專利名稱：一種無篩選標記的雙表達重組mva病毒及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種無篩選標記的雙表達重組MVA病毒，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
ItMMi^Bf^^-π Π:(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS) 是由PRRS病毒引起的豬的一種傳染病。該病的主要特征是引起妊娠母豬的早產、流產、死胎、木乃伊胎及產弱仔豬，仔豬主要表現為咳嗽、呼吸困難、呼吸急促。鑒于最近幾年的高致病性豬藍耳病的廣泛快速流行，所以必須加大對其疫苗研制的力度，從根本上控制疾病的流行和發生。經典的PRRS疫苗對高致病性豬藍耳病只能起到部分保護作用，針對高致病性豬藍耳病的弱毒和滅活疫苗都已經開始應用，但也存在一定的缺點和不足，所以在研究有效的常規疫苗的同吋，也應加大對基因工程疫苗的研制，來豐富PRRSV的防治手段。GP5 (E蛋白)具有中和表位，為病毒的主要免疫保護型抗原；GP5的生物學功能非常重要，主要在病毒感染、細胞結合及病毒吸附中起作用，也是淋巴細胞增生性應答的靶點。雖然GP5在PRRSV感染的細胞內表達水平較低，但卻是病毒主要的免疫原性蛋白。在不同毒株間GP5基因是各結構蛋白中變異最大的(KaPur V，Elam MR. , Pawlovich TM, et al. , 1996. Genetic variation in procine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern Uniteg States. J Gen Virol.,77, 1271 1276; Anderyev VG, Wesley RD, Mengeling WL,et al.,1997. Genetic variation and phylogenic relationships of Porcinere Porduetive and Piratoyrdisease syndrome (PRRSV) field strains based on sequence analysis of open reading frame 5. ArehVirol. 142,993 1001; Pirzadeh B, Dea S. 1997. Monoclonal antibodies to the 0RF5 product of porcine reproductive and respiratory syndrom virus define linear neutralizing determinants. J Gen Virol. 78，1867 1873; Rowland R R, Stenffern M, Ackerman T, et al.,1999b. The evolution of procine reproductive and respiratory syndrom virus: quasispecise and emergence of a virus subpopulation during infection of pigs with VR-2332. Virology. 259(2),262^266.)，在同一基因型毒株間GP5氨基酸的同源性在88% 99%之間， 而歐美毒株間氨基酸同源性僅為52 55%(Dea S, Gagnon CA, Mardassi H, et al. , 2000a. Current knowledge on the structural proteins of procine reproductive and respiratory sydrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates. Arch. Virol. 145，659 688.)。