專利名稱：：一種大腸桿菌胞內表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種大腸桿菌胞內表達的表達載體，屬于基因工程領域。本發明還涉及該新型表達載體在色氨酸生產中的應用，屬于發酵工程領域。
背景技術：
：近年來，隨著氨基酸等重要代謝產物的市場需求迅猛增長，促進這些重要代謝產物積累的胞內表達載體受到了越來越多的重視，并成功地表達了多種重要代謝產物的關鍵酶基因。大腸桿菌胞內表達的原理是將目標終端產物代謝途徑中的一個或幾個關鍵酶基因，插入至胞內表達載體的啟動子序列之后，由于表達產物是終端代謝產物的重要前體物，從而促進終端代謝產物的積累。此外，由于胞內表達酶在胞內已經空間折疊成具有天然構象的活性蛋白，因此無需考慮酶的跨膜運輸過程，表達穩定高效。為了促進代謝終端產物的積累，就需要選擇合適的胞內表達載體，表達終端產物的一個或幾個關鍵前體物基因。雖然已經有了許多胞內表達載體可供選擇，但是這些載體大多或多或少地具有如下特點(1)多拷貝數，強啟動子；這就造成外源基因表達量過高，在胞內形成大量包涵體，從而抑制了細胞本身的活力。同時相應關鍵酶的過量表達使得終端產物的合成代謝通道在關鍵酶所在位置形成擁堵，影響菌株本身活力的同時，終端產物的積累也受到了影響。(2)IPTG誘導；在工業化應用中一方面由于IPTG本身價格昂貴，使得終端產物生產成本大幅增加；另一方面，IPTG在后續的產品提取中很難完全去除，因此很難在食品和醫藥類產品的生產過程中使用，這就大大限制了載體的應用范圍。(3)單啟動子表達；菌體內某一重要代謝產物的積累，往往是其合成途徑中多個關鍵基因共同表達的結果，而單個啟動子在表達多個基因時，基因的表達量會受到影響。Zhou,H.Y.,etal.公布了一禾中載體(Enhanced1-phenylalaninebiosynthesisbyco-expressionofpheA(fbr)andaroF(wt).BioresourTechnol.2010,101(11)4151-6.)，其攜帶有野生型aroF基因(aroFwt)和pheAFbr，用于生產L-苯丙氨酸，3L發酵后，攜帶有此載體的菌株L-苯丙氨酸產量僅提高2.81倍，表達效率還是有待提高。本發明構建了一種通用性好的新型胞內表達載體，引入修飾的外源基因抗色氨酸反饋調控的trp操縱子基因(trpEFtoDCBA)，應用于色氨酸生產，表達產量提高達50倍。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種大腸桿菌胞內表達載體，核苷酸序列如SEQIDNO1所示。所述表達載體的物理圖譜如圖1所示。所述表達載體復制子，抗性標記基因，阻遏蛋白基因及雙啟動子。所述抗性標記基因為卡那霉素抗性基因。所述復制子為pl5A。3所述兩個多克隆位點為MCSl和MCS2。所述阻遏蛋白基因為XcItS857。所述雙啟動子為λ噬菌體PL、I3R雙啟動子。本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種上述表達載體的應用。為解決上述技術問題，采用的技術方案為使用上述表達載體，構建衍生表達載體pSV03，用于色氨酸生產。所述色氨酸生產包括如下步驟將質粒PSV03轉化至大腸桿菌W3110的衍生菌Jff3686(E.coliGeneticStockCenter,YaleUniversity)。挑選卡那霉素抗性單克隆菌落，選用通用的LB培養基3537°C培養，當OD值達到3以上時，按照510%的接種量，轉接至裝液量為1.21.5L的3L發酵罐中，3033°C培養至對數生長前期，升溫至3739度開始誘導產色氨酸；發酵一般是2448h，更佳地為3036h，pH值控制在6.87.2。所述表達載體pSV03的物理圖譜如附圖2所示。所述表達載體pSV03含有修飾的外源基因aroF、抗色氨酸反饋調控的trp操縱子基因(trpEFtoDCBA)。