專利名稱：B細胞激活因子拮抗劑及其制備方法與用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程藥物領域，具體涉及一種新型B細胞激活因子(BAFF)拮抗劑 及其制備方法和用途。
背景技術：
自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)、系統性紅斑狼 ^ (systemic lupus erythematosus, SLE)、Sjogren氏綜合癥(Sjogren'ssyndrome,干燥綜合 癥或修格林氏綜合癥)等都與機體的B細胞或漿細胞過分增殖、體液免疫激活密切相關。B 細胞激活因子(B cell activating factor, BAFF)，又稱 BLyS，TALL-1，THANK, zTNF4或TNFSF-13B，是1999年發現的TNF家族成員[1]，在B細胞的存活和成熟過程 中起重要作用。BAFF為II型跨膜蛋白，以膜結合和可溶兩種形式存在，前者由285個 氨基酸組成，經蛋白酶水解后，可形成由152個氨基酸組成的可溶性蛋白。在正常生理 條件下，可溶性BAFF以三聚體形式存在并具有生物活性。BAFF與另一 TNF家族成員 APRIL(AProliferaion-inducing Ligand)的蛋白序列具有 33%的同源性[2]。BAFF 主要 由外周血單個核細胞(PBMNC)表達，包括巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞[3]。現已發現 BAFF 的三個受體BCMA(B cell maturation antigen)、 TACI(transmembraneactivator and CAML interactor)及 BAFF_R(BAFF receptor, Br3) 均為III型跨膜蛋白。BAFF和APRIL均能夠高親和性地結合TACI和BCMA，但BAFF還能與 BAFF-R結合。TNF受體的胞外區含有多個半胱氨酸豐富區(cysteine_rich domain, CRD), 每個CRD由6個半胱氨酸殘基形成3個二硫鍵。BCMA具有單一的CRD，與BCMA相比，TACI 含有兩個典型的CRD，但N端的CRD不參與配體結合[11]。BAFF-R僅含有1個由4個半胱 氨酸殘基組成的部分CRD，與BAFF的結合域減少到26個氨基酸，主要介導BAFF-R和BAFF 的相互作用[12]。BAFF除具有促進B細胞存活的作用外，在維持生發中心反應、同型轉換、T細胞的 活化等方面都具有重要的調節作用。BAFF對T細胞激活的作用，可能在自身免疫疾病的發 病機制中起重要作用。因此，BAFF及其受體作為治療自身免疫疾病的新靶標，受到廣泛的關 注。BAFF特異的拮抗劑(包括可溶受體TACI-Fc，Br3-Fc或抗BAFF抗體等)能抑制BAFF 的生物活性，從而起到治療類風濕關節炎(RA)、Sj6gren綜合癥和系統性紅斑狼瘡(SLE)等 自身免疫疾病的作用。目前，對TACI-Fc治療SLE及RA治療研究已進入II/III期臨床試 驗，人抗BAFF單克隆抗體LymphoStat-BTM治療RA和SLE病人的研究也進入III期臨床試 驗，初步結果表明，Lympho Stat-BTM能顯著降低外周血成熟B細胞的數目，治療效果明確。
發明內容
本發明要解決的技術問題是為自身免疫性疾病的防治，尤其是通過拮抗BAFF來 防治自身免疫性疾病尋找新的有效選擇。本發明解決技術問題的技術方案是提供一種新型 細胞激活因子拮抗劑。該B細胞激活因子拮抗劑包含有一段結構域，其氨基酸序列為SEQ ID No. 1所示。該結構域起主 要的B細胞激活因子結合作用。進一步的，該B細胞激活因子拮抗劑(BAFF Trap)的氨基酸序列為SEQ ID No. 1 所示。進一步的，該B細胞激活因子拮抗劑的氨基酸序列為在SEQ ID No. 1所示的氨基 酸序列的C-末端還連接有人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列。其中，該B細胞激活因子拮抗劑的氨基酸序列為SEQ ID No.2所示。進一步的，在該B細胞激活因子拮抗劑其N-末端還連接有信號肽。其中，該B細胞激活因子拮抗劑的氨基酸序列為SEQ ID No.3所示。本發明還提供了編碼上述的B細胞激活因子拮抗劑的核苷酸序列。進一步的，該核苷酸序列為SEQ ID No. 4所示。更進一步的，該核苷酸序列為SEQ ID No. 5所示。本發明還提供了含有權利要求6 8任一項所述核苷酸序列的基因載體。本發明還提供了含有權利要求9所述基因載體的宿主細胞。本發明同時也提供了上述的B細胞激活因子拮抗劑、或上述核苷酸序列、或上述 基因載體在制備治療自身免疫疾病的藥物中的用途。