大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型bac載體及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體及其構建方法，該BAC載體含有多克隆位點MCS，Am抗性基因，整合酶基因int，整合位點attp，接合轉移片段oriT，BAC載體的復制區oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位點和loxP位點。本發明從pBeloBAC11出發，用Red同源重組技術將其上的氯霉素抗性基因替換為用于接合轉移（oriT）、定點整合（attp-int）和抗性篩選（Am）的oriT-attp-int-Am的DNA片段（稱之為替換盒），得到載體pBTIBAC1，為實現大片段基因簇在鏈霉菌中的異源表達奠定了基礎。
【專利說明】大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體及其構建方法，具體涉及一種可由大腸桿菌接合轉移至鏈霉菌并整合至其基因組的BAC載體及其構建方法，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002]鏈霉菌是微生物中產抗生素種類最多的種屬，目前世界上發現的5000多種抗生素中，60%以上是由鏈霉菌合成的，作為抗生素的生產菌，鏈霉菌在傳統發酵工業中的應用有著悠久的歷史，而分子遺傳學的發展則為鏈霉菌的基因重組展現了廣闊的應用前景，自1980年首次報導鏈霉菌基因克隆以來，鏈霉菌基因工程日益興起。
[0003]載體作為基因工程的重要工具是鏈霉菌基因工程首先遇到的問題。起初科學家們根據對一部分鏈霉菌遺傳背景已有的認識，構建了一系列鏈霉菌質粒和噬菌體克隆載體系統，后來為了研究鏈霉菌基因功能和構建其基因文庫，須將鏈霉菌基因轉入大腸桿菌中進行一些遺傳操作，然后再轉移到某些模式鏈霉菌中作進一步研究，于是各個實驗室紛紛開始構建大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體，文獻記載最早的是1982年Richardson MA等構建的大腸桿菌-鏈霉菌雙功能載體PFJ123，然后就是1989年Hill RT等構建的大腸桿菌-鏈霉菌正篩選穿梭載體PLR591，國內有關這方面較早的研究是譚華榮等1990年構建的鏈霉菌和大腸桿菌穿梭質粒載體 pSE-3。
[0004]與此同時鏈霉菌基因轉移系統也開始建立，文獻記載較早的是原生質體轉化法，包括PEG介導和脂質體協助，但在實際應用中常常遇到不少障礙，主要由于鏈霉菌特殊的結構特點，要么其原生質體難以制備，要么其難以被外源質粒所轉化，還有電擊轉化法，效率也很低，自Trien-Cuot等人首次闡明大腸桿菌與許多革蘭氏陽性細菌之間可進行質粒的接合轉移的現象，兩年后Mazodier發展了質粒在大腸桿菌和鏈霉菌之間進行接合轉移的方法，即在大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體上引入接合轉移順式作用元件oriT，將其轉化到攜帶RP4質粒的大腸桿菌中，載著目的基因的載體就在RP4上的反式作用元件tra的誘導下由大腸桿菌接合轉移到鏈霉菌中去。這種方法不但易于操作，而且可避開鏈霉菌的甲基化限制作用，提高外源基因的存活率。
[0005]已有報導，重組質粒在鏈霉菌中顯示結構的不穩定性，人們就嘗試構建一種可整合至鏈霉菌基因組的載體，其中主要包括由Streptomyces ambofaciens質粒pSAM2衍生和鏈霉菌噬菌體cpC31衍生的載體，而cpC31衍生載體因有較高的轉化效率而頗受偏愛，如PSET152就是由目前研究較熱的鏈霉菌噬菌體OC31的整合系統衍生而來的，即在載體上引入attP序列(phage attachment site)和整合酶基因(int),整合酶可介導attP與鏈霉菌基因組內的attB (bacterial attachment site)間位點特異性重組,從而將整個載體包括外源基因整合進鏈霉菌基因組中，使外源基因在沒有選擇壓力的情況下在鏈霉菌中穩定存在，這可作為其用于大規模生產的一個極大的優勢。
[0006]鏈霉菌基因組測序完成后人們發現，在鏈霉菌基因組中與某一天然產物生物合成途徑相關的基因往往成簇存在，因此都比較大(>60kb)，要想完整地克隆這些基因簇就必須要有能裝載大片段的載體。目前應用較廣的大片段克隆載體有酵母人工染色體(YAC)和細菌人工染色體(BAC)，BAC的插入片段不如YAC長，但其有很多優點可彌補YAC的不足，這就使得其應用和發展遠遠超過了 YAC。
【發明內容】
[0007]本發明的主要目的是提供一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體，本發明成功構建了一種可由大腸桿菌接合轉移至鏈霉菌，并整合至其基因組的穿梭型BAC載體pBTIBACll，以實現大片段基因簇在大腸桿菌中完成遺傳操作后轉移至鏈霉菌中異源表達。