所述修飾的基因aroF通過定點突變技術，缺失突變了由aroF編碼的DAHP合成酶氨基酸序列中的第十一個氨基酸Lie，從而獲得了抗色氨酸反饋調節的aroFFto基因。可用于本發明的宿主細胞宜為原核細胞，最佳的為大腸桿菌。對于用于代謝工程的胞內表達載體而言，通常啟動子序列、復制子序列等元件的選擇至關重要。本發明的發明人經過多年研究，選擇了λ噬菌體的溫控型PL、ra雙啟動子和拷貝數為15的P15A復制子。在此基礎上，構建了本大腸桿菌胞內表達載體pSV-Τ。以λ噬菌體轉錄啟動子PL、ra構建的載體已經為大家所熟悉。這兩個強啟動子受控于λ噬菌體Cl基因產物。Cl基因的溫度敏感突變體AcItS857，常常被用于調控PL、ra啟動子的轉錄，30°C時阻遏啟動子轉錄，42°C時解除抑制開始轉錄。本發明提供的表達載體可以控制外源基因的表達，應用該質粒表達色氨酸合成代謝中的關鍵酶基因aroFFto和trp操縱子trpEFtoDCBA生產色氨酸，發酵液中色氨酸的濃度最高可積累至llg/L，產量提高達50倍，在工業上有幾大的應用前景。圖1表達載體pSV-T的物理圖譜圖2表達載體pSV03的物理圖譜圖3表達載體pSV03構建方法圖4表達載體pSV03的酶切鑒定1=Markeλ-EcoT14Idigest；2=MarkerDL2000；3，4=BamHI禾口bglll雙醇后的DNA片段具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本發明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊4所述的條件進行操作。實施例1溫敏型λ阻遏蛋白基因λcItS857核酸序列，λ噬菌體PL啟動子核酸序列、多克隆位點MCSl核酸序列的克隆提供溫敏型λ阻遏蛋白基因XcItS857，λ噬菌體I3R啟動子序列是載體pDN707(C.A.Loveetal.,1996,Stablehigh-copynumberXpromotervectorsforoverproductionofproteinsinEscherichiacoli,gene,176,49-53)。而多克隆位點MCSl核酸序列為人工合成，且在引物設計中引入多克隆位點MCS1。設計引物PCR擴增得到PDN707載體上2631至3737的核苷酸序列Al。所用的上游引物為Pl:5，-CTGCAGGTGATGATTATCAGCCAGCAG-3’(下劃線Pstl酶切位點)。下游引物為P2:5，-CAGCTGAGTACTCATATGGATATCAGATCTTTAGCTGTCTTGGTTTGCCCAAAGC-3’(下劃線為MCSl核酸序列，包含的酶切位點有PvuII、Seal、NdeI、EcoRV,BglII)PCR產物經膠回收、Pstl/PvuII雙酶切后，低融點膠回收備用。實施例2PL啟動子核酸序列和多克隆位點MCS2核酸序列的的克隆提供I3R啟動子核酸序列是載體仍然是pDN707(C.A.Loveetal.，1996，Stablehigh-copynumberλpromotervectorsforoverproductionofproteinsinEscherichiacoli，gene，176，49_53)。而多克隆位點MCS2核酸序列為人工合成，且在引物設計中引入多克隆位點MCS2。設計引物PCR擴增得到pDN707載體上3738至3984的核苷酸序列A2。所用的上游引物為P3:5，-AGATCTGATATCCATATGAGTACTCAGCTGTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTG-3’(下劃線為MCSl核酸序列)下游引物為P4:5，-GGATCCTCTAGAGTTAACGAGCTCCCATGGCAATGCTTCGTTTCGTATCAC-3’(下劃線為MCS2核酸序列，包含的酶切位點有BamHI、XbaI、HpaISacI、NcoI)PCR產物經膠回收、Bglll/Ncol雙酶切后，低融點膠回收備用。