本發明同時提供了上述的B細胞激活因子拮抗劑、或上述核苷酸序列、或上述的 基因載體在作為主要活性成分的防治自身免疫疾病的藥物。其中，上述的自身免疫性疾病主要是指類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、干燥綜 合癥(Sjogren氏綜合癥)。為了更好的實施本發明，本發明還提供了一種制備上述B細胞激活因子拮抗劑的 方法。該方法包括以下步驟將編碼B細胞激活因子拮抗劑的基因可操作地裝入表達載體， 將表達載體轉入宿主，宿主培養增殖后即從宿主和/或其培養上清液分離純化得到B細胞 激活因子拮抗劑。其中，上述B細胞激活因子拮抗劑的制備方法中所述的表達載體為真核質粒表達 載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。其中，上述B細胞激活因子拮抗劑的制備方法中所述的宿主為真核細胞。其中，上述B細胞激活因子拮抗劑的制備方法中所述的分離純化方法為將大規模 培養宿主的上清液用美國GE公司的凝膠Mab-Select柱進行純化，再過SP柱層析得到B細 胞激活因子拮抗劑。顯然，上述方法中的表達載體可使用常用的真核表達載體、各種基因工程常用的 宿主細胞，分離純化方法也可以參考使用現有的常用方法以獲得較純的本發明B細胞激活 因子拮抗劑。而將編碼B細胞激活因子拮抗劑的基因可操作地裝入表達載體，以及將表達 載體轉入宿主，則可以參照各種基因工程手冊和具體使用的載體與宿主細胞的說明進行。本發明設計并構建了 TACI受體與BAFF結合的結構域2 (CRD2)與Br3受體與BAFF 結合的結構域(CRD)融合的片段SEQ ID No. 1，為了提高其體內穩定性、延長半衰期，可將 其與免疫球蛋白的Fc片段進行融合，得到新的融合蛋白分子。比如可將其與IgGl、IgG2 或IgG4的Fc片段融合，本發明實例中將其與IgGl的Fc片段融合得到新的融合蛋白分 子-BAFF Trap，實驗表明具有B細胞激活因子拮抗劑的功能。當然，本發明B細胞激活因子拮抗劑由于是蛋白質，因此主要的制備方法還是借用現有的基因工程方法進行發酵生產。 而在進行基因工程發酵生產的時候，為了便于回收產物，一股會在BAFF Trap的編碼序列 的N端加上各種常用的分泌信號肽的編碼核苷酸序列，比如人IL-2信號肽的編碼核苷酸序 列。本發明的有益效果在于本發明的新型B細胞激活因子拮抗劑——BAFF Trap可 大大提高與BAFF的結合效果，降低治療使用劑量，提高治療自身免疫疾病的效果。為自身 免疫性疾病的防治提供了 一種新的有效選擇。
圖1BAFF與其受體的相互作用示意圖，摘自Nature Review Immunology, 2002, 2 465-475。圖2BAFF Trap結構示意圖。圖 3IgGl Fc 的 RT-PCR 結果(1 % Agarose 電泳)。M:100bp DNA Ladder (Invitrogen) ；1 :RT_PCR 產物。圖4重組質粒pEF-BT的構建過程示意圖。圖5真核表達載體pEFl/V5_His A的質粒圖譜。圖6重組質粒pEF-TACI_Br3的Kpn I/BamHI雙酶切鑒定結果(1 % Agarose電 泳)。M :lkb DNALadder (Invitrogen) ；11、15、16、26、27 分別代表不同克隆。圖7重組質粒pEF-BT的Kpn I/Pme I雙酶切鑒定結果(1 % Agarose電泳)。M lkb DNALadder (Invitrogen) ；1、2、5、6、7、10 分別代表不同克隆。圖8純化后蛋白的電泳圖譜(12% SDS-PAGE)。M 蛋白分子量標準；1 非還原條 件；2 還原條件。圖9融合蛋白BT與BAFF結合常數的測定結果。圖10類風濕性關節炎模型中體重以及臨床評分的變化A為體重變化；B為臨床評分變化。圖11類風濕性關節炎模型中踝關節的HE圖(放大倍數40)。A為建模組；B為hlgG組；C為BT組。圖12B220流式檢測圖A 正常大鼠組；B 生理鹽水組；H :hIgG組；B :BT組。
具體實施例方式以下通過具體實施方式
結合附圖對本發明進行詳細說明實施例一 BAFF Trap蛋白編碼基因的構建及表達一、BAFF Trap蛋白編碼基因的獲得采用全基因合成的方法得到TACI結構域1與Br3結構域融合cDNA片段，5’端包 含人11-2信號肽序列。同時，設計如下引物擴增IgGl Fc片段cDNA 5，引物(SEQ ID No. 6) :5，CGG GAT CCG ACA AAA CTC ACA CAT GCC 3，3，引物(SEQ ID No. 7) :5，AGC TTT GTT TAA ACT CAT TTA CCC GGA GAC AGG3，
5
