專利名稱：檢測兩優培九種子純度的引物及其方法
技術領域：
本發明檢測兩優培九種子純度的引物及其方法，屬于生物技術領域。專用于兩優培九種子純度的快速準確檢測。
背景技術：
農作物種子純度是種子定級的主要依據，是種子質量控制過程中最棘手的問題。多年來，許多種子工作者主要是通過田間檢驗(如海南檢驗)等方法鑒定雜交稻種子純度，不但檢驗所需周期長，而且需要消耗大量的人力、物力、財力，無法滿足種子經營工作的需要。也有利用苗期形態、同工酶電泳等方法進行鑒定的報道，由于重復性及可靠性不夠好，影響檢測的準確性，而未能廣泛使用。因此，尋找一種穩定可靠又快速簡便的種子純度鑒定方法迫在眉睫。
水稻是單子葉分子生物學研究的模式植物，已完成了秈、粳兩個亞種的全基因測序，已鑒定并開發出多種類型的分子標記，用于研究水稻起源、分化、有利性狀的基因標記等研究。SSR標記(也稱微衛星標記)在水稻基因組中廣泛存在，由于具有操作簡單、重復性好、成本相對低而受到眾多研究者的青睞。
兩系雜交稻“兩優培九”于2001年通過全國審定。該組合表現優質、高產、抗病，綜合性狀好，已成為長江中下游稻區主栽品種，但母本培矮64 S是光溫敏核不育系，在育性敏感期如氣溫連續3 d低于23.5℃時，會部分自交結實，從而降低雜交種純度，會在生產上造成損失。如能在種子收購前或收購時，采用快速、準確的純度鑒定方法，對擬收購或已收購的種子標樣進行純度檢測，對于種子經營和第二年的生產有重要意義。本試驗采用水稻基因組中廣泛存在的SSR標記，對兩優培九及其雙親進行分子水平的多態性分析，建立一套標準化快速鑒定體系，用于兩優培九種子純度的室內鑒定。
發明內容技術問題本發明的目的是解決現有技術中兩優培九種子純度的田間鑒定檢測方法所需時間長，消耗大的問題，提供兩優培九種子純度的室內檢測方法，對兩優培九種子進行SSR分子標記檢測，快速、準確。
技術方案檢測兩優培九種子純度的引物，包括引物RM7117上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCAC和引物RM180上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG上述引物用于檢測兩優培九種子純度的方法，包括1)材料的準備供試種子培苗至3-5cm高度；2)微量法提取植物DNA取上述種子幼苗0.1g于1.5mLEp管中，將幼苗搗碎后加100μL DNA提取緩沖液，65℃水浴15min，取出后在室溫放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板進行PCR擴增；所用DNA提取緩沖液為PH＝8.0的Tris-HCL為100m moL，NaCl為0.5mol/L，TritonX-100體積比為0.3％；3)PCR擴增PCR反應體系0.2ml薄壁PCR反應管中，加1μL模板10ng/μL DNA，1μL 4pmol/μL SSR引物RM180，1μL 4pmol/μL SSR引物RM7117，0.2μL 2.5mM dNTP，0.25μL 2u/μL Tag酶，1.6ul PCR buffer，4.95μL無菌水，總體積10μL，混勻后于PCR擴增儀上進行PCR擴增；PCR反應程序首先94℃預變性5min；然后40個循環94℃變性45s，55℃復性50s，72℃延伸1.5min；接著72℃延伸10min；最后4℃保存；4)聚丙烯酰胺凝膠電泳按照《分子克隆實驗指南，第二版》，科學出版社1993年327-330頁所述方法；5)銀染100mL10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL固定12min，0.2％AgNO3滲透12min，100mL超純水漂洗30s、10％Na2S2O320μL漂洗30s，1.5％NaOH，甲醛1mL顯色15min；6)確定純度觀察電泳結果，能擴增得到6條分子量分別為130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp條帶的確定為兩優培九種子，其余缺失或含有其他分子量的條帶均為混雜種子，通過計算即可獲得兩優培九種子純度。
有益效果 本發明與現有技術相比，其優點表現在(1)提供特異的SSR引物RM7117和RM180來檢測兩優培九種子的純度，RM7117上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC
下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCACRM180上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG(2)一步法提取兩優培九種子植物的DNA，方便易行。