0RF5是目前認為構建PRRS重組病毒弱毒活疫苗和DNA疫苗的最佳候選基因，這是對GP5所誘導抗體達到保護效應的表面認識，如用 0RF5全基因來構建新一代PRRSV疫苗，也許ADE現象不可避免；GP5暴露在囊膜表面的 N端鑒定了 2個抗原表位，即表位A和表位B (Rodriguez M J, Sarraseca J, Fominaya Ε, et al. Identiiication οι an immunodominant epitope m the C terminus oi glycoprotein 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J GenVirol, 2001; 82: 995-999)。研究發現PRRSV北美洲型分離株的ー個主要的中和表位位于GP5夕卜區中部37 45aa(0strowski Μ, Galeota J A, Jar A Μ, et al. Identification of neutralizing and non-neutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain. J Virol, 2002； 76: 4241 4250.),艮P B表位，并且這個表位與在同一個區域LDV的中和表位(Plagemann PGff. 2001. Complexity οι the single linear neutralization epitope oi the mouse arterivirus lactate dehydrogenaseelevating virus. Virology. 290,1 廣 20.)有著相當高的氨基酸同源性。 PRRSV的抗體依賴增強作用(ADE )與GP5蛋白有關，也許是因為GP5的表位A誘導的增強性抗體參與了這ー過程，PRRSV抗體這把所謂的“雙刃劍”可能就是GP5上的A表位和B表位各占一面，只不過兩個表位在不同時間發揮各自的作用，從而在抗體效應上表現出兩面性，即抗體的ADE與表位A有關，抗體的中和效應與表位B有關(Davey M. Smith, Matthew C. Strain, bimon D. W. rrost, et al. Lack of neutralizing antibody response to HIV-I predisposes to superinfection. Virology, 2006； 355: 1 5)。如能將表位A缺失或改造，可能會有更好的免疫效果(G. W. Plagemann, R. R. R. Rowland, K. S. Faaberg. The primary neutralization epitope οι porcine respiratory ana reproductive syndrome virus strain VR-2332 is located in the middle of the GP5 ectodomain. Arch Virol, 2002; 147: 2327 2；347。可見，對構建新一代 PRRSV 疫苗來說， A表位的存在是有害無益，所以，GP5的B表位是構建有效PRRSV疫苗的表位之一(Sol Μ. Cancel-Tirado, Richard B. t,vans, Kyoung-j m Yoon. Monoclonal antibody analysis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus epitopes associated with antibody-dependent enhancement and neutralization of virus infection. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2004; 102: 249 - 262)。歐洲型和北美型分離株在GP5分別含2和3個潛在的N-糖基化位點，己證實北美型分離株三個潛在的糖基化位點(N34、N44、N51)均被寡聚糖殘基所占，對GP5的三個糖基化位點進行突變，發現N44 對病毒的感染性是必要的，N34、N51、N34N51突變體的滴度比野毒的滴度低，在Marc_145細胞上的病變減輕，對中和抗體敏感性增強，同時突變病毒產生的中和抗體滴度明顯升高，表明去掉GP5胞外區糖基化位點增強了病毒對中和抗體的敏感性同時提高了附近中和表位 WJ^ft (Ansari I. H. ， Kwon B. J. ， Osorio F. A. ， Pattnaik A. K. Influence of N—linkea glycosyiation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies. J. Virol. 