為了能將PCR產物插入克隆載體，在5’弓丨物中設計入BamH I位點，在3’弓丨物中 設計入Pme I位點。以人淋巴細胞總RNA為模板，RT-PCR擴增IgGl Fc片段，反應條件如下RT-PCR反應混合物在50°C變性30分鐘后，按下列條件進行反應逆轉錄反應94°C變性30秒；55°C退火30秒；68°C延伸1分鐘。反應10個循環。PCR反應94°C變性30秒；60°C退火30秒；68°C延伸1分鐘。反應25個循環。然 后68 °C再延伸12分鐘。反應完成后，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物。如圖3所示得到了預計大小 ( 700bp)的DNA片段。全長的BAFF Trap的核苷酸與蛋白序列分別如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 3所示。 BAFFTrap的結構示意圖如圖2所示，融合蛋白以二聚體形式存在。二、BAFF Trap蛋白編碼基因重組質粒的構建如上所述，在全基因合成片段(TACI-Br3)中的5’端設計入Kpn I酶切位點，3’ 端設計入BamH I酶切位點，這樣可將TACI_Br3的cDNA片段直接插入真核表達載體pEFl/ V5-HisA(購自美國Invitrogen公司，其圖譜見圖5)的多克隆位點Kpn I/BamH I中，IgGl Fc片段插入到多克隆位點BamH I/Pme I中，即可得到BAFF Trap融合片段。其構建過程見 圖4。1.重組質粒pEF-TACI_Br3的構建將全基因合成片段TACI-Br3插入pEFl/V5-HisA的Kpn I/BamH I位點，連接產物 pEF-TACI-Br3轉化大腸桿菌JM109,隨機挑選28個克隆進行篩選。11、15、16、26和27號 克隆均用Kpn I/BamH I回切出目的片段，重組質粒pEF_TACI_Br3的酶切鑒定結果見圖6。 選26號克隆進行測序鑒定，其序列正確，進一步構建與IgGl Fc的融合基因。2.重組質粒pEF-BT的構建以pEF-TACI_Br3 26號克隆為基礎，將IgGl Fc片段插入BamH I/Pme I位點，連 接產物pEF-BT轉化大腸桿菌JM109，隨機挑選12個克隆進行篩選。重組質粒pEF_BT的酶 切鑒定結果見圖7，1、2、6、7、10號克隆均用Kpn I/Pme I回切出目的片段，選10號克隆送 去測序鑒定。測序結果表明，我們得到的重組質粒中的目的基因與設計的BAFF Trap基因 (TACI-Br3-IgGl Fc)序列(即 SEQ ID No. 5) 一致。四、目的蛋白的穩定表達株-CH0-BT的篩選及鑒定取5 ii g大量制備的上述重組質粒pEF-BT，利用脂質體Lipofectamine2000轉染 CH0-K1細胞(購自美國ATCC)，兩天后按1 5的比例傳代，加入0. 4mg/ml的G418 (購自 美國Invitrogen公司)篩選，10天可見克隆形成。隨機消化96個邊緣明顯分開、細胞狀態 良好的單克隆接種于6個24孔板培養(第一輪篩選)。取兩天后的培養上清用ELISA檢測融合蛋白的表達情況，從中選出表達陽性的24 個克隆分別接種于1個24孔板(第二輪篩選)，培養2天后，取上清用ELISA檢測融合蛋白 的表達情況，從中選取表達較高的6個克隆1-B2、1-B8、1-D7、1-E1、2-D1、2-F6進一步用有 限稀釋法進行篩選。分別接種96孔板(1細胞/孔/200 u 1)(第三輪篩選)，待細胞長滿后(大約8天 后)，取培養上清用ELISA檢測融合蛋白的表達情況，分別挑取表達較高的6個克隆接種24孔板。待細胞長滿后，接種6孔板，ELISA檢測各克隆的表達情況，結果見表1。表1 ELISA檢測第三輪篩選出的6個克隆的亞克隆48小時后上清的表達情況 選擇表達較高的l-B8-l、l-D7-7和1-E1-7放大培養，擴入T75方瓶，4天后收獲上 清用Pr. A-Sepharose吸附，檢測融合蛋白的表達情況，結果表明純化得到的蛋白與預計蛋 白分子量大小一致，并通過Western Blot進行了驗證。分別取1-B8-1、1-D7-7、1-E1_7接種96孔板(1細胞/孔/200 yl)(第四輪篩 選)，待細胞長滿后(大約10天后)，取培養上清用ELISA檢測融合蛋白的表達情況， 三個克隆均為均一的克隆，將其中表達最高的分別擴增、保種，命名為CHO-BT(l-BS-l)、 CHO-BT (1-D7-7)、CHO-BT (1-E1-7)，挑取 CHO-BT (1-E1-7)進行下一步表達和純化。五、融合蛋白BAFF Trap (BT)的大量表達及純化大規模培養上述篩選出的CHO-BT (1_E1_7)細胞，上清液用凝膠Mab-Select (購自 美國GE公司)進行純化，再過SP柱層析，兩步柱層析后蛋白的電泳圖譜見圖8。結果表明，純化后目的蛋白在還原性條件下分子量為38kDa，在非還原條件下分子量為76kDa，以二聚 體形式存在，與我們預計一致。純化后蛋白純度可達到95%以上。