實施例3溫敏型λ阻遏蛋白基因λcItS857核酸序列和λ噬菌體I3R啟動子、多克隆位點MCS1、λ噬菌體PL啟動子、多克隆位點MCS2核酸序列的克隆以實例1和實例2所得到的PCR片段Al，Α2為模板，通過重疊PCR技術，利用引物Pl和Ρ4，PCR擴增得到含有溫敏型λ阻遏蛋白基因XcItS857核酸序列和λ噬菌體冊啟動子、多克隆位點MCS1、λ噬菌體PL啟動子、多克隆位點MCS2核酸序列的核酸片段A3PCR產物經膠回收、Pstl/BamHI雙酶切后，低融點膠回收備用。實施例4表達載體pSV-T的構建pl5A復制子核酸序列，卡那霉素抗性基因序列來自于載體pACYC17(ChangAC,CohenSN.,1978,ConstructionandcharacterizationofamplifiablemulticopyDNAcloningvehiclesderivedfromthepl5Acrypticminiplasmid,J.Bacteriol.,134(3)，1141-1156；)。用Pstl/BamHI雙酶切載體pACYC17，然后分離出3026bp的DNA片段Bi，低熔點膠回收備用；將實例3中得到的DNA片段A3與DNA片段A2混合在一起，用連接酶連接過夜，經測序驗證連接正確和核苷酸序列正確，從而構建成載體pSV-T。載體pSV-T的物理圖譜如附圖1所示，其酶切圖譜如圖4所示。5實例5表達載體pSV03.的構建克隆表達E.coli來源的抗aroFFto和色氨酸操縱子trpEFtoDCBA1.抗反饋調節作用基因aroFFto的獲得基因aroF和trpEDCBA均是E.coli色氨酸合成途徑中的關鍵酶基因，其中由aroF和trpED分別編碼的DAHP合成酶和鄰氨基苯甲酸合成酶均受到終端產物色氨酸的反饋抑制作用。因此本實例中首先涉及aroF和trpED抗反饋調節突變基因aroFFto和trpEFtoD的獲得。aroF基因由實驗室保藏的質粒pMD18_T/aroF提供，以載體pMD18_T/aroF為模板，由PCR反應得到突變后，由aroF編碼的DAHP合成酶氨基酸序列缺失了第十一個氨基酸Lie，從而獲得了抗色氨酸反饋調節的pMD18-T/ar0FFto序列。定點突變所用的上游引物為P3:5’-GCTGAATAACGTACATACCGACGAACAGG-3’下游引物為P4:5’-CCTGTTCGTCGGTATGTACGTTATTCAGC-3，。2.質粒pSV03.的構建TrpEFtoDCBA基因由實驗室保藏質粒pMD18-T/TrpEFtoDCBA提供。分別酶切質粒pMD18-T/aroFFbr和pMD18_T/TrpEFtoDCBA，將獲得的aroFFto和TrpEFtoDCBA基因序列分別克隆入質粒pSV-T的Bglll/Scal和BamHI/Ncol位點，形成質粒pSV03。實施例6發酵生產色氨酸1.工程菌的構建將表達載體pSV03電轉Ε.coli模式菌BW25113的衍生菌JW3686(E.coliGeneticStockCenter,YaleUniversity)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的平板，挑選陽性菌種，進行PCR鑒定，建立產色氨酸的基因工程菌JW3686/pSV-T3。2.種子培養將基因工程菌JW3686/pSV-T3，接入含50μg/ml卡那霉素的LB培養基中，50ml培養基放入250ml的培養瓶中，37°C，轉速為200rpm，培養時間為1012小時，培養后0D600吸光值在45之間。3.發酵罐培養發酵培養基組份濃度0·3%(ff/V)MgSO4·7H20，0.0015%(ff/V)CaCl2·H2O,0.3%(ff/V)KH2PO4,0.1%(W/V)NaCl,0.5%(ff/V),(NH4)2S04,0.0075%(ff/V)FeSO4‘7H20,0.01%(ff/V,Na-Citrate,0.4%(ff/V)Tryptone,0.2%(ff/V)YeastExtract,1.5%(ff/V)glucose。