[0008]本發明由大腸桿菌接合轉移至鏈霉菌的BAC載體，其含有多克隆位點MCS，安普抗性基因Am，整合酶基因int，整合位點attp，接合轉移位點oriT，BAC載體的復制區oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位點和1xP位點。
[0009]多克隆位點(MCS )，序列如SEQ N0.1 ；
[0010]安普抗性基因(Am)，序列如SEQ N0.2 ；
[0011]整合酶基因(int)，序列如SEQ N0.3 ;
[0012]整合位點(attp)，序列如SEQ N0.4 ；
[0013]接合轉移片段(oriT)，序列如SEQ N0.5 ；
[0014]BAC載體復制區(oriS)，序列如SEQ N0.6 ；
[0015]BAC載體的repA基因，序列如SEQ N0.7 ；
[0016]BAC載體的sopA基因，序列如SEQ N08 ；
[0017]BAC載體的sopB基因，序列如SEQ N09 ；
[0018]BAC載體的sopC片段,序列如SEQ N010 ；
[0019]BAC載體的cos位點，序列如SEQ NOll ；
[0020]BAC載體的1xP位點，序列如SEQ N012。
[0021]所述的BAC載體pBTIBACll，其具有SEQ N0.13所示的序列。
[0022]本發明的另一個目的是提供本發明上述BAC載體的構建方法。本發明從原始載體pBeloBACll出發，將其上的氯霉素抗性基因替換為用于接合轉移(oriT)、定點整合(attp-1nt)和抗性篩選(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段(稱之為替換盒),為了精確替換，本發明采用了 Red同源重組的方法，即將一段兩端與染色體(或載體)特定靶序列兩翼各有40~60bp同源序列的PCR線性DNA片段導入宿主菌細胞，利用λ噬菌體Red重組酶使該線性片段與靶序列發生同源重組，線性DNA片段即可替換靶序列，得到的替換子命名為pBTIBACl。其中Red重組酶由輔助質粒pKD46攜帶，其表達受L-阿拉伯糖誘導，且具有溫度敏感型的復制子，在溫度高于37°C時，自動從宿主菌中清除。
[0023]為了驗證pBTIBACl是否具有接合和整合的功能，在其原多克隆位點反向插入鏈霉菌的組成型啟動子ermEPA和綠色熒光蛋白基因(GFP )，得到重組質粒pBTIBACl-ermEPiP^GFP,將該重組質粒轉化ET12567 (pUZ8002)(接合轉移供體菌)，再通過接合轉移轉至變鉛青鏈霉菌中，通過EnSpire多標記微孔板檢測儀(酶標儀)和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，結果都顯示了綠色熒光蛋白的表達，說明載體pBTIBACl具有預期的功能，為實現大片段基因簇在鏈霉菌中的異源表達奠定了基礎。
[0024]為便于以后使用，合成新的多克隆位點MCS，其上包含EcoR 1、Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa I ,BamH I酶切位點，通過EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相應位點(插入原載體MCS的EcoR I和BamH I之間)，得到最終載體pBTIBACll (見圖1)。
[0025]其具體構建方法，包括如下步驟:
[0026](I)首先設計一對引物，5’端帶有待替換氯霉素抗性基因上下游各55bp的同源臂，通過PCR擴增出含接合轉移(oriT)、定點整合(attp-1nt)和抗性篩選(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段,稱之為替換盒；
[0027](2)將Red同源重組輔助質粒pKD46電轉至含待替換質粒pBeloBACll的大腸桿菌k-12 內，得至Ij E.coli k_12/pBeloBACll/pKD46 ；
[0028](3)30°C培養Ε.coli k_12/pBeloBACll/pKD46 過夜，次日按 1:100 轉接，加入終濃度為0.2%的L-阿拉伯糖，30°C培養至0D_=0.4~0.6，制成電轉感受態，將上述替換盒電轉至其中，通過安普抗性篩選得到氯霉素抗性基因被替換了的替換子，命名為pBTIBACl ；
[0029](4)體外合成鏈霉菌組成型啟動子ermEP^，并與綠色熒光蛋白基因(GFP)正確連接，由EcoR I和BamH I酶切連入pBTIBACl，得到重組質粒pBTIBACl_eGFP，將該重組質粒轉化ET12567/pUZ8002 (接合轉移供體菌)，再通過接合轉移轉至變鉛青鏈霉菌中，EnSpire多標記微孔板檢測儀(酶標儀)和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察都檢測到綠色熒光蛋白的表達；
[0030](5)合成新的多克隆位點 MCS,其上包含 EcoR I > Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa 1、BamH I酶切位點，通過EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相應位點，得到最終載體pBTIBAClI ο