2006. 3994 4004.)。病毒糖基化的和非糖基化的GP5蛋白都可以與具有中和活性的單抗反應，這表明糖基化與中和表位無必然聯系。Israrul H.等利用PRRSV反向遺傳系統構建了一系列PRRSV GP5蛋白糖基化位點發生點突變的突變株，研究結果表明，第45位N-糖基化位點的突變將導致不能產生具有感染力的子代病毒，說明 PRRSV GP5蛋白第45位的天冬酰胺的糖基化對于維持病毒的感染力是必須的；N33位和/ 或N51位N-糖基化位點的突變將導致病毒滴度的降低，但在中和試驗中對PRRSV野毒的特異性抗體表現出更高的敏感性，更令人鼓舞的是，與野毒株相比，用這些突變株免疫豬能產生針對于PRRSV野毒的更高水平的中和抗體，這表明在N33與N51位的糖基化的突變既提高了病毒在中和試驗中對抗體的敏感性，也增強了糖基化位點附近抗原表位的免疫原性(Israrul H. Ansari, Byungjoon Kwon, Fernanao A. , et al. influence οι N-Lmked Giycosylation of Porcine Reproductive and Respiratory syndrome Virus GP5 on Virus Infectivity, Antigenicity, and Ability To Induce Neutralizing Antibodies. J virol, 2006; 80: 3994 4004)。基質蛋白(Μ蛋白)由0RF6編碼，分子量大小約為18 19KD。在歐美毒株之間M基編碼的氨基酸同源性為78、1%，是歐美毒株間較為保守的蛋白(Dea S, Gagnon, CA. , Mardassi H. et al. , 1996. Antigenic variability among North American and European strains of procine reproductive and respiratory syndrom virus as defined by monoclonal antibodies to the matrix protein . J Clin. Microlo, 34, 1488 1493.)。而在北美洲型分離株之間M蛋白的氨基酸序列同源性大于96%，是所有結構蛋白基因中最保守的。M蛋白是一個非糖基化的膜蛋白。在PRRSV感染后約10天就可以從豬血清中檢測到針對M蛋白的抗體反應，表明該蛋白具有很強的免疫原性，另外還有研究表明豬只感染PRRSV后產生的T 細胞增殖反應主要是針對M蛋白的，也就是說，這個蛋白可能是引起細胞免疫反應的主要蛋白。己有報道證明無論在體內還是在體外，PRRSV的中和作用都直接與抗GP5蛋白的抗體哲夫(uonin P. , Pirzaden B. , Lragnon し· A.，Dea S. Seroneutralization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus correlates with antibody response to the GP5 major envelope glycoprotein. J Vet Diagn Invest. 1999, 11: 20 26)。而且GP5對T淋巴細胞增殖反應的刺激作用也僅次于M蛋白，表明GP5在誘導PRRSV特異性細胞免疫中也具有重要作用(Bautista Ε. M.，Molitor T. W. IFN gamma inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication m macrophages. Arch Virol. 1999，144 (6):1191 200.)。由于近年來高致病性藍耳病在近年的廣泛快速流行，所以必須加大對其疫苗研制的力度，從根本上控制疾病的流行和發生。傳統的滅活苗對變異株的高致病性毒株沒有起到保護效果，針對高致病性豬藍耳病的弱毒和滅活疫苗在應用中均存在一定的缺點常規活疫苗(滅活苗和弱毒苗)的有效性在控制疾病流行時的作用是公認的，并且在控制急性疾病的傳播上有一定的作用，但從長遠的控制和根除疾病，兩者都存在一定的缺點和不足， 如毒カ反強、散毒、動物免疫的應激反應、多次免疫、免疫保護期短等。