實施例二融合蛋白BAFF Trap (BT)的鑒定和功效實驗1、融合蛋白BAFF Trap (BT)與BAFF結合常數的測定采用Human BAFF/BLYS/TNFSF13B Immunoassay 試劑盒(購自美國 R&D Systems 公 司)檢測融合蛋白BT與BAFF的結合，將標準BAFF蛋白與不同濃度的BT室溫孵育過夜，同 時設置Br3_Fc (購自美國R&D Systems公司)和TACI-Fc (購自美國R&D Systems公司)對 照品以及標準品，其余操作嚴格按試劑盒說明進行，實驗結果見圖9。結果表明，與TACI-Fc 和Br3-Fc相比，BT能更為有效地與BAFF結合，其結合常數至少可提高3倍以上。該結果 表明本發明的新型BAFF拮抗劑——BAFF Trap能夠有效結合BAFF，效果遠優于TACI-Fc和 Br3-Fc。2、融合蛋白BAFF Trap (BT)體外細胞結合的鑒定Raji細胞(購自美國ATCC)為高表達BAFF受體(TACI和Br3)的人B細胞株，我 們用于檢測BT競爭性拮抗BAFF的結合作用。收獲處于對數生長期的Raji細胞，分別加入 不同濃度的BT蛋白和抗TACI抗體/抗Br3抗體，室溫孵育1小時，洗滌后加入FITC標記二 抗，室溫避光孵育半小時，洗滌后上流式細胞儀檢測，結果見表2。(其中，hlgG包含人IgGl Fc片段，作為無關蛋白組。)表2 BT阻斷Raji細胞表面BAFF受體的流式檢測結果 結果表明，BT可競爭性抑制抗體與Raji細胞上的BAFF受體——TACI和Br3的結 合，并且呈現劑量依存關系。說明在體外實驗中，BT可以作為拮抗劑抑制BAFF與其細胞膜 表面受體的結合。3、融合蛋白BAFF Trap (BT)在類風濕性關節炎模型小鼠中的治療作用建立大鼠佐劑型關節炎模型(AIA)研究BT的體內治療效果。實驗方法6_8周齡的雌性Lewis大鼠，尾根部皮內注射100 yl含5mg/ml滅活卡 介苗的不完全弗氏佐劑，對照組老鼠不做處理。發病后隨機分成3組進行處理生理鹽水 組、hlgG組、融合蛋白BT組，每組10只，腹腔給藥100 u g/100 u 1/只，每周治療兩次。(hlgG組，包含人IgGl Fc片段，作為無關治療組。)每天稱量其體重，雙盲法對其四肢進行臨床評 分。每周一次眼眶靜脈取血，分離血清，負80度冰箱保存。治療后45天處死老鼠，取其踝關節，HE染色。取脾臟分離淋巴細胞，用流式細胞 儀檢測脾臟B細胞含量(B220抗體檢測)。實驗結果各組小鼠體重以及臨床評分的變化見圖10，與生理鹽水組和hlgG組相 比，BT治療組大鼠體重恢復較快，有顯著性差異(P < 0. 01)；臨床得分BT組治療后開始下 降，免疫后31天回復到0，而hlgG組到第5 1天回復到0，生理鹽水組要到第61天回復到 0，具有顯著性差異(P<0.01)。各組關節HE染色結果見圖11，可見生理鹽水組和higG組關節面破壞，關節腔內有 大量淋巴細胞浸潤，而BT治療組關節面光滑，關節腔內的淋巴細胞數量很少，與正常的關
節一致。B220流式檢測結果見圖12，BT治療組大鼠脾細胞B220陽性細胞比例為17. 6%, 遠低于生理鹽水組(32.6%)和hlgG治療組(27. 1%)，具有顯著性差異(P< 0.01)，與正 常大鼠(21.4%)基本一致。通過上述實例表明，本發明成功制得了融合蛋白BAFF Trap (BT)，該融合蛋白能夠 作為BAFF受體的拮抗劑使用。能夠對AIA模型小鼠產生明顯的治療作用，為自身免疫疾病 的治療提供了 一種新的有效選擇。參考文獻1. Moore PA, Belvedere 0, Orr A, et al. BLyS :member of the tumor necrosis factor family and Blymphocyte stimulator. Science,1999 ；285 260~2632. Hahne M, Kataoka T, Schroter M, et al. APRIL, a new ligand of the tumor necrosis factor family, stimulates tumor cell growth.J Exp Med,1998 ； 188 1185-11903. Nardelli B, Belvedere 0, Roschke V, et al.Synthesis and release of B-lymphocyte stimulator from myeloid cells. Blood,2001 ；97 :198—2044. Scapini P,Nardelli B,Nadali G,et al. G-CSF-stimulated neutrophils are a prominent source of functional BLyS. J Exp