[0031]本發明的BAC載體，具有以下特點:
[0032]1.載體上的oriT片段，方便其由大腸桿菌接合轉移至鏈霉菌中，克服了鏈霉菌難于轉化和鏈霉菌嚴格限制系統的問題；
[0033]2.attP-1nt元件，可使插入的外源基因(簇)連同載體一起整合至鏈霉菌基因組中，提聞了外源基因(族)的穩定性；
[0034]3.安普霉素抗性基因可用于載體轉化大腸桿菌和鏈霉菌的特異性篩選標記；
[0035]4.保留了 BAC載體克隆大片段的特點；
[0036]5.保留了 LacZ，可使用藍白斑篩選重組克隆；
[0037]6.已用綠色熒光蛋白驗證其接合和整合功能；
[0038]7.重新合成了多克隆位點，方便外源片段的酶切連入。
[0039]本發明從pBeloBACll出發，用Red同源重組技術將其上的氯霉素抗性基因替換為用于接合轉移(oriT)、定點整合(attp-1nt)和抗性篩選(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段(稱之為替換盒)，得到載體pBTIBACl，用綠色熒光蛋白驗證其功能后，又重新合成MCS插入原載體MCS的EcoR I和BamH I之間，得到載體pBTIBACll，為實現大片段的基因簇在大腸桿菌中完成遺傳操作后轉移至鏈霉菌中異源表達奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1是pBTIBACll結構示意圖。
[0041] 圖2是pBTIBACll構建的示意圖。
[0042]圖3是替換盒連pMD18T vector菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0043]圖4是陽性克隆質粒BsaI酶切瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0044]圖5是替換子菌液PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0045]圖6是變鉛青鏈霉菌TK24轉化子的EnSpire多標記微孔板檢測儀(酶標儀)結果處理圖表。
[0046]圖7是變鉛青鏈霉菌1326轉化子的EnSpire多標記微孔板檢測儀(酶標儀)結果處理圖表。
[0047]圖8是變鉛青鏈霉菌TK2412#轉化子表達綠色熒光蛋白照片(1000倍鏡)，con:陰性對照；12:TK2412#轉化子。
[0048]圖9是變鉛青鏈霉菌132617s轉化子表達綠色熒光蛋白照片(1000倍鏡)，con:陰性對照；17:132617s轉化子。
【具體實施方式】
[0049]在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
[0050]下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了列舉說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
[0051]在實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所使用試劑的來源、商品名以及必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑無特殊說明，均與首次標明的內容相同。
[0052]實施例中所用到的質粒和菌株如下:
[0053]pMD18T vector為商品化載體，用于PCR膠回收產物的克隆和測序，購于TaKaRa公司。
[0054]pBeloBACll (U-JIN KIM et al.(1996).“Construct1n and Characterizat1nof a Human Bacterial Artificial Chromosome Library，，GEN0MICS34, 213 - 218),本實施例中所使用的pBeloBACll (保存在E.coli k-12內)購自NEB公司。
[0055]pESPBAC (Huang Huiying,Song Jie,Shang Guangdong (2010).“Construct1nof an E.col1-Streptomyces-Pseudomonas Shuttle Express1n BAC Vector，，.JOURNALOF NANJING NORMAL UNIVERSITY (Natural Science Edit1n).33 (2): 104-108)，用于替換盒擴增模板，為南京師范大學尚廣東老師饋贈。
[0056]pKD46 (Kiri 11 A.Datsenko and Barry L.Wanner (2000 ).u One-stepinactivat1n of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products，，.PNAS.97(12):6640-6645)，為Red同源重組輔助質粒，由本實驗室保存。
[0057]pET28a-EGFP為擴增GFP基因的模板，由本實驗室保存。