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足之處，提供一種新的無篩選標記的雙表達重組MVA病毒。本發明的無篩選標記的雙表達重組MVA病毒，以MVA病毒為載體，載體上包括兩個単獨表達的抗原基因GP5基因和M基因，其中GP5基因的N33、N34、N51位上的氨基酸N突變為氨基酸A，其中GP5基因的核苷酸序列如SEQ ID N0. 1，M基因的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2。本發明的無篩選標記的雙表達重組MVA病毒的構建方法，包括下列步驟
1)在pllIdHR載體的自有啟動子的下游的引入MVA病毒特異啟動子VP7.5，啟動子 VP7. 5的核苷酸序列為SEQ ID N0. 3，構建雙表達轉移載體pIII_VP7. 5 ；
2)獲得正常型的GP5基因和M基因，其中GP5基因的核苷酸序列如SEQID N0. 4 ；3)點突變步驟2)中獲得的GP5基因的33、34位氨基酸和51位氨基酸，將氨基酸N突變為氨基酸A ；
4)使用步驟1)中獲得的雙表達轉移載體PIII-VP7.5與步驟3)中獲得的點突變GP5 基因及步驟2)中獲得的M基因，構建含有突變型GP5基因和正常型M基因的雙表達重組病毒載體；
5)雙表達重組病毒載體的鑒定、大量制備、篩選和純化，得到含有兩個單獨表達的抗原基因GP5 (核苷酸序列為SEQ ID NO. 3)和M基因(核苷酸序列為SEQ ID NO. 2)的重組MVA 病毒載體。本發明所使用的病毒載體是基于改良的安卡拉牛痘病毒(vaccinia virus Ankara，MVA)，該病毒是ー種高度減毒(attenuated)的牛痘病毒株，已證實該病毒在經過長期的CEF傳代后有較好的減毒作用，具有對人和動物毒副作用小的特點。該病毒MVA在人體和大多數哺乳類細胞中不能有效増殖，但研究發現，MVA的病毒DNA在人體細胞中可以正常復制，同吋，也能夠合成早期和晩期的病毒蛋白。用攜帯報告基因的重組病毒感染細胞表明，在同一啟動子的作用下，MVA產生的β-半乳糖苷酶與復制型痘苗病毒Western Reserve^(WR) W/^fi^SCA. L. Phelps, A. J. Gates, Μ. Hillier. Comparative efncacy of modined vaccinia Ankara (MVA) as a potential replacement smallpox vaccine. Vaccine, January 2007; 25: 34 42)。動物實驗(雞、兔和小鼠)顯示，MVA 對新生動物不產生任何副作用，甚至對于免疫缺陷的動物同樣沒有副作用。Leonard yuen等在研究利用痘病毒表達外源基因時曾在外源基因的末端引入了 ー個雙向終止序列5 iATTTT TATAAAAAT，3，這對提高表達水平有利(Leonard Yuen, Bernard Moss. Oligonucleotide sequence signaling transcriptional termination oi vaccinia virus early genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987； 84: 6417 6421)。 所以本發明在外源基因的末端引入這個雙向終止序列，來加強外源基因的表達水平。本發明是通過重組MVA來完成的，所述轉移載體通過和MVA病毒的同源重組來表達外源的抗原(通過改造可表達ー個或多個抗原或相應優勢表位)。本發明的雙表達載體， 無篩選標記基因存在，提高疫苗的安全性，適用于在單基因表達效果有限的疫病的預防和治療，克服常規苗和單基因表達的基因工程疫苗的缺點，更加有利于重組病毒向安全、有效地新型疫苗發展。本發明具有編碼表達優化的GP5和M抗原基因的重組MVA病毒非常適用于制備新型的PRRS疫苗。
圖1為PCR擴增痘病毒的特異啟動子VP7. 5基因的電泳圖；M為DL2000，VP7. 5 為PCR擴增得到的目的片段；