Med,2003 ; 197 :297_3025. He B,Chadburn A,Jou E,et al. Lymphoma B cells evade apoptosis through the TNF family members BAFF/BLyS and APRIL. J Immunol, 2004；172 3268-32796. Huard B, Arlettaz L, Ambrose C, et al. BAFF production by antigen-presenting cells provides Tcell co-stimulation. Int Immunol,2004 ； 16 467-4757. Hase H, Kanno Y, Kojima M, et al. BAFF/BLyS can potentiate B-cell selection with the B-cellcoreceptor complex. Blood, 2004 ；103 2257~22658. Litinskiy MB,Nardelli B,Hilbert DM,et al. DCs induce CD40_ind印endent immunoglobulin class switching through BLyS and APRIL. Nat Immunol,2002 ；3 822-8299. Gavin AL,Ait-Azzouzene D,ffare CF,et al. Delta BAFF,an alternate splice isoform that regulates receptor binding and biopresentation of the B cellsurvival cytokine, BAFF. J Biol Chem, 2003 ；278 38220-3822810. Gavin AL, Duong B, Skog P, et al. deltaBAFF, a splice isoform of BAFF, opposes full-lengthBAFF activity in vivo in transgenic mouse models. J Immunol, 2005 ；175 319-32811. Hymowitz SG, Patel DR, ffallweber HJ, et al. Structures of APRIL—receptor complexes like BCMA, TACI employs only a single cysteine—rich domain for high affinity ligand binding. J Biol Chem, 2005 ；280 :7218_722712. Kim HM, Yu KS, Lee ME, et al. Crystal structure of the BAFF-BAFF-R complex and its implications for receptor activation. Nat Struct Biol, 2003 ；10 342-34813. Hatzoglou A,Roussel J,Bourgeade MF,et al. TNF receptor family member BCMA(B cell maturation)associates with TNF receptor-associated factor(TRAF)1, TRAF2,and TRAF3 and activates NF-kappa B,elk-1,c-Jun N-terminal kinase,and p38 mitogen-activated protein kinase. J Immunol,2000 ; 165 :1322-133014. Xia XZ,Treanor J,Senaldi G,et al. TACI is a TRAF-interacting receptor for TALL-1,a tumor necrosis factor family member involved in B cell regulation. J Exp Med, 2000 ；192 :137-14315. Xu LG, Shu HB. TNFR-associated factor-3 is associated with BAFF-R and negatively regulates BAFF-R-mediated NF-kappa B activation and IL—10 production. J Immunol, 2002 ； 169 :6883_688916. Seshasayee D, Valdez P, Yan M, et al. Loss of