專利名稱：煙草根特異啟動子的克隆及其在轉基因植物上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過以基因組學及功能基因組學為手段克隆煙草根特異表達啟動子的方法，屬于植物基因工程技術領域。
背景技術：
長期以來煙草根莖病害是影響煙草產量和品質的主要病害，如煙草青枯病、黑脛病等， 煙草青枯病是毀滅性病害，病菌從根部侵入，該病目前主要在我國的南方煙區如福建、湖南 等省份普遍發生，局部地塊發病率達到80%以上，且常與煙草黑脛病混合發生，嚴重時可 使全田煙草枯死(劉勇等2007)。迄今已知，青枯病菌為害XX科的XX物種，但對煙草青枯病 的防治至今沒有特效藥可治。關于根部特異表達的啟動子報道較少。SchneiderK等利用T-DAN標簽技術分 離克隆了可在Arabidopsis根毛表皮細胞中特異表達的核蛋白基因；XuY等對編碼水稻根 部特異表達蛋白的兩個cDNA克隆(RCc2和RCc3的特性進行深入分析，發現其編碼的蛋白 主要在幼根中表達)。目前在煙草上已克隆出一些組織特異性的啟動子，如種皮特異性啟動 子、花藥特異啟動子TA29等(Fobert, 1994;李國勝等，1995)。Yamamoio等人(1991)報道 煙草根特異表達的TobRB7基因的cds片段5’上游ISOObp區段中的片段，具根組織特異表 達調控功能，但主要在煙草幼根中表達。目前尚未見將煙草組織特異表達啟動子應用于轉 外源目的基因的報道。由于煙草是四倍體，遺傳背景及其復雜，選育良好的栽培種非常困難，而目前主要 栽培的品種經過多年栽培，已經容易產生根莖部病蟲害。植物基因組學與功能基因組學的 快速發展，通過分子育種來解決以往常規育種沒有辦法解決的科學難題已經成為了可能。 分子育種首先要考慮到啟動子，不同類型的啟動子給植物生長也帶來不同的影響，隨著轉 基因安全性得到了普遍關注，因此選擇有效的啟動子成為了當前分子安全育種的熱點與難 點。目前通過生物手段已經成功獲得了相應的特異啟動子。為植物安全育種提供了基礎。本發明針對以上背景技術，通過構建煙草SSHcDNA文庫，對文庫進行篩選，克隆得 到煙草根、莖特異啟動子ATTtVJ ，并利用特異啟動子構建高效植物表達載體，建立以抗生素 為篩選劑的轉基因遺傳體系，以及快速、高效的轉基因檢測技術，確定了煙草根部特異啟動 子的遺傳表達，為煙草抗根莖部病害品種的培育奠定了良好的技術基礎。
發明內容
本發明提供了一種煙草根特異啟動子的克隆及其在轉基因植物上的應用，利用特異啟 動子來安全有效的解決煙草生產過程中的根莖部病蟲害。本發明的煙草根特異啟動子，其至少含有SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。克隆煙草根特異啟動子的方法，包括SSH文庫的構建，探針的制作，文庫雜交篩選 特異基因，RT-PCR鑒定特異基因的時空表達，克隆全長基因序列，進而克隆上游的煙草根特 異啟動子；所述全長基因序列的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。具體地說，從我們所構建的煙草品種K326SSH差異表達文庫中篩選得到根特異表 達基因片段，對篩選得到的根特異表達基因進行鑒定，并克隆得到了全長特異基因，進而克隆特異基因上游的啟動子，然構建特異啟動子驅動GUS基因的植物表達載體，經農桿菌介 導將目的啟動子導入煙草品種翠碧一號上，對轉基因煙草進行GUS組織化學鑒定，確定了 煙草啟動子的特異性。其特征在于
1、構建煙草根差異文庫，對文庫進行篩選，得到差異表達基因；
2、煙草根特異啟動子NTR12的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示； 3、構建的植物表達載體為PBI121-NTR12:⑶S；所述的pBI121_NTR12:⑶S指以NTR12 為啟動子，⑶S為報告基因，Nos為終止子，Kam為篩選轉基因陽性植株的植物表達載體；