圖2為不同Tm值擴增的PRRSV的GP5和M基因的電泳圖；1為GP5基因的水對照；2 為Tm59°C擴增GP5基因；3為Tm60. 1°C擴增GP5基因；4為Tm57. 8°C擴增GP5基因；5為 Tm58. 7°C擴增GP5基因；6為M基因的水對照；M為DL2000 ；
圖3為GP5基因點突變后的電泳鑒定；1、2為N33、N34位氨基酸突變后鑒定，3、4為 N33、N34、N51位氨基酸突變后鑒定；圖4為構建好的ρΙΙΙ-ΝδΙ的PmeI,AscI雙酶切鑒定圖；Ml為DL15000,M2為DL2000, 1，2為質粒pIII-N51酶切結果；
圖5為轉移載體pIII-N51-VP7. 5-M的S ac I、X hoi I雙酶切鑒定；M為DL2000，1， 2為pIII-N51-VP7. 5-M酶切后電泳；
圖6-1、6-2為第一輪蝕斑純化后重組病毒rMVA-GP5-M的高免豬血清鑒定結果； 圖6-3為第一輪蝕斑純化后重組病毒MVA野毒的高免豬血清鑒定結果圖7-1為純化好的重組病毒rMVA-GP5-M的M單抗的鑒定圖； 圖7-2為純化好的重組病毒rMVA-GP5-M的GP5單抗的鑒定圖； 圖7-3為純化好的野毒MVA的GP5+M單抗鑒定圖8為Wfestern blot鑒定重組病毒rMVA_GP5_M的外源基因表達圖；1為Marker橙色為40kDa，下邊依次為30J4和16 kDa，2為PRRSV的GP5和M單抗鑒定；3為MVA野毒；4 為重組病毒rMVA-GP5-M的GP5和M單抗鑒定；
圖9是本發明的雙表達重組MVA病毒的構建流程圖。
具體實施例方式以下敘述本發明的具體實施例，應該說明的是本實施例只對本發明有說明作用， 而沒有限制作用。在實施例中詳細描述了抗原基因的獲得和轉移載體的構建，但并不意味著抗原基因的克隆構建僅限于實施例中的敘述，任何以其它基因工程方法克隆相應基因權利要求書中所述抗原基因都應包括在本發明所要要求的權利范圍之內。實施例1 構建雙表達的重組MVA病毒
一)構建含有兩個啟動子的雙表達載體pIIIdHR-VP7. 5
以pIIIdHR質粒為基礎，在pIIIdHR載體的自有啟動子的下游的MCS下游引入的痘苗病毒特異啟動子VP7. 5，構建成雙表達轉移載體。在其多克隆區的酶切位點中選擇BssHII酶切位點，利用同尾酶BssHII和MluI設計引物插入VP7. 5啟動子序列，上游BssH II啟動子序列16個堿基；下游Mlu I + Nhe 1+ Sac 1+ Stu 1+ Xho 1+互補序列23個堿基，設計引物如下
上游
TTGGCGCGCTCACTAATTCCAAACC 下游
CGACGCGTCTAGCTAGCTA CGAGCTCG MAGGCCTTCGCTCGAGCGG TTATGATCTACTTCCTTACCGTG, 通過PCR獲得VP7. 5啟動子序列，將獲得的片段連接T載體，獲得的單菌落經酶切鑒定陽性的質粒，送測序，測序結果正確的質粒，即為T-VP7. 5質粒(核苷酸序列為SEQ ID NO. 3)。在將經BssHII和MluI雙酶切后獲得VP7. 5片段，將pIIIdHR轉移載體質粒經 BamHI酶切，產物脫磷后回收處理，兩個片段在T4 Iigase等作用下發生連接反應，酶切和 PCR鑒定獲得的陽性菌落，即為含有可以雙表達外源基因的無篩選標記載體PIII-VP7. 5。 其結果如圖1所示。ニ)獲得GP5基因和M基因
比較GenBank中公布的高致病性豬藍耳病的基因序列，設計引物。序列如下， GP5上游5 ‘-3，GGGTTTAAACATGTTGGGGAAGTGC GP5下游
5 し3，TTGGCGCGCCATTTTTATAAAAATCTAGAGACGACCCCATAG
在GP5基因的上下游分別引入Riie I，Asc I酶切位點，送上海hvitrogen公司合成。同理設計M基因的引物，
M 上游5 ‘-3，CCGCTCGAGATGGGGTCGTCTCTAGAC M 下游5 ‘-3，CGAGCTCTTATTTGGCATATTTAACAAGG 上下游分別加入Xho I.Sac I酶切位點。取500uL PRRS病毒液，提取RNA。以此RNA為模板進行反轉錄，反應條件為(30 μ L 體系)RNA 7 μ L, dNTP 12 μ L, AMV 2. 5 μ L, 5 X AMV buffer 6yL，抑制劑 1.5yL，引物
1μ L，室溫作用10min，42°C作用Ih后取出，冰浴作用2 20min，以此產物為模板進行PCR。PCR 反應體系為(反應總體積 30uL) 10XPCR 緩沖液 2. 5 μ L、dNTP (2. 5mmol/L)
