專利名稱：海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學DNA標記技術與應用領域，特別涉及海草喜鹽草 (Halophila ovalis(R. Br. ) Hook.)微衛星標記的篩選方法和應用。
背景技術：
喜鹽草(Halophila ovalis (R. Br. )Hook.)屬于水鱉科喜鹽草屬的一種多年生海草，是海草中一種體型較小的廣生性物種，廣泛分布的印度-西太平洋區的潮間帶至潮下帶柔軟的稀泥和粗糙的珊瑚礁中(C. den Hartog等，《海草的生物學、生態學和保護》，2006， 第二章，25-50頁)，在我國喜鹽草主要分布于華南沿海的廣西、廣東、海南和香港的海草床 (黃小平等，《科學通報》，2006，增刊II，136-152頁)。但是近年來，由于人類活動和自然環境等因素影響，海草床日趨衰退。隨著人類對海草床的生態功能和經濟功能的關注，喜鹽草的種質資源鑒定、遺傳多樣性分析以及遺傳圖譜構建等研究工作逐漸深入，因此對喜鹽草的分子遺傳標記的需求也越來越多。不同的分子遺傳標記因其多態性和檢測變異能力的差異，所揭示的多樣性程度存在較大的差異。早期的海草種群遺傳學研究中，等位酶是最常用的分子遺傳標記，而利用等位酶標記的海草研究中揭示的遺傳多樣性都很低。隨著DNA分子標記的發展，人們發現海草的遺傳多樣性并不像等位酶標記揭示的那樣低，甚至在一些種群中遺傳變異還很高。然而，共顯性遺傳的微衛星標記相對于RAPD和AFLP而言，容易操作、重復性好，同時多態性高、選擇中性、基因組出現頻率高。但是由于缺乏喜鹽草微衛星標記，喜鹽草遺傳學研究受到了一定的限制，所以十分需要獲取喜鹽草微衛星標記。
發明內容
本發明的目的是提供一種喜鹽草微衛星標記篩選方法，用以篩選出穩定性高、重復性好、多態性高的喜鹽草微衛星標記。 本發明目的是這樣實現的首先使用改良的CTAB (cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)方法提取喜鹽草葉片組織的基因組DNA ；再應用生物素鏈霉親和素捕獲法得到含有微衛星的DNA片段，且對DNA片段進行測序，篩選出堿基重復 (2-6個)單元多于5個的DNA序列；然后在微衛星重復序列兩端的側翼序列設計特異性的引物，并對不同地理分布群中的喜鹽草樣本基因組DNA進行PCR擴增以檢測、優化引物；最后對PCR產物片段大小進行分析，確定每個個體的基因型，獲得喜鹽草的遺傳多態性圖譜， 確定重復性、穩定性和多態性高的微衛星標記。本發明是按照以下操作技術完成的首先使用改良的CTAB方法提取喜鹽草葉片組織的基因組DNA。改良的CTAB方法包括步驟1)將硅膠干燥并用75%乙醇擦拭干凈的海草喜鹽草干樣在粉碎機粉碎；2)向所述粉碎后的干樣中加入預冷的洗脫緩沖液，混勻， 所述洗脫緩沖液含有0.02g/ml的PVP和2.8yl/ml的β-巰基乙醇；3)轉移至離心管中，4°C，以12000轉/分的速度離心15分鐘后棄上清液，加入2XCTAB提取緩沖液、混勻，65°C水浴2小時，所述提取緩沖液含有2. 8 μ 1/ml的β -巰基乙醇；4)加入等體積的體積比24 1的氯仿-異戊醇、混勻，4°C，以12000轉/分的速度，離心15分鐘后，取上清液， 重復數次；5)在上述步驟取得的上清液中，加入RNAaSe，37°C水浴30分鐘；6)取出水浴，力口入1/3體積的5M NaCl,2/3體積的冰異丙醇(_20°C )，混勻，-20°C沉淀2小時；7)4°C，以 12000轉/分的速度離心15分鐘后棄上清液，加入75%乙醇，將DNA從管底彈起，重復數次； 8)4°C，以10000轉/分的速度離心15分鐘后棄上清液，將管倒扣在干凈的紙巾上；待管壁快干時將管正立，過夜；9)加入滅菌超純水，室溫下溶解DNA。對于以改良的CTAB方法提取的喜鹽草基因組DNA，采用生物素鏈霉親和素捕獲法獲得含有微衛星的DNA片段，并對所得DNA片段進行測序；再使用微衛星檢索軟件 SSRHunter對序列逐一查找，篩選出2_6個堿基重復單元、重復數超過5個的微衛星DNA序列；應用軟件DNAstar中的MegAlign對含有微衛星的DNA序列進行聚類，選取聚類在不同 contig中的序列設計引物。得到的含有重復單元的序列如SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 所示。