4、通過農桿菌介導法，獲得轉基因煙草陽性植株，通過GUS染色，證實了煙草啟動子 NTRl2的特異性。本發明通過分別構建煙草根和莖葉SSH抑制性消減雜交文庫，經文庫雜交獲到了 煙草根特異表達基因，經定量RT-PCR鑒定后為煙草根、莖特異表達基因。之后提取烤煙栽 培品種K326DNA，經酶切和加接頭后，通過FlankingPCR技術，克隆得到一段956bp的序列， 生物信息學分析表明為啟動子序列，定名NtR12。在pBI121上構建由NtR12::⑶S融合基因 的植物表達載體，轉化煙草K326中，對轉基因煙草的根莖葉等各個器官進行GUS染色，表明 NTR12啟動子在煙草的根部表達量大于35S啟動子的表達，在莖部有表達，而在煙草的葉片 部位檢測不到GUS活性，已應用于煙草抗青枯病轉基因利用。因此，得出該啟動子是一個重 要的根部表達啟動子，可以作為一種高效特異啟動子用于煙草等植物基因工程。根據上述培育方法，已經成功獲得轉PBI121-NTR12::⑶S載體的轉基因煙草，通 過與35S組合型啟動子進行對比鑒定，在根部的表達量高于35S，在煙草的莖部表達量低于 35S啟動子，而在葉片不表達，證實了煙草NTR12啟動子的特異性，為煙草轉基因安全育種 提供了有利的前景。本發明的煙草根部特異啟動子在轉基因植物上的應用所述轉基因植物的制備方 法，包括下述步驟
(1)將煙草根部特異啟動子序列插入表達載體中，構建帶該特異啟動子驅
動功能基因的植物表達載體。(2)利用所述植物表達載體導入農桿菌，獲得轉化體。(3)將所述的轉化體轉化植物，獲得轉基因植株。本發明的特異基因序列是煙草未報導過的序列，所克隆的啟動子序列是全新的， 通過promoterprediction和sigscan預測了 NtR12的啟動子序列，在NtR12啟動子中，存在 兩個轉錄單元起始轉錄單元875 925，聚合酶起始識別位點可能是37、7，且起始轉錄單 元得分為0. 97，基本可確定為完整的啟動子閱讀框架。通過PLANTCARE分析這NtR12啟動 子序列中存在基本的啟動子序列TATA-box和CAAT-box。序列的堿基組成含量顯示NtR12 啟動子AT占64. 6%，GC占35. 8%。AT豐富序列的低復雜度有利于DNA雙鏈結構的解螺旋， 提高基因的轉錄效率。啟動子存在GC盒，因為GC盒一般位于TATA-box和CAAT-box的上 游，所以猜測這兩個基因啟動子序列可能都接近完整的啟動子。使用PLANTCARE預測顯示， 這兩個基因啟動子都存在根啟動子的保守序列盒，這為下一步連入抗病基因，進一步進行 煙草轉基因鑒定打下堅實的基礎。已有報導TobRB7基因啟動子是唯一的煙草根特異表達啟動子，主要在根端即 幼根的伸長區表達，不在整個根系表達和伸長區以后的根部表達，因此，不能應來驅動抗性基因解決煙草的根莖部病害；而本發明得到的NtR12啟動子在煙草根組織和莖部都有表 達，我們用NtR12啟動子RIP基因，發現抗病基因可在根和莖表達，不在葉片表達。本發明的煙草根特異啟動子有以下優點傳統的分子育種所用的啟動子為組 合型35S啟動子，它在植株各組織器官發育的不同階段均表達，隨著轉基因安全性受到普 遍的關注，組合型35S啟動子已經不能滿足轉基因發展的需要，而且35S組合型啟動子容易 發生基因沉默；本發明的NtR12根部特異啟動子，在煙草的根部表達量比35S啟動子要高， 而葉片不表達，煙草是以收獲葉片器官的經濟作物，葉片上基因不表達，能提高煙草轉基因 的安全性。大田煙草種植過程中容易受到許多根、莖病蟲害的危害，而給煙草生產和品質造 成很到的損失，克隆煙草根莖特異啟動子，通過分子設計育種，能夠安全有效的解決煙草種 植過程中的根莖病蟲害。