2μ L、上、下游引物各1 μ L、La Taq酶0. 5 μ L L、cDNA3 μ L、加水至30 μしPCR 反應條件95°C 作用 4 m in，然后 94°C 變性 30 sec, 59 °C (GP5)/60°C (M) 退火30sec，72°C延伸1 min，共30個循環；最后72°C延伸10 min。擴增的PCR產物經0. 8% 瓊脂糖凝膠電泳分析。片段大小正確后，膠回收試劑盒純化后，T載體連接，送測序，測序驗證序列正確后，即獲得了正確的GP5 (核苷酸序列為SEQ ID NO. 4)和M基因序列(核苷酸序列為 SEQ ID NO. 2)。其結果如圖2所示，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，圖中“ 1”為蛋白質分子量擴增GP5基因的空白水對照；“2、3”分別是在59. 0和60. 1°C的Tm下的GP5基因條帶。 條帶“4、5”為，57. 8和58. 7°C的Tm下的M基因條帶。“M”為DL2000的Marker。結果顯示均擴增到了與預期大小一致的基因條帶，最后確定以后擴增GP5和M基因的最佳退火溫度為60. 1和58. 70C。GP5和M基因產物送測序后結果顯示，獲得了正確的GP5和M基因序列 (附 IOUDo三)點突變GP5基因的33、34位氨基酸和51位氨基酸
將上述獲得的GP5基因，通過Taraka生物公司的ftx)beSt點突變試劑盒要求，設計引物2對，分別用于突變33、34位氨基酸和51位氨基酸，引物序列如下 突變33、34位氨基酸
上游5^-3' 85-121 CGTCAACGCCAGCAACGGCGGCAGCTCTCATATTCAG 下游3’ -5，54-83 CCACATAGCACGGCAAGATAGAACGACACGA 突變51位氨基酸
上游5’ -3，147- 176GCTGGGTGGCACAGATTGGCTGGCACAAAA 下游3’ -5， -146 GTCAACTAAATATTGAATTGCGATACACT
將測序獲得的正確GP5基因按照說明書進行點突變，首先突變33/34位氨基酸，利用試劑盒提供酶，進行 PCR，反應體系為pybest 酶 0. 25uL, IOx Pyrobest buffer 5uL, dNTP 如L，上下游引物各luL，模板基因luL，加水補至50uL。反應條件94°C3Osec 55 °C 30sec
72 °C 5min 30 個循環PCR產物電泳回收，回收后進行Blunting Kination反應 DNAIOuL
IOxBK buffer2uL
EnzymeIuL
水7uL
37°C反應 10min，70°C反應 lOmin。Ligation反應，5uL上述樣品，5uL Ligation Solution I，混合均勻，用連接酶連接16°C，lh0Ur。反應液全量轉化至IOOuL感受態細胞中。轉化后，挑取單個菌落，酶切或 PCR鑒定，有陽性片段的，回收后菌液測序，序列證實被正確突變的標記為N33N34，進行下步點突變。GP5基因的51位氨基酸，突變操作按照上述操作，僅引物更換為N51點突變專用引物。獲得陽性片段后測序，突變后經測序正確的含3個糖基化位點均突變的GP5序列命名為N51。在轉移載體的構建中將GP5基因3個氨基酸替換后的GP5基因序列命名為N51-T (僅突變2個的稱為N33N34)。結果如圖3所示，經過Riie I、Asc I雙酶切后，獲得了和GP5基因大小相符的條帶，將上述克隆送測序，結果顯示點突變正確獲得了突變3個氨基酸的GP5序列(核苷酸序列為 SEQ ID N0. 1)。四)構建含有突變型GP5基因和正常型M基因的重組病毒載體
1)將PlIIdHR質粒和T-N51均經限制性內切酶Riie I，Asc I雙酶切后，分別回收酶切產物，在T4 Iigase等作用下發生連接反應，獲得陽性重組質粒命名為轉移載體 pIIIdHR-N51。結果如圖4 所示，其中 Ml 為 DL15000 Marker, M2 為 DL2000 Marker, 1，2 ρIII-N51質粒酶切后電泳，小片段即為點突變后的GP5基因。證實GP5及N51基因插入。2)將測序正確的M基因片段和經Xho I、Sac I雙酶切后回收的pIIIdHR-N51 載體片段，在T4 Iigase作用下發生連接反應，酶切和PCR鑒定獲得的陽性菌落，命名為 pIIIdHR-N51-VP7. 5-M。結果如圖5所示，經過雙酶切，在兩株載體上均酶切出了 M7bp的條帶，與M基因大小一致，證明M基因插入，因為在載體上沒有S ac I ,X hoi I的酶切位點，可以切出目的片段，證明酶切位點已經引入，即VP7. 5基因也被正確插入。故完成轉移載體的構建。五)重組病毒載體的鑒定、大量制備、篩選和純化