(3)速度快用SSR分子標記檢測兩優培九種子的純度有重要的應用價值。兩優培九種子純度不高，給生產帶來很大影響，如能在種子收購前或收購時，采用快速、準確的純度鑒定方法，對擬收購或已收購的種子標樣進行純度檢測，對于種子經營和第二年的大田生產有重要意義。而正常的海南鑒定所需時間長，投入的人力物力大，無法滿足生產經營需要。此發明只需把種子發芽三到四天后提取DNA，用已經篩選好的SSR引物進行分子標記檢測，“兩優培九”種子純度的分子鑒定體系，應用該體系可在5-7天內完成未知樣品的檢測，(4)準確率高SSR標記(也稱微衛星標記)在水稻基因組中廣泛存在，由于SSR標記位點具有高水平的等位基因多樣性，表現為共顯性的孟德爾遺傳，簡單重復序列長度多態性很容易通過PCR快速擴增和高分辨率的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。本發明在篩選的294對SSR引物中，有26對在雙親中表現出多態，為分子水平檢測種子純度提供了便利。通過進一步篩選，最后確定采用二重PCR技術在一次反應完成兩對引物的擴增，從而增加了鑒定的可靠性。
(5)在2005年10月至2006年3月檢測的100多個兩優培九種子樣品與海南鑒定結果非常吻合。
(6)實用簡單本方法鑒定雜交水稻種子純度的整個程序，只是幾次機械式的加樣過程，易于操作，具有更好的商業化應用前景。
(四)說明書附1部分二重PCR擴增的結果A.引物66&219號B.引物155&143號C.引物143&66號D.引物66&175號圖2本發明選定的兩對引物PCR擴增的結果最后從四個組合中選取66號與175號這個組合來進行二重PCR擴增反應，該組合的六條PCR擴增產物編號為L1-L6、分子量分別為130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp左右。
具體實施例方式
實例一1)植物材料與育苗不同純度的兩優培九(雜種F1)樣品3個，(樣品A、樣品B和樣品C的純度分別為99.3％、95％、85％)，所有種子均由江蘇省明天種業有限公司提供。將供試種子表面消毒后，浸種兩天(30℃)，催芽一天(28℃)后，播種在置有消毒石英砂的育苗盤中，在光照培養箱中(26℃)生長3-5天后取樣，抽提DNA備用。
2)DNA提取取植物組織0.1g于1.5mLEp管中，先將組織搗碎，然后加100μL DNA提取緩沖液，65℃水浴15min，取出后在室溫放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板進行PCR。
所用DNA提取緩沖液為C(Tris-HCL)＝100m moL(PH＝8.0)，C(NaCL)＝0.5mol/L，φ(TritonX-100)＝0.3％3)PCR擴增PCR反應體系0.2ml薄壁PCR反應管中(三和耀華公司)，加1μL模板DNA(10ng/μL)，1μLSSR引物RM180(4pmol/μL)，1μLSSR引物RM7117(4pmol/μL)，0.2μLdNTP(2.5mM)，0.25μL Tag酶(上海鼎國公司)(2u/μL)，1.6ul PCR buffer，4.95μL無菌水，總體積10μL，混勻后于PCR擴增儀(杭州博日)上進行PCR擴增。
PCR反應程序94℃預變性5min；共40個循環94℃變性45s，55℃復性50s，72℃延伸1.5min；72℃延伸10min；4℃保存。
4)聚丙烯酰胺凝膠電泳按照《分子克隆實驗指南(第二版)》(科學出版社1993年327-330頁)方法，先用1％瓊脂糖封邊后，將8％的工作液灌入玻璃板空隙中(8％的凝膠工作液每100mL中10×TBE10mL，40％丙烯酰胺(19∶1)20mL，超純水70mL，TEMED 100μL，10％AP 1000μL)，插上梳子，等凝膠凝固后(約40分鐘)，往槽中倒入足以覆蓋住樣品孔的0.5×TBE緩沖液，拔出梳子，10μLPCR擴增樣品中加入2μL染色劑，加樣2.5μL，170V電壓下電泳2小時。
銀染(100mL)固定(10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL)12min，滲透(0.2％AgNO3)12min，漂洗(100mL超純水)30s、(10％Na2S2O320μL)30s，顯色(1.5％NaOH，甲醛1mL)15min。
在膠片觀察燈下觀察結果在兩優培九(F1)中擴增得到6條分子量分別60bp和115bp、130bp、110bp、80bp、65bp不同的條帶(圖2)，母本培矮64S擴增得到2條分子量分別60bp和115bp的條帶，父本9311擴增得到4條分子量分別130bp、110bp、80bp、65bp的條帶，說明兩優培九(F1)中擴增得到的6條條帶中2條分子量為60bp和115bp的條帶來自母本培矮64S，另外4條分子量為130bp、110bp、80bp、65bp的條帶來自父本9311，可以很清楚地區分“兩優培九”雜種種子中混入的母本自交種子。通過計算，三批樣品A、B、C所測純度分別為99.3％、95％、85％，與田間結果一致。
實施例22005年10月份至2006年3月一共為本公司檢測種子樣品100個，每個樣品代表數量10000kg。具體操作方法供試種子表面消毒后，浸種兩天，催芽一天后，播種在置有消毒石英砂的育苗盤中，在光照培養箱中濕潤生長3-5天后取樣，用微量法快速提取植物DNA。微量法取植物組織0.1g于1.5mLEp管中，先將組織搗碎，然后加100μL DNA提取緩沖液，65℃水浴15min，取出后在室溫放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板進行PCR。