TACI causes fatal lymphoproliferation and autoimmunity, establishing TACI as an inhibitory BLyS receptor. Immunity, 2003 ；18 :279_288SEQUENCE LISTING<110>四川大學<120>B細胞激活因子拮抗劑及其制備方法與用途<130>A100188K<160>7<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>87<212>PRT<213>artificial<220><223>artificial<400>1Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly15Asp Cys lie Ser Cys Ala Ser lie
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agctttgttt aaactcattt acccggagac agg3權利要求
一種B細胞激活因子拮抗劑，其特征在于是具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的蛋白。
2.根據權利要求1所述的B細胞激活因子拮抗劑，其特征在于其氨基酸序列為在 SEQID No. 1所示的氨基酸序列的C-末端連接人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的B細胞激活因子拮抗劑，其特征在于其氨基酸序列為SEQ IDNo. 2 所示。
4.根據權利要求1所述的B細胞激活因子拮抗劑，其特征在于在其N-末端連接有信 號肽。
5.根據權利要求4所述的B細胞激活因子拮抗劑，其特征在于其氨基酸序列為SEQ IDNo. 3 所示。
6.編碼權利要求1 5任一項所述的B細胞激活因子拮抗劑的核苷酸序列。
7.根據權利要求6所述編碼B細胞激活因子拮抗劑的核苷酸序列，其特征在于其核 苷酸序列為SEQ ID No. 4所示
8.根據權利要求7所述編碼B細胞激活因子拮抗劑的核苷酸序列，其特征在于其核 苷酸序列為SEQ ID No. 5所示
9.含有權利要求6 8任一項所述核苷酸序列的基因載體。
10.含有權利要求9所述基因載體的宿主細胞。
11.權利要求1 5任一項所述的B細胞激活因子拮抗劑、或權利要求6 8任一項所 述核苷酸序列、或權利要求9所述的基因載體在制備治療自身免疫疾病的藥物中的用途。
12.根據權利要求11所述的用途，其特征在于所述的自身免疫性疾病為類風濕性關 節炎、系統性紅斑狼瘡或干燥綜合癥。
13.制備治療自身免疫疾病的藥物，其特征在于以權利要求1 5任一項所述的B細 胞激活因子拮抗劑、或以權利要求6 8任一項所述核苷酸序列、或以權利要求9所述的基 因載體作為主要活性成分。
14.根據權利要求13所述的治療自身免疫疾病的藥物，其特征在于所述的自身免疫 性疾病為類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡或干燥綜合癥。
15.權利要求1 5任一項所述的B細胞激活因子拮抗劑的制備方法，其特征在于包括 以下步驟將編碼B細胞激活因子拮抗劑的基因裝入表達載體，將表達載體轉入宿主，宿主 培養增殖后從宿主或培養上清液分離純化得到B細胞激活因子拮抗劑。
16.根據權利要求15所述的B細胞激活因子拮抗劑的制備方法，其特征在于所述的 表達載體為真核質粒表達載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。
17.根據權利要求15所述的B細胞激活因子拮抗劑的制備方法，其特征在于所述的 宿主為真核細胞。
18.根據權利要求15所述的B細胞激活因子拮抗劑的制備方法，其特征在于所述的 分離純化方法為將大規模培養宿主的上清液用美國GE公司的凝膠Mab-Select柱進行純 化，再過SP柱層析得到B細胞激活因子拮抗劑。
全文摘要
本發明屬于基因工程藥物領域，具體涉及一種新型B細胞激活因子(BAFF)拈抗劑及其用途。本發明要解決的技術問題是為自身免疫性疾病的防治尋找新的有效選擇。該B細胞激活因子受體拈抗劑主要由TACI受體與BAFF結合的結構域2與Br3受體與BAFF結合的結構域融合，并將其與IgG1的Fc片段融合，得到新的融合蛋白分子。實驗表明，其具有BAFF拈抗劑的功能，能夠治療自身免疫性疾病，為自身免疫性疾病的防治提供了一種新的有效選擇。
文檔編號C12N5/10GK101851278SQ20101018390
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月26日 優先權日2010年5月26日
發明者楊莉, 魏于全 申請人:四川大學