構建完成轉移載體質粒用于將來后續的重組病毒篩選，將鑒定好的轉移載體，利用分子克隆3中質粒的大量提取和純化方式進行提取，得到純度和濃度合適的質粒進行轉染。轉染操作按照脂質體轉染試劑盒進行。將BHK-21細胞鋪6孔板，鋪板后12_16小時，將0. 01M0I的MVA野毒感染BHK-21細胞，感做1小吋，后棄去上清，按照脂質體轉染試劑盒說明操作，轉染后6-8小時換液，轉染后48 72小時收獲還有細胞病變的轉染毒。將轉染毒梯度稀釋，接入到長滿單層的RK-13細胞上，設細胞對照孔，接毒后每天觀察病變，將帶有明顯特異性病變的孔收毒，反復凍融后收獲病毒，在以此為種毒接入 RK-13細胞，進行蝕斑純化3-6輪，直至得到純化的蝕斑毒。將得到的純化的蝕斑毒再回復至BHK-21細胞上，采用終點稀釋法獲得純化的重組MVA病毒，并進行IFA，WB和PCR鑒定。證明獲得陽性重組病毒，此病毒將是新型HP-PRRSV 的疫苗候選。其結果如下
如圖6-1、6-2、6-3所示，在高免豬血清的作用下，有陽性的結果，且成病變聚團狀，說明有陽性的重組蝕斑存在，可以繼續純化。如圖7-1、7-2、7_3所示，純化好的蝕斑經GP5和M單抗鑒定后均有蛋白表達，且表達的比例較高，基本達到純化目標。圖8為Wfestern blot鑒定重組病毒rMVA_GP5_M的外源基因表達圖，結果顯示，和 PRRSV 一祥，在重組病毒rMVA-GP5-M中，GP5和M基因均得到較好的表達。
權利要求
1.一種無篩選標記的雙表達重組MVA病毒，其特征在干，以MVA病毒為載體，載體上包括兩個單獨表達的抗原基因GP5基因和M基因，其中GP5基因的N33、N34、N51位上的氨基酸N突變為氨基酸A，其中GP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1，M基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2。
2.一種無篩選標記的雙表達重組MVA病毒的構建方法，其特征在干，包括下列步驟1)在PlIIdHR載體的自有啟動子的下游的引入MVA病毒特異啟動子VP7.5，啟動子 VP7. 5的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3，構建雙表達轉移載體pIII_VP7. 5 ；2)獲得正常型的GP5基因和M基因，其中GP5基因的核苷酸序列如SEQID NO. 4 ；3)點突變步驟2)中獲得的GP5基因的33、34位氨基酸和51位氨基酸，將氨基酸N突變為氨基酸A ；4)使用步驟1)中獲得的雙表達轉移載體PIII-VP7.5與步驟3)中獲得的點突變GP5 基因及步驟2)中獲得的M基因，構建含有突變型GP5基因和正常型M基因的雙表達重組病毒載體；5)雙表達重組病毒載體的鑒定、大量制備、篩選和純化，得到雙表達重組MVA病毒載體。
全文摘要
本發明提供了一種無篩選標記的雙表達重組MVA病毒及其構建方法，本發明的雙表達重組MVA病毒以MVA病毒為載體，載體上包括兩個單獨表達的抗原基因GP5基因(核苷酸序列為SEQIDNO.1)和M基因(核苷酸序列為SEQIDNO.2)，其中GP5基因的N33、N34、N51位上的氨基酸N突變為氨基酸A。本發明的重組MVA病毒，無篩選標記基因存在，提高疫苗的安全性，適用于在單基因表達效果有限的疫病的預防和治療，克服常規苗和單基因表達的基因工程疫苗的缺點，更加有利于重組病毒向安全、有效地新型疫苗發展。本發明具有編碼表達優化的GP5和M抗原基因的重組MVA病毒非常適用于制備新型的PRRS疫苗。
文檔編號C12N7/01GK102559611SQ20111040484
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年6月23日
發明者侯紅巖, 侯繼波, 鄭其升, 陳瑾 申請人:江蘇省農業科學院