所用DNA提取緩沖液為C(Tris-HCL)＝100m moL(PH＝8.0)，C(NaCL)＝0.5mol/L，φ(TritonX-100)＝0.3％PCR擴增PCR反應體系0.2ml薄壁PCR反應管中(三和耀華)，加1μL模板DNA(10ng/μL)，1μLSSR引物RM180(4pmol/μL)，1μLSSR引物RM7117(4pmol/μL)，0.2μLdNTP(2.5mM)，0.25μL Tag酶(上海鼎國)(2u/μL)，1.6ul PCR buffer，4.95μL無菌水，總體積10μL，混勻后于PCR擴增儀(杭州博日)上進行PCR擴增。
PCR反應程序94℃預變性5min；94℃變性45s，55℃復性50s，72℃延伸1.5min，共40個循環；72℃延伸10min，；4℃保存；每個DNA模板每對引物，進行兩次PCR重復。
聚丙烯酰胺凝膠電泳按照《分子克隆實驗指南(第二版)》(科學出版社1993年327-330頁)方法，先用1％瓊脂糖封邊后，將8％的工作液灌入玻璃板空隙中(8％的凝膠工作液每100mL中10×TBE10mL，40％丙烯酰胺(19∶1)20mL，超純水70mL，TEMED 100μL，10％AP 1000μL)，插上梳子，等凝膠凝固后(約40分鐘)，往槽中倒入足以覆蓋住樣品孔的0.5×TBE緩沖液，拔出梳子，10μLPCR擴增樣品中加入2μL染色劑，加樣2.5μL，170V電壓下電泳2小時。
銀染(100 mL)固定(10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL)12min，滲透(0.2％AgNO3)12min，漂洗(100mL超純水)30s、(10％Na2S2O320μL)30s，顯色(1.5％NaOH，甲醛1mL)15min。
在膠片觀察燈下觀察結果在F1中擴增得到6條電泳遷移率明顯不同的條帶(其中兩條來自母本，四條來自父本)，可以很清楚地區分“兩優培九”雜種種子中混入的母本自交種子。其中2條分子量為60bp和115bp的條帶來自母本培矮64S，另外4條分子量為130bp、110bp、80bp、65bp的條帶來自父本9311，可以很清楚地區分“兩優培九”雜種種子中混入的母本自交種子。最終確定兩優培九種子的純度。
所得結果與海南鑒定結果比較統計為與海南結果差距在0.5％以下的有45個樣品；與海南結果差距在0.5％-1％的有51個樣品；與海南結果差距在1％-2％的有4個樣品。
權利要求
1.檢測兩優培九種子純度的引物，包括引物RM7117上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCAC和引物RM180上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG
2.權利要求1所述引物用于檢測兩優培九種子純度的方法，包括1)材料的準備供試種子培苗至3-5cm高度；2)微量法提取植物DNA取上述種子幼苗0.1g于1.5mLEp管中，將幼苗搗碎后加100μL DNA提取緩沖液，65℃水浴15min，取出后在室溫放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板進行PCR擴增；所用DNA提取緩沖液為PH＝8.0的Tris-HCL為100m moL，NaCl為0.5mol/L，TritonX-100體積比為0.3％；3)PCR擴增PCR反應體系0.2ml薄壁PCR反應管中，加1μL模板10ng/μL DNA，1μL 4pmol/μL SSR引物RM180，1μL 4pmol/μL SSR引物RM7117，0.2μL 2.5mMdNTP，0.25μL 2u/μL Tag酶，1.6ul PCR buffer，4.95μL無菌水，總體積10μL，混勻后于PCR擴增儀上進行PCR擴增；PCR反應程序首先94℃預變性5min；然后40個循環94℃變性45s，55℃復性50s，72℃延伸1.5min；接著72℃延伸10min；最后4℃保存；4)聚丙烯酰胺凝膠電泳按照《分子克隆實驗指南，第二版》，科學出版社1993年327-330頁所述方法；5)銀染100mL10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL固定12min，0.2％AgNO3滲透12min，100mL超純水漂洗30s、10％Na2S2O320μL漂洗30s，1.5％NaOH，甲醛1mL顯色15min；6)確定純度觀察電泳結果，能擴增得到6條分子量分別為130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp條帶的確定為兩優培九種子，其余缺失或含有其他分子量的條帶均為混雜種子，通過計算即可獲得兩優培九種子純度。
全文摘要
本發明檢測兩優培九種子純度的引物及其方法，屬于生物技術領域。專用于兩優培九種子純度的快速準確檢測。以兩系雜交稻“兩優培九”及其雙親的DNA為摸板，選擇兩對SSR引物組合后，在F
文檔編號C12Q1/68GK1884577SQ20061001195
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月22日 優先權日2006年5月22日
發明者陳忠明, 胡興雨, 王建飛, 王偉明, 王州飛, 張紅生 申請人:江蘇明天種業科技有限公司, 南京農業大學