圖1為煙草根、葉文庫的檢測；其中a表示根的cDNA文庫中菌落PCR產物電泳圖， b表示葉的cDNA文庫中菌落PCR產物電泳圖2為膜雜交獲得差異基因；a表示根cDNA探針與根cDNA點陣膜雜交部分結果，b表 示葉的cDNA探針與根cDNA點陣膜雜交部分結果； 圖3為煙草特異基因0G-12RT-PCR結果； 圖4為轉PBI121-NTR12基因煙草⑶S染色。
具體實施例方式
實施例1煙葉根與葉片總RNA的提取
將K326原種盤栽，待煙株長至旺長期時，取煙株倒2、倒3、倒5、倒6、倒9葉位的葉 片洗凈，迅速將葉片以主脈為界，倒2、倒3葉位的葉片二等分；倒5、倒6葉位的葉片4等分， 倒9葉位的葉片取葉片中間部位四等分，各取一份置于液氮中冷凍后置-80°C冰箱中保存。 待葉片取樣完畢時，迅速將根洗凈，取白根置于液氮中冷凍后置-80°C冰箱中保存。取2. 5g 根(實驗組Tester)與葉(驅動組Driver)置于研缽中加液氮研磨，取0. lg倒入預冷的0. 5ml 異硫氰酸胍變性勻漿液中，充分混勻lmin。加入0. lml2mol/LNaAc (pH4. 0)混勻lmin ；加 A 0. 5ml水飽和酚，振蕩30秒，冰浴5min。加入0. 2ml氯仿異戊醇(24 :1)，劇烈振蕩2次 3min，冰上放置lOmin。4°C，12000g離心15min。小心移取上層水相，棄去中間和下層有機 相。加入等體積酚氯仿異戊醇(25 24 :1)，振蕩2次3min，冰上放置5min。4°C,12000g 離心10-15min，移取上層水相，棄去中間和下層有機相。加入等體積異丙醇，放置-20°C 30 分種以沉淀RNA。4°C，12000g離心15min收集RNA沉淀，用75%乙醇洗滌沉淀；將RNA沉淀 在空氣中干燥。用30ulRNaSe-freeddH20或去離子甲酰胺溶解RNA沉淀；實施例2煙草根、葉cDNA抑制性消減雜交文庫的構建
對實施例1提取的RNA質量進行檢測，參照Proiega公司的polyATtract mRNAIsolationSystonsIII步驟進行分離mRNA,合成cDNA，第一鏈合成，取4ul的mRNA與 lulcDNASynthesisPriner混勻；短暫離心后，70°C溫育2nin后立刻冰置2nin，短暫離心后，依次加入 5XFirst-StrandBuffer2ul, dNIPMix(lOmMeach) lul, sterileH201ul, AMVReverseTranscriptase (20units/ ul) lul，DEPCH205ul，混勻后短暫離心，42°C反應lhr后，置冰上終止反應，第二鏈合成，在IHEP管中加入 sterileMMS. 4ul, 5XSecond-StrancBufferl6. Oul,dNIFMix (IQiM) 1.6ul, 20XSecond-StrancEnzynBCockta il4 Oul，短暫離心后在16°C反應2hr ；加入2ul (6U)的T4DNA聚合酶，混勻后16°C反應0. 5hr,力口入4ul 的 20XEDTA/Glycogen 終止反應。加入 lOOul 酚:氯仿異戊醇(25 24 :l)(pffi. 05-8. 35)振蕩后 14D0Qrpn 離心2(Mn ；移取上層水相，加入lOOul氯仿異戊醇(24 :1)，振蕩后MDOOrpm離心2(Mn ；移取上層水 相，加入40ul4M的NtpVC和300ul95%的酒精，振蕩后14D0Qrpn離心2(Mn ；用80%的酒精洗滌沉淀后， 室溫干燥l(Mn，溶于50ul的RNase-free水，取2ul合成的dsdM電泳檢測質量，其余的置_20°C保存。cDNA 的 Rsal 酶切與接頭(Adaptor)的連接，接頭 1 5，-CTMTACGACTCACTATAGGGCTC GAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，接頭 2R :5，-CTMTACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，； 3，-GCCGGCTCCA-5，)。