[0058]E.coli DH5 α感受態用于DNA片段克隆，購于北京康為生物科技有限公司。
[0059]Ε.coli ET12567 (pUZ8002) (Paget,M.S.B., L.Chamberlin, A.Atrih, S.J.Foster,and M.J.Buttner.1999.Evidence that the extracytoplasmic funct1n sigma factorsE is required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3(2).J.Bacter1l.181:204 - 211.)為接合轉移供體菌，由上海交通大學陶美鳳博士饋贈。
[0060]變鉛青鏈霉菌TK24和1326為接合轉移受體菌，由上海交通大學陶美鳳博士饋贈。
[0061]ermEPlP2為鏈霉菌組成型啟動子，序列由GenBank(登錄號為AB093584)獲得，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成部合成。
[0062]本發明的由大腸桿菌接合轉移至鏈霉菌的BAC載體pBTIBACll的構建，請參見圖2。
[0063]一、載體平BTIBAC1的構建(參見圖1)
[0064]1、以pESPBAC為模板，PCR擴增替換盒
[0065]引物為:
[0066]P1
[0067]5jGGTCTC| TTATTCAGGCGTAGCAACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGC CTTAAAAAAAGT
CAGCCAATCGACTGGCGAGCG3，，
[0068]P2
[0069]SlGGTCTCl ACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAG GAAGCTAAAACCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGG3，。
[0070]其中加邊框的為BsaI酶切位點(酶切后為5’突出端，且沒有酶切位點堿基殘留)，加下劃線的堿基序列為待替換氯霉素抗性基上下游同源臂，擴增片段大小為3365bp。
[0071]PCR 體系(50 μ L):10 X KOD Buffer (K0D 緩沖液)5μ L,2mM dNTPs (三磷酸脫氧核苷酸)5 μ L，25mM MgSO4 (硫酸鎂)2 μ L，1mM引物各1.5 μ L，模板I μ L，ddH20 (雙蒸水)33 μ L, KOD plus DNA 聚合酶 I μ L。PCR 反應條件 94°C 2min, (94°C 15s，68°C 4min) 30cycles,68 °C 7min。
[0072]2、替換盒PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳并回收，末端加A，連pMD18T載體，轉化DH5a
[0073]膠回收用AXYGEN膠回收試劑盒，操作按其說明書；末端加A反應如下:PCR膠回收產物30 μ L，10mMdATP (三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)0.2 μ L，1XDyNAzyme buffer(DyNAzyme 緩沖液)5 μ L，ddH2013.8 μ L，DyNAzyme II DNA 聚合酶 I μ L，72°C 20min ；TA 克隆反應如下:末端加 A 后溶液 6.5 μ L，pMD18T vector (pMD18T 載體)1 μ L, Slout1nI7.5 μ L,16°C 30min。取5 μ L連接產物轉化50 μ LDH5 a化學感受態細胞。
[0074]3、轉化子菌液PCR鑒定，陽性克隆提質粒酶切鑒定
[0075]菌液PCR如下:弓丨物P15，~GGTCICITATOGG03TAG(M-3，，P25，~GGICIU\CrA003GG03TATnT-3，，PCR體系(20 μ L):10XIA Buffer II OA緩沖澈5μ L，1(MVMR).8μ L，模板 I μ L，引物各 0.8μ L，dcH014 4μ L，TaKafe IA Taq DNA 聚合酶 0.2μ L。PCR 射牛:94°C 3tain, (94°C 30s,55°C 30s,72°C 4^^30^,72^ lQnin。
[0076]圖3是替換盒連pMD18T載體菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳結果，M:Trans5K Marker ；+:替換盒擴增PCR膠回收產物；1~10:克隆菌液；陽性片段大小為3373bp。確定3#和7#為陽性克隆，提其質粒，用BsaI酶切，反應體系如下:10XNEBuffer4 (NEB緩沖液4)2 μ L，100XBSA0.2μ L，質粒 10 μ L, ddH207.3 μ L, Bsa10.5 μ L, 37°C 3h，然后跑瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖4，7#為陽性質粒，命名為pMD18T-r印box。