對于選出的含有微衛星的喜鹽草DNA片段序列，使用軟件Primer Premier設計引物，設計的參數為(1)引物GC含量為40-60%，且正反向引物相差不超過10% ； (2)退火溫度大于45°C，且正反向引物相差不超過5°C;(3)正反向引物不能發生錯配，且3'端避免互補重疊；(4)引物3'端不選擇A，且不選擇超過3個G或者C; (5)引物長度為18-27bp ； (6)預期的PCR產物長度為100-300bp。對于設計出的特異性引物，對不同地理分布群的喜鹽草樣本基因組DNA進行PCR 擴增，其PCR擴增反應體系為總體積20μ 1，其中包括正反向引物各0. 1μΜ、0. 2mM dNTPs、 1 X PCRbuffer (不含 Mg2+)、1. 5mM Mg2+、IU Taq 酶和 50ng 模板；PCR 擴增在 PTC-200 PCR 儀上完成；PCR擴增反應程序為94°C預變性5分鐘后進入循環，94°C變性30-60秒，根據不同的退火溫度退火30-90秒，72°C延伸30-90秒，30-35個循環，72°C終延伸10分鐘。對于PCR產物利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測多態性，篩選出多態性高(超過 2個等位基因)的引物對，然后在正向引物標記熒光5' HEX,5' TAMRX、5' ΤΕΤ,5' ROX或 5' 6-FAM;再使用熒光標記引物進行PCR擴增，擴增產物在ABI 3130自動測序儀上進行片段分析，并應用軟件GeneMapper進行基因分型，分析確定多態性。最后，篩選出穩定性高、重復性好、多態性高的喜鹽草微衛星標記。本發明的微衛星標記的篩選方法可用于喜鹽草的種質資源鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等研究，進一步用于喜鹽草海草床的管理、保護和恢復工作。
圖1 改良 CTAB 法提取喜鹽草(Halophila ovalis(R. Br. )Hook. )DNA 的瓊脂糖水平電泳檢測結果。圖2 :H02、H05、H031、H036、H051標記PCR擴增產物片段分析結果。
具體實施例方式下面通過實施例詳細敘述本發明在微衛星位點的篩選及其多態性標記的確定。實驗中所用的喜鹽草來自海南和廣西的喜鹽草海草床。 1.篩選微衛星序列使用改良的CTAB方法提取12個喜鹽草樣本上葉片組織的基因組DNA。改良的 CTAB方法具體操作如下(1)將硅膠干燥并用75%乙醇擦拭干凈的0. 05g干樣在粉碎機粉碎40s ； (2)向樣品中加入Iml預冷的洗脫緩沖液(含0. 02g/ml的PVP和2. 8 μ 1/ml的 β -巰基乙醇)，彈，混勻；(3) 4°C，12000轉/分，離心15分鐘；(4)棄上清液，加入780 μ 1 2 X CTAB提取緩沖液(含2. 8 μ 1/ml的β -巰基乙醇)，65°C水浴2小時，每15分鐘上下搖一搖；(5)加入等體積氯仿-異戊醇(體積比24 1)，振蕩，搖晃；(6)41，12000轉/分， 離心15分鐘；(7)取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇，振蕩，搖晃；(8) 4°C，12000轉/ 分，離心15分鐘；(9)取上清液，加2 μ 1的RNAase, 37°C水浴30分鐘；(10)取出水浴，加入 1/3體積的5MNaCl、2/3體積的冰異丙醇(-20°C )，輕輕顛倒，混勻；(11)-20°C沉淀2小時； (12) 4°C，12000轉/分，離心15分鐘；(13)棄上清液，加入500 μ 1的75%乙醇，將DNA從管底彈起；(14) 4°C，10000轉/分，離心15分鐘；(15)棄上清液，加入500 μ 1的75%乙醇， 將DNA從管底彈起；(16) 40C，10000轉/分，離心15分鐘；(17)棄上清液，將管倒扣在干凈的紙巾上。待管壁快干時將管正立，過夜；(18)加入50-100 μ 1的滅菌超純水，室溫下溶解DNA。然后，利用瓊脂糖(1.0%)水平電泳檢測并挑選出質量較好的一個DNA樣品。對于選出的DNA，采用生物素鏈霉親和素捕獲法獲得含有微衛星的DNA片段，并對所得DNA片段進行測序；再使用微衛星檢索軟件SSRHimter對序列逐一查找，篩選出2_6個堿基重復單元、重復數超過5個的微衛星DNA序列；應用軟件DNAstar中的MegAlign對含有微衛星的 DNA序列進行聚類，選取聚類在不同contig中的序列設計引物。2.設計微衛星標記引物在微衛星重復的側翼序列使用軟件Primer Premier設計特異性的引物，設計的參數為(1)弓丨物GC含量為40-60%，且正反向引物相差不超過10%;(2)退火溫度大于45°C， 且正反向引物相差不超過5°C ； (3)正反向引物不能發生錯配，且3'端避免互補重疊；(4) 引物3'端不選擇A，且不選擇超過3個G或者C; (5)弓丨物長度為18-27bp;(6)預期的PCR 產物長度為100-300bp。