二次抑制性消減雜交，第一次雜交，Rsal-digestedDrivercDNAl. 5ul, Adaptor1-1igatedTester 1 - 1 1 5u 1 (Adaptor 2R-1igatedTester 1 -2 ), 4XHybridizationBuffer 1. 0ul，98°C 反應 1. 5min 后置 68°C 反應 8hr,馬上進行第二次雜交。 取一個Ep管，依次加入下列物質，往管中加一滴礦物油，并瞬間離心后，98°C反應1.5min 后取出；加入 DrivercDNAlul，4XHybridizationBufferlul，sterileH202ul,將新鮮反應 Testerl-1與Testerl-2混合后，加入上述反應液2ul ；短暫離心后，68°C過夜反應，編代號為 Tester。同樣處理Driver，第二次雜交后仍編代號為Driver。加200ul的dilutionbuffer， 離心混勻，68°C反應7min后，置-20°C保存。將雜交后的產物進行兩次PCR，PCR所用 的引物為Primer 1 5，-CTMTACGACTCACTATAGGGC-3，，用于第一次PCR擴增；巢式引物1 (NestedPCR primerl) 5' -TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，；巢式引物 2R (NestedPCRprimer2R) 5’ -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’)；巢式引物用于第二次 PCR 擴增。進行第一次PCR，PCR反應程序為94°C25sec— (94°C lOsec — 66°C 30sec — 72°C 90s ec)27_33cycles。第二次 PCR 在 27cycles、30cycles、33cycles 時各取出 3ul 反應液，加水 27ul，混勻；取出lul的稀釋液，進行第二次PCR
在15cycle與20cycle時各取出8ul反應液電泳檢測PCR擴增效果。PCR產物的純 化，操作參照 Promega 公司 pGEM -TandpGEM 3 -TEasyVestorsKit 進行，擴增產物 4°C
過夜連接，電激轉化，電激轉化設置的參數電壓1500V、電容50uF、電阻129 Q，涂板培 養質粒，進行菌落 PCR，PCR 程序 94°C 5min — (94°C lOsec — 68°C 30sec — 72°C 90sec) 35cycles — 72°C lOmin。cDNA檢測結果表明如圖1所示，根、葉菌落PCR的結果以單克隆 為主，所擴增的片段大小在200bp至1000bp之間，大小在文庫所要求的范圍之內。即所構 建的K326的根、葉的抑制性消減cDNA文庫在庫容量、重組率以及插入片段的大小等方面均 符合良好文庫的質量標準，能夠滿足測序的要求。實施例3煙草根特異基因的克隆及序列特征分析
分別制備煙草根和莖、葉的cDNA，通過地高辛標記制備探針，雜交篩選煙草根特異表達 文庫做成的DNA點陣膜Macroarray，熒光拍照，比對地高辛標記雜交后的照片，從中找出存 在差異的斑點，重新培養單克隆送測序如圖2所示。結果表明篩選出130個差異較為明顯 的克隆送測序，測序的結果在NCBI上進行比對，有71個片段與煙草、番茄等雙子葉植物已 發表的序列有較高的同源性，其中得到差異基因片段0G-12，經5’和3’ RACE后，得到了一 個長度為848bp的帶完整閱讀框的全長cDNA,利用FGENESH (http//linuxl. softberry. com/berry, phtml)進行預測分析，預測結果表明其編碼框為720bp，編碼239個氨基酸，經 Blast分析表明，該基因表達蛋白與蓖麻表達主莖28kDa糖蛋白前體具有97%的同源性。是煙草上的一個新的基因。實施例4煙草根特異啟動子的克隆及特性分析
