷凍菌中的其中2只試管，采用與生產相近的培養基和培養條件，進行單菌落冷凍菌的搖瓶初篩和搖瓶復篩，選出生產能力強的單菌落冷凍菌；g.單菌落冷凍菌的制備根據步驟f搖瓶初篩和搖瓶復篩的篩選結果，選擇與生產能力強的單菌落冷凍菌編號對應的另外2只單菌落冷凍菌試管，制備生產用凍干管菌種。
2.按照權利要求1所述土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，其特征在于所述平板培養 基的制備，包括全麥粉的加工方法，該方法是選用加拿大產地的小麥，逐粒挑選粒大、飽滿、 無蟲蛀及無霉變的小麥顆粒，粉碎為80目以上。
3.按照權利要求2所述土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，其特征在于所述平板培 養基的制備，平板培養基的配方是全麥粉4%、酵母浸膏粉0.2%、磷酸二氫鉀0.2%、瓊脂 2%、余量為水。
4.按照權利要求3所述土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，其特征在于所述平板培養 基的制備，還包括平板培養基的滅菌方法，該方法是在0. lMPa、120 122°C的條件下滅菌 30分鐘，滅菌結束后保壓降溫。
5.按照權利要求1、2、3或4所述土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，其特征在于所述 的單菌落的培養是在恒溫室或生化培養箱內進行，培養1天后將培養皿翻轉培養，培養溫 度36. 5°C、相對濕度42 48%、培養周期5天。
6.按照權利要求1、2、3或4所述土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，其特征在于所述 的單菌落孢子懸液的制備過程是用接種環挑下選擇的主型單個菌落，放入預先加有滅菌玻 璃珠的規格為18X180mm的試管中，振蕩打下孢子，再加2ml的10%甘油保護劑，搖動制成 單菌落孢子懸液，用0. 5ml滅菌移液管將懸液分別吸入4只規格為12 X 120mm的試管中，平 均每只約裝0. 5ml。
全文摘要
本發明公開了一種土霉素單菌落冷凍菌的制備工藝，采用全麥粉3.5～4.5％、酵母浸膏粉0.1～0.3％、磷酸二氫鉀0.1～0.3％、瓊脂1.5～2.5％、余量為水的比例配制平板培養基，進行單菌落的培養，將培養好的單菌落制備成單菌落冷凍菌，通過搖瓶初篩和搖瓶復篩，選出生產能力強的單菌落冷凍菌，最終制備成生產用凍干管菌種。該平板培養基可以培養出菌落直徑大、分生孢子數量多的單菌落。單菌落孢子懸液直接用于單菌落冷凍菌的制備，它減少了菌種在復壯選育過程中和制備過程中的傳代次數，防止菌種退化，增加了保藏效果，最終達到提高工作效率和增產降耗的目的。
文檔編號C12N1/20GK101831396SQ20101017346
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月29日 優先權日2010年4月29日
發明者于廣成, 趙鳳祥, 高峰 申請人:赤峰制藥股份有限公司