3.優化引物不同的引物根據軟件Primer Premier對其建議的Tm值進行優化，優化的退火溫度范圍為Tm-5°C至Tm+10°C。PCR擴增在PTC-200PCR儀上完成，其反應程序為94°C預變性 5分鐘后進入循環，94°C變性30-60秒，根據不同的退火溫度退火30-90秒，72°C延伸30-90 秒，30-35個循環，72°C終延伸10分鐘。PCR擴增反應體系為總體積20 μ 1，其中包括正反向引物各 0. 1μΜ、0. 2mM dNTPs、IXPCR buffer (不含 Mg2+)、1. 5mM Mg2+、IU Taq 酶和 50ng 模板。模板是從海南喜鹽草海草床中隨機挑出的2個樣本。擴增產物在1.5%的瓊脂糖水平電泳系統上進行檢測，選取無或雜帶少、條帶清晰的PCR對應的溫度為最佳退火溫度。4.確定微衛星位點根據以上選定的退火溫度，利用海南和廣西喜鹽草海草床隨機挑選出的23個樣本進行PCR擴增，PCR反應條件同上。PCR產物利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，IlOV 穩壓電泳10-14小時，電泳結束后用20% AgN03、Na0H和Na2B4O7 · IOH2O進行染色，然后在凝膠成像系統上觀察、記錄結果，分析確定多態性。篩選出等溫等位基因超過2個的位點，標記不同顏色的 熒光(5' HEX,5' TAMRX、5' ΤΕΤ,5' ROX或5' 6-FAM)。將喜鹽草DNA樣本量增加至80個，使用熒光標記的引物根據優化的PCR擴增反應條件進行擴增。擴增產物在在ABI 3130自動測序儀上進行片段分析，并應用軟件GeneMapper進行基因分型，分析獲得具有更高分辨率的數據結果。最后，確定各位點的多態性，篩選出穩定性高、重復性好、多態性高的微衛星標記。這些標記的具體信息如表一。
權利要求
1.一種海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，包括步驟1)使用改良的CTAB方法提取喜鹽草葉片組織的基因組DNA；2)應用生物素鏈霉親和素捕獲法得到含有微衛星的DNA片段，并對DNA片段進行測序， 篩選2-6個堿基重復單元、重復數超過5個的DNA序列；3)對上述步驟篩選出的重復序列兩端的側翼序列設計特異性的引物，并對不同地理分布群中的喜鹽草個體基因組DNA進行PCR擴增以檢測、優化引物；4)對PCR產物片段大小進行分析，確定每個個體的基因型，獲得喜鹽草的遺傳多態性圖譜；和5)確定重復性、穩定性和多態性高的微衛星標記。
2.根據權利要求1中所述的海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，其特征在于，所述改良的CTAB方法包括步驟1)將硅膠干燥并用75%乙醇擦拭干凈的海草喜鹽草干樣在粉碎機粉碎；2)向所述粉碎后的干樣中加入預冷的洗脫緩沖液，混勻，所述洗脫緩沖液含有0.02g/ ml的PVP禾口 2. 8 μ 1/ml的β -巰基乙醇；3)轉移至離心管中，40C，以12000轉/分的速度離心15分鐘后棄上清液，加入2XCTAB 提取緩沖液、混勻，65°C水浴0. 5-2小時，所述提取緩沖液含有2. 8 μ 1/ml的β-巰基乙醇；4)加入等體積的體積比24 1的氯仿-異戊醇、混勻，4°C，以12000轉/分的速度，離心15分鐘后，取上清液，重復數次；5)在上述步驟取得的上清液中，加入RNAaSe，37°C水浴30分鐘；6)取出水浴，加入1/3體積的5MNaCl,2/3體積的冰異丙醇(_20°C )，混勻，-20°C沉淀2小時；7)4°C，以12000轉/分的速度離心15分鐘后棄上清液，加入75%乙醇，將DNA從管底彈起，重復數次；8)4°C，以10000轉/分的速度離心15分鐘后棄上清液，將管倒扣在干凈的紙巾上；待管壁快干時將管正立，過夜；9)加入滅菌超純水，室溫下溶解DNA。
3.根據權利要求1中所述的海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，其特征在于，所述步驟2)中，使用微衛星檢索軟件SSRHunter對序列進行篩選，并應用軟件DNAstar中的 MegAlign對含有微衛星的DNA序列進行聚類，選取聚類在不同contig中的序列設計引物。