提前種植烤煙K326材料，60d后選取幼根為材料，在液氮中研磨植物組織成粉末，并轉 移到在65°C預熱的盛有抽提液的離心管中。在65°C溫育45min，其間不時混勻。用等體積 的24 1的氯仿/異戊醇抽提勻漿，顛倒混勻(溫和)。4°C，lOOOOrpm離心5min，回收上清液。 在上清液中加入1/10體積的65°C的CTAB/Nacl的溶液，顛倒混勻(溫和)。用等體積的24 1的氯仿/異戊醇抽提勻漿，顛倒混勻(溫和)。4°C，10000rpm離心5min，回收上清液。加 入1倍體積的CTAB沉淀液，翻轉混勻，見到沉淀后進行下一步；否則于65°C溫育30min。于 4°C，10000rpm離心5min。移出上清，但不要丟棄，用0. 5ml高鹽的TE緩沖液重懸沉淀，如 果沉淀難于重懸，于65°C溫育30min，重復至所有的或大部分沉淀溶解。加入0. 6倍體積的 異丙醇沉淀核酸，充分混勻(溫和)，4°C，lOOOOrpm離心15min。用80%乙醇洗沉淀，晾干，并 用0. lml的緩沖液溶解沉淀。最后加入1/20體積的RNA酶在37°C放lh。最后放在_20°C 保存備用。用內切酶Hind III對基因組DNA進行完全酶切，反應結束后，用無水乙醇沉淀回 收DNA并溶解于10ul滅菌蒸餾水，DNA酶切產物與接頭的連接反應，LongAd: 5'GTAATACGA CTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGC3
ShortEco 5 ’ P-AATTGCAGCCCG-NH23’，ShortHind5’ P-AGCTGCAGCCCG-NH2 16°C反應過夜③反應結束后，72°C處理15min，然后低溫保存，進行兩次PCR，將連接產 物0. 5ul加入16. 5ul滅菌蒸餾水中，94°C加熱lOmin，依次加入
lOxLAPCRBufferll (Mg2+plus) 2. 50ul, TaKaRaLATaqO.25ul, dNTPMixture (2. 5m) 4. OOul, API (10pm) 0. 50 1, SP1 (10pm) 0. 50ul，進行第一次 PCR，
AP15，GtaATACgACTCACTATAgggC3，，spl5'GCTAGTCATGTACTCGCTCACGTAG3， PCR1 反應程序:94°C 5min — (94°C 30sec — 72°C 2. 5min)10cycle — (94°C 30sec — 67°C 3min) 30cycles，將PCR1產物稀釋50倍取lul作為模板后，依次加入10xExTaqPCRBufferII (Mg2+plus) 2. 50ul,TaKaRaLATaqO. 25ul, dNTPMixture (2. 5m)4. OOul，滅菌蒸餾水 16. 25ulAP2 (10pm)0. 50ul，SP2 (10pm) 0. 50ul，進行第二次 PCR，所以得弓丨物為 AP2~C5，TggTCgACggCCCgggcTgc3，，NtR12sp25' 0GCCA TA0GCCAGCTCAAACAATTG3'。PCR2 反應程序 M°C 2min — (94°C 30sec — 72°C 2. 5min)5cycle — (94°C 30sec — 67°C 30sec — 72°C 3min)35cycles。PCR產物 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收 啟動子目的片段。得到一個長度為956bp的0G-12基因的5’上游序列，進一步利用PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/)預測分析了 NtR12基因5，上游序列956bp，發現其含有 大多數高等植物啟動子的保守元件，說明它具有潛在的啟動子活性。