[0077]4、pMD18T-替換盒質粒測序
[0078]測序引物如下:
[0079]M13F GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG
[0080]M13R GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
[0081]WlF GGGCCTCGATCAGTCCAAGTG
[0082]W2F TTCCGCAACGAACTTGTCGAG
[0083]與理論序列用DNAssist2.2軟件作序列比對，結果正確。
[0084]5、替換盒從pMD18T_repbox上切下,用DpnI消化
[0085]用BsaI 酶切 pMD18T_repbox 質粒，反應體系如下:10XNEBuffer420 μ L,100XBSA02 μ L，質粒100 μ L，ddH2073 μ L，BsaI5 μ L，37°C過夜，然后跑瓊脂糖凝膠電泳，并用AXYGEN膠回收試劑盒回收，回收產物用DpnI酶切，反應體系如下:膠回收產物80 μ L，10XNEBuffer420y L，ddH2070 y L，DpnI5y L，37°C放置 4h，用 AXYGEN PCR清潔試劑盒回收。
[0086]6、Ε.coli k-12/pBeloBACll轉感受態的制備及pKD46的轉化(可參考《分子克隆實驗指南》)
[0087]電轉化感受態細胞的制備:
[0088]⑴接菌，搖過夜；
[0089]⑵按1:100 轉接，搖 2 ~2.5h, 0D600 約為 0.4 ；
[0090]⑶分裝到5mL預冷離心管，4°C 100g離心5min,倒去上清；
[0091]⑷用4mL預冷的無菌水重懸(注:操作要輕柔，不要吹打，上下翻轉即可)；
[0092](5) 40C 100g 離心 5min，倒去上清；
[0093](6)重復上一步驟2次；
[0094](7傭10%的甘油重懸，_70°C冰箱中保存。
[0095]電擊轉化:
[0096]取300ng的pKD46質粒與上述制備好的50 μ L感受態細胞混合，加入預冷的0.1cm電擊杯中，電轉儀設置1.8kV5ms,電擊后迅速加入ImL預冷的無抗LB液體培養基將細菌洗出移至小試管中，搖約2h后將菌液涂布于LB+Cm (氯霉素)+Amp (氨芐青霉素)固體培養基平板上，37°C溫育14~18h，獲得的克隆即為轉化子，命名為E.coli k-12/pBeloBACll/PKD46。
[0097]7、替換盒電轉至E.coli k-12/pBeloBACll/pKD46及替換子的獲得
[0098]接50 μ L E.coli K_12/pBeloBACll/pKD46 至 5ml LB+Cm+Ap3(TC搖過夜；次日，取200 μ L過夜培養菌液接種到含有20ml液體LB+Cm+Ap培養基的搖瓶中，30°C培養至OD600~0.3，加入終濃度0.2%L-阿拉伯糖，30°C繼續振蕩培養約lh，至OD6tltl = 0.4-06,誘導表達Red重組酶；誘導完成后，將菌液于冰上放置20min左右，制備電轉感受態^fDpnI消化后的替換盒電轉至E.coli K-12/pBeloBACll/pKD46中，菌液涂布到LB+Am (安普霉素)平板，37°C過夜培養；挑單克隆，用特定的引物進行菌液PCR驗證，設E.coli K-12/pBeloBACll/pKD46菌液為陽陰性對照，陰性條帶為811bp，陽性條帶為3406bp ；PCR結果見圖5，M:DL2000DNA Marker ;1~5:替換子菌液；-:陰性對照(K-12/pBeloBACll);陽性片段大小為3406bp，陰性片段大小為811bp。陽性菌42°C搖菌(清除pKD46)，提質粒測序，序列正確的命名為pBTIBACl。
[0099]二、pBTIBACl 功能驗證
[0100]PCR擴增ermEPlP2和EGFP片段，分別連入pMD18T載體，測序正確后取正向連入的ermEP 1P2重組質粒命名為pMD 18T_ermEP 1P2，反向連入的GFP重組質粒命名為pMD 18T-GFP，將ermEPlP2從pMD18T_ermEPlP2切下連入pMD18T_GFP的相應位點，所得重組質粒命名為pMD18T-eGFP，再將ermEPlP2+GFP從其上切下，連入pBTIBACl相應位點，所得重組質粒命名為pBTIBACl-eGFP，將其通過接合轉移轉化到變鉛青鏈霉菌TK24和1326中，得到的接合子可在含Am (50ug/mL)和萘啶酮酸(25ug/mL)的MS平板上傳代生長三次，刮取接合子孢子至YEME(含50ug/mL安普霉素和25ug/mL萘啶酮酸)液體培養基30°C 200rpm培養72h，將接合子孢子搖出的菌液先用分光光度計測濃度，然后用EnSpire多標記微孔板檢測儀(酶標儀)檢測綠色熒光蛋白的表達，以未轉化的變鉛青鏈霉菌菌液為空白對照，每一樣品加三個孔，參數設置為:激發波長480nm，發射波長510nm，測量兩次，相隔10s，第一次測量前振蕩10s，第二次測量前振蕩15s，所得數據取平均值后除以菌濃度繪制成圖表，結果見圖6、圖7。圖6是變鉛青鏈霉菌TK24轉化子的EnSpire酶標儀結果，其中，橫坐標為樣品標號，con為空白對照，I~12為轉化子；縱坐標為EnSpire酶標儀測量值/(0D_*1000)。圖7是變鉛青鏈霉菌1326轉化子的EnSpire酶標儀結果，其中，橫坐標為樣品標號，con為空白對照，I~17為轉化子；縱坐標為EnSpire酶標儀測量值/ (0D6CICI*1000)。