4.根據權利要求1中所述的海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，其特征在于，所述步驟3)中，使用軟件Primer Premier設計特異性的引物，設計的參數包括(1)引物GC含量為40-60%，且正反向引物相差不超過10% ； (2)退火溫度大于45°C，且正反向引物相差不超過5°C;(3)正反向引物不能發生錯配，且3'端避免互補重疊；(4)引物3'端不選擇A，且不選擇超過3個G或者C ； (5)引物長度為18-27bp ； (6)預期的PCR產物長度為 100-300bp。
5.根據權利要求1中所述的海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，其特征在于，所述步驟3)中，PCR擴增的反應體系為以總體積20 μ 1為基礎，體系中包括正反向引物各 0·1μΜ、0· 2mMdNTPs、IXPCR buffer (不含 Mg2+)、1. 5mM Mg2+、1U Taq 酶和 50ng 模板。
6.根據權利要求1中所述的海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，其特征在于，所述步驟3)中，PCR擴增的反應程序為94°C預變性5分鐘后進入循環，94°C變性30-60秒，根據不同的退火溫度退火30-90秒，72 °C延伸30-90秒，30-35個循環，72 °C終延伸10分鐘。
7.根據權利要求1中所述的海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，其特征在于，所述步驟3)中，對于PCR擴增的產物，用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測多態性，篩選出多態性超過2個等位基因的引物對，并在正向引物標記熒光5' HEX,5' TAMRX、5' ΤΕΤ,5' ROX或 5' 6-FAM ；再使用熒光標記引物進行PCR擴增，分析確定多態性。
8.根據權利要求1中所述的海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，其特征在于，所述含有重復單元的序列如 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO :10 所示。
9.根據權利要求1中所述的海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，其特征在于，所篩選出的微衛星標記的特異引物分別為H02 :F :GAGGTCTTCGTATCGTCTG, R :GCATCTTGTGGTGGTTCT ； H03 :F :CGAGGCTATGTTCCAGAT, R :CAATGCCCAAGTAGGTGA ； H05 :F :GAATGGGAAGGTGAAAGAG, R CACGGCACTGTTCATCTAC ； H08 :F :ATAACCAAAGCCTCCCAAGC, R :AAATATCAAACGCCCCTCAC ； H020 :F AGAGGAAAAGAAAAGCGAG, R :ATGTCACGTGGGACCATAT ； H030 :F CGCCGAAGGAAATGTGGAG, R :AACCCAACCGATCGACCCT ； H031 :F :GGTTGTGCGTGAGGTGAAT, R :ATACGCAGGTACGCACTCT ； H036 :F CAACTAACCAAACGAGAAAC, R :AACCTTGACACCTGCTAATA ； H048 :F :ATCGAACCCAATAGACACCAG, R CAGGCAACTTAGCAAGAAACT ； H051 :F :AGATAAGTTTCACTCCTGTG, R :ACCAGAACCAATCAAGAT。
全文摘要
本發明公開一種海草喜鹽草微衛星標記的篩選方法，首先使用改良的CTAB方法提取喜鹽草葉片組織的基因組DNA；再應用生物素鏈霉親和素捕獲法得到含有微衛星的DNA片段，且對DNA片段進行測序，篩選出堿基重復(2-6個)單元多于5個的DNA序列；然后在微衛星重復序列兩端的側翼序列設計特異性的引物，并對不同地理分布群中的喜鹽草個體基因組DNA進行PCR擴增以檢測、優化引物；最后對PCR產物片段大小進行分析，確定每個個體的基因型，獲得喜鹽草的遺傳多態性圖譜，確定重復性、穩定性和多態性高的微衛星標記。本發明可以用于喜鹽草的種質資源鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等研究，進一步用于喜鹽草海草床的管理、保護和恢復工作。
文檔編號C12Q1/68GK102286457SQ20101020400
公開日2011年12月21日 申請日期2010年6月18日 優先權日2010年6月18日
發明者劉敏, 徐娜娜, 陳小勇 申請人:華東師范大學