預測結果表明含多個 TATAbox和CAATbox，此外高等植物啟動子區核心保守序列一般比較靠近轉錄起始位點，轉 錄起始位點位于883bp處，距轉錄起始位點_185bp處的TATAbox和_280bp處的CAATbox 很有可能是決定該啟動子轉錄起始和轉錄效率的重要元件。另外，從0G-12基因的5’上游 序列的預測結果看出該啟動子區存在若干器官特異性表達和植物激素應答的特異元件，如 含有多個YACT保守序列，該序列為植物細胞特異表達的順式元件的重要組合部分。存在若 干器官特異性表達和植物激素應答的特異元件，如CANNTG-基序、響應誘導物的應答元件 W-Box (TGAC)及MYb元件響應植物激素元件。CANNTG和GATA等順式作用元件是決定植物 組織器官特異表達的轉錄因子結合點，MYb元件控制植物次生代謝、調節細胞形態建成及信 號傳導通路中起很大作用。通過上述分析可以說明0G-12基因的5’上游序列具有啟動子功能并根據其相關保守序列說明該啟動子具有一定的根特異表達的潛力，為下一步的功能 驗證奠下良好的基礎。通過特異基因0G-12RT-PCR如圖3所示，所克隆得到的煙草NtR12 啟動子是特異啟動子，煙草特異啟動子NtR12在生長的各個時期特異性不一樣，生長期基 因在煙草葉片不表達，而在旺長期表現出高度的根特異性，基因只在煙草根本表達。結果表 明，煙草特異啟動子NtR12在生長的各個時期特異性不一樣，生長期基因在煙草葉片不表 達，而在旺長期表現出高度的根特異性，基因只在煙草根本表達。實施例5煙草0G-12基因啟動子表達載體構建
通過設計引物 NT-ID12-F:5，-acgtgagcgagtacatgac-3，NT_ID12_R:5，-GTGCGCAACAA GAAGTCTAC-3’，利用PCR擴增出目的片段，在引物兩頭設計兩個Hind III與BamH I兩個酶 切位點，將含由⑶S基因的pBI 121載體和PCR擴增的到的NtR12啟動子進行Hind III和 BamH I進行雙酶切，回收載體和目的片段，利用T4連接酶16°C過夜連接，轉化涂板，于37°C 培養箱過夜培養，挑取單克隆進行菌落PCR，將陽性克隆送出去測序，所得的載體命名為 pBI121-NtR12，將載體轉入EHA105農桿菌中。實施例6煙草的遺傳轉化
1. 煙草無菌苗的獲得以及根瘤農桿菌侵染液的制備
往1. 5毫升的離心管中放入大概200粒左右的CB—1煙草種子，用70%的酒精進行消 毒1分鐘，在超凈工作臺上用事先準備好的無菌水清洗三次用0. 1%的砷汞進行消毒10-15 分鐘無菌水再次清洗5次，將處理好的無菌種子種植在1/2MS培養基上。從YEB固體平板上挑取含有重組質粒的單菌落，接種到含有Rif和Km的液體培 養基中，28°C 250rpm培養過夜；取1ml過夜培養的菌液接種到30ml含有相應抗生素(或無 任何抗生素)的YEB液體培養基中繼續振蕩培養，至0. D. 600=0. 6-0. 8，4000rpm，4°C離心 lOmin，棄上清；沉淀用20mlMS液體培養基(MS大量+MS微量+20g/l蔗糖，pH=5. 8)重新懸 浮備用。分光光度計測得此時菌液的0. D. 600在0. 3-0. 6左右。2. 根瘤農桿菌介導的煙草遺傳轉化
外植體制備取事先培養的無菌苗嫩葉，剪切成0. 5X0. 5cm大小。葉盤法轉化將處 理好的外植體投入制備好的菌液中，浸泡侵染5mi后，用含有Cef500mg/L的無菌水沖洗3_5 次后，接種于共培養基中于28 °C暗培養；2天后轉入含有Cef500mg/L、kam200mg/L的葉片芽 誘導培養基上篩選培養，控制溫度為25-28°C、光強為20001eX、每天光照時間為12_14hr。 等葉芽長至1cm大hr，轉入生根培養基。待基部伸出大量根系、上部生長至3 4cm的幼苗 轉至盛有無菌沙土的培養盒內，煉苗后轉入溫室培養，并進行GUS檢測。誘導培養基培養 基 +0. lmg/LNAA+lmg/L6-BA,共培養培養基MS 培養基 +0. lmg/LNAA+lmg/L6_BA，誘導篩選 培養基MS 培養基+0. lmg/LNAA+lmg/L6-BA+200mg/Lkam+500mg/LCef，生根培養基MS 培養 基 50mg/LKam+500mg/LCefo實施例7⑶S的組織化學染色及觀察