[0101]取TK2412#和132617s轉化子菌液用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，結果見圖8、圖9，從左到右分別為明場、暗場和明暗疊加。圖8是變鉛青鏈霉菌TK2412#轉化子表達綠色熒光蛋白照片(1000倍鏡)，con:陰性對照；12:11(2412#轉化子。圖9是變鉛青鏈霉菌132617s轉化子表達綠色熒光蛋白照片(1000倍鏡)，con:陰性對照；17:132617#轉化子。
[0102]三、MCS的插入得到載體pBTIBACll
[0103]由兩條寡核苷酸鏈退火得到，兩條寡核苷酸分別為:
[0104]5，AATTCCCTAGGTTAATTAAGTTTAAACATTTAAATG3，，
[0105]5，GATCCATTTAAATGTTTAAACTTAATTAACCTAGGG3，，對應的限制性內切酶分別為EcoR1、Avr I1、Pac1、Pme1、Swa1、BamHI,通過 EcoRI 和 BamHI 酶切插入，得到最終載體pBTIBACll，其結構示意圖參見圖1。
[0106]pBTIBACll 全長 10117bp，其序列如 SEQ N0.13 所示，其中
[0107]333-374:多克隆位點(MCS);
[0108]1558-782:安普霉素抗性基因(Am)；
[0109]3520-1679:整合酶基因(int);
[0110]3537-3575:整合位點(attp);
[0111]3923-4034:接合轉移片段(oriT)；
[0112]4980-5046:BAC 載體的復制區(oriS)；
[0113]5375-6130:BAC 載體的 r印A 基因；
[0114]6718-7884:BAC 載體的 sopA 基因；
[0115]7884-8855:BAC 載體的 sopB 基因；
[0116]8928-9401 =BAC 載體的 sopC 片段；
[0117]9651-10059 =BAC 載體的 cos 位點；
[0118]10104-10110:BAC 載體的 1xP 位點。
【權利要求】
1.一種由大腸桿菌接合轉移至鏈霉菌的BAC載體，其特征在于，其含有多克隆位點MCS, Am抗性基因，整合酶基因int，整合位點attp，接合轉移片段oriT，BAC載體的復制區oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位點和1xP位點。
2.根據權利要求1所述的由大腸桿菌接合轉移至鏈霉菌的BAC載體，其特征在于，所述的BAC載體為pBTIBACll，其核苷酸序列如序列表中序列13所示。
3.權利要求1所述的由大腸桿菌接合轉移至鏈霉菌的BAC載體的構建方法，包括以下步驟: (O首先設計一對引物，5’端帶有待替換氯霉素抗性基因上下游各55bp的同源臂，通過PCR擴增出含接合轉移oriT、定點整合attp-1nt和抗性篩選Am的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段，稱之為替換盒； (2MfRed同源重組輔助質粒pKD46電轉至含待替換質粒pBeloBACll的大腸桿菌k_12內，得到 Ecoli k-12/pBeloBACll/pKD46 ； (3)30°C培養E.coli k-12/pBeloBACll/pKD46過夜，次日按1:100轉接，加入終濃度為0.2%的L-阿拉伯糖，30°C培養至0D_=0.4~0.6，制成電轉感受態，將上述替換盒電轉至其中，通過安普抗性篩選得到氯霉素抗性基因被替換了的替換子，命名為pBTIBACl ； (4)體外合成鏈霉菌組成型啟動子ermEP^，并與綠色熒光蛋白基因GFP連接，由EcoR I和BamH I酶切連入pBTIBACl，得到重組質粒pBTIBACl_eGFP，將該重組質粒轉化ET12567/pUZ8002,再通過接合轉移轉至變鉛青鏈霉菌中； (5)合成新的多克隆 位點MCS,其上包含EcoR1、Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa 1、BamH I酶切位點，通過EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相應位點，得到最終載體pBTIBAClI ο
【文檔編號】C12N15/64GK104046648SQ201310083678
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2013年3月15日
【發明者】劉剛, 戴素琴, 陳惠鵬, 邢玉華, 張部昌 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所