1.5ml/L微量元素液0.2%(WA)Al2(SO4)3‘18H20,0.075%(ff/V)CoSO4·7H20,0.25%(ff/V)CuSO4·5H20,0.05%(ff/V)H3BO3,2.4%(ff/V)MnSO4‘H20,0.3%(ff/V)Na2MoO4·2H20，0.25%(ff/V)NiSO4·6H20,1.5%(ff/V)ZnSO4·7H20。發酵過程補料葡萄糖500600g/L上述培養基在發酵罐中高壓滅菌，用前無菌加入卡那霉素終濃度為50μg/ml。發酵參數為發酵前期培養溫度為30°C，菌體對數生長中期時開始升溫誘導，溫度控制在38°C；pH值使用氨水控制在7.0；通氣量為每升培養基lL/min；溶解氧控制在20%以上；攪拌速率與溶氧偶聯。發酵時以5%的比例在發酵罐中加入種子培養基，發酵34h，葡萄糖基本耗盡時，開始流加葡萄糖，保持發酵培養基中葡萄糖的濃度在0.52g/L。發酵48h時，停止發酵，取菌液離心，取上清液測定色氨酸的產量，發現發酵液中最高可積累色氨酸llg/L。與不添加質粒pSV03的菌株JW3686發酵情況相比，色氨酸產量提高10倍以上。可見載體pSV-T在代謝工程中的應用具有廣泛的前景。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求一種大腸桿菌胞內表達載體，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.權利要求1所述的表達載體，其特征在于含有復制子，抗性標記基因，兩個多克隆位點，阻遏蛋白基因及雙啟動于。3.如權利要求1或2所述的載體，其特征在于所述抗性標記基因為卡那霉素抗性基因。4.如權利要求1或2所述的載體，其特征在于所述復制子為pl5A。5.如權利要求1或2所述的載體，其特征在于所述兩個多克隆位點分別為CAGCTGAGTACTCATATGGATATCAGATCT和GGATCCTCTAGAGTTAACGAGCTCCCATGG。6.如權利要求1或2所述的載體，其特征在于所述阻遏蛋白基因為XcItS857。7.如權利要求1或2所述的載體，其特征在于所述雙啟動子\噬菌體PL、ra雙啟動子。8.如權利要求1所述表達載體的應用，其特征在于構建衍生表達載體PSV03，用于色氨酸生產。9.如權利要求8所述表達載體的應用，其特征在于所述表達載體PSV03含有修飾的外源基因aroF、抗色氨酸反饋調控的trp操縱子基因(trpEFtoDCBA)；所述trpEFtoDCBA核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。10.如權利要求9所述表達載體的應用，其特征在于所述基因aroF通過定點突變技術，缺失突變了由aroF編碼的DAHP合成酶氨基酸序列中的第十一個氨基酸Lie，從而獲得了抗色氨酸反饋調節的aroFFto基因，序列如SEQIDN0:3所示。全文摘要本發明公開了一種大腸桿菌胞內表達載體及其應用，屬于基因工程領域。所述表達載體包含以下元件(1)p15A復制子，(2)卡那霉素抗性標記基因，(3)兩個多克隆位點MCS1和MCS2(4)溫敏型λ阻遏蛋白基因λcItS857，(5)λ噬菌體PL、PR雙啟動子。應用該質粒表達修飾后色氨酸合成代謝中的關鍵酶基因aroFFbr和trp操縱子trpEFbrDCBA生產色氨酸，發酵液中色氨酸的濃度最高可積累至11g/L，與野生菌相比，產量提高了50倍。載體pSV-T在色氨酸及其它重要代謝產物的基因工程菌構建中具有廣泛的應用前景。文檔編號C12R1/19GK101984063SQ20101022627公開日2011年3月9日申請日期2010年7月14日優先權日2010年7月14日發明者吳丹,吳敬,趙志軍,陳堅,陳晟申請人:江南大學