取新鮮的轉基因煙草植株，將煙草的根、莖、葉切成小塊放入1.5ml的離心管中， 加入⑶S液(配置0. 2mol/L的磷酸二氫納溶液A與0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液B，取 溶液A39ml+61ml溶液B+100ml無菌水配置成溶液C，使PH=7. 0。取6. 25ml的溶液 C+13mgX-GLU+0. 25ml 二甲基亞砜+18. 5mlddH20配成GUS染色液)。將含有植物材料和GUS 染液的離心管，放到37°C的恒溫培養箱里，染色3h。最后脫去染色液，通過70%的乙醇脫色后，觀察照相。經過對轉pBI121-NtR12基因的煙草各個不同組織染色觀察如圖4所示，為煙 草特異啟動子驅使GUS基因在煙草翠碧一號的表達情況，從圖中可以看出煙草特異啟動子 在根部的表達遠大于35S啟動子誘導的GUS基因在煙草根本的表達量，而在煙草的莖部表 達量上特異啟動子NtR12低于組合型35S啟動子，在煙草葉片的表達上可以看出特異啟動 子在煙草葉片不誘導GUS基因表達，而組合型35S啟動子誘導GUS基因在煙草葉片表達量 很大。結果表明在煙草根、莖有藍色出現，而煙草的葉片以原來的一樣，未發現有藍色。特別 是煙草的根部出現了很深的藍色，即該啟動子具有根部表達的特異性。而對照的轉PBI121 空載體進行觀察，在煙草各各個器官均出現了藍色現象，表明了以往35S組合型啟動子不 能適應未來轉基因安全育種的要求。
權利要求
一種煙草根特異啟動子，其至少含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.種克隆如權利要求1所述的煙草根特異啟動子的方法，包括SSH文庫的構建，探針的 制作，文庫雜交篩選特異基因，RT-PCR鑒定特異基因的時空表達，克隆全長基因序列，進而 克隆上游的煙草根特異啟動子。
3.根據權利要求2所述的克隆煙草根特異啟動子的方法，其特征在于所述全長基因 序列的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。
4.一種含有權利要求1所述的煙草根特異啟動子或由權利要求2或3所述的方法克隆 的煙草根特異啟動子的植物表達載體。
5.根據權利要求4所述的植物表達載體，是PBI121-NTR12。
6.一種含有權利要求1、4或5所述的煙草根部特異啟動子在轉基因植物上的應用。
全文摘要
本發明提供了一種煙草根特異啟動子的克隆及其在轉基因植物上的應用。該煙草根特異啟動子，其至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。克隆煙草根特異啟動子的方法，包括SSH文庫的構建，探針的制作，文庫雜交篩選特異基因，RT-PCR鑒定特異基因的時空表達，克隆全長基因序列，進而克隆上游特異啟動子。所述的煙草根部特異啟動子應用于轉基因植物。本發明的NtR12根部特異啟動子，能提高煙草轉基因的安全性。能安全有效地解決煙草種植過程中的根莖病蟲害。
文檔編號C12N15/10GK101875937SQ20101022815
公開日2010年11月3日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者蘭嵐, 莊偉建, 潘建箐, 蔡鐵城, 閆利明, 陳華, 陳順輝 申請人:福建農林大學