專利名稱：綿羊k71皮膚毛囊特異性啟動子及其克隆的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子遺傳學領域，涉及一種綿羊皮膚毛囊特異性啟動子及其克隆，具體涉及一種皮膚毛囊特異性表達基因角蛋白71(K71)5’調控區特異性啟動子的克隆分析。
背景技術：
基因的表達和基因的功能不僅是分子生物學研究的核心內 容(這里基因的概念不僅僅是指編碼蛋白的DNA序列)，也是分子生物學技術應用的關鍵環節。轉錄調控在基因表達中占有很重要的地位，其調控機制也非常復雜。其中，啟動子與調控轉錄起始的轉錄因子相互作用，嚴格控制著基因表達(轉錄)的起始時間、地點和表達豐度的高低，決定了基因轉錄的組織特異性和表達強度，所以啟動子的復雜而精細的調控是機體維持正常生理活動的基礎和前提。隨著基因工程的發展，常常需要構建一種能高水平、組織特異性表達外源蛋白質的表達載體。啟動子對外源基因的表達水平影響很大，因此也就成為基因工程表達載體的重要元件。在開展毛囊發育中基因表達的調控機制、培育目標基因在毛囊特異性高效表達轉基因細毛羊等研究中，非常需要獲得皮膚毛囊組織特異性表達的啟動子指導目標基因的表達，從而準確地分析和評價不同的目標基因對皮膚毛囊發育、發生和生長的功能和作用。這些基礎研究工作不僅能豐富對毛囊發育的調控機制的認識，而且也為細毛羊生產中培育細毛羊優良品種、提高羊毛產量、改善羊毛品質提供科學依據。角蛋白71是毛囊內根鞘的重要組成蛋白，利用全基因組關聯分析證明了 K71是控制毛發彎曲的主要基因。然而，在羊上目前還沒有相關的研究報道，該基因的報道序列只有編碼區的部分序列。通過克隆獲得綿羊K71啟動子序列，構建K71皮膚毛囊毛皮質外源基因特異性表達載體，不僅能用于毛發彎曲、毛囊發育中基因表達調控機制的研究，而且對轉基因細毛羊的培育也起到了促進作用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種綿羊K71皮膚毛囊特異性啟動子及其克隆，首先通過染色體步移克隆綿羊K71基因5’調控區的序列，進一步研究發現其具有組織特異性啟動子的調控活性。該啟動子具有皮膚毛囊表達的特異性，僅在皮膚毛囊中能夠特異性地啟動其下游基因的表達，滿足目標基因在皮膚毛囊中特異性的表達，為皮膚毛囊特異性表達載體的構建及轉基因羊的生產奠定了基礎。其技術方案如下本發明所提供的綿羊皮膚毛囊特異性表達K71基因5’調控區啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，并通過報告基因分析確定了該啟動子的特征。首先，通過染色體步移的方法獲得綿羊皮膚毛囊特異性表達K71基因5’調控區序列，長度為3. 7kb，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。然后，通過報告基因熒光素酶基因來分析啟動子的活性和組織特異性。通常，在不改變受體細胞的生理活動條件下，通過檢測啟動子下游的報告基因的表達情況，就可以知道啟動子表達與否、比較啟動子表達強弱。其中，熒光素酶基因就是動物細胞、個體模型最常用的報告基因。因此，我們將綿羊皮膚毛囊特異性表達K71基因5’調控區序列(長度為
3.7kb)插入到pGL3 Basic載體中，得到啟動子報告基因的分析載體，同時以pGL3_CMV載體作為陽性對照，PGL3 Basic載體(無啟動子載體)作為空白對照，分別轉染綿羊原代成纖維細胞和小鼠C2C12成肌細胞。48小時后利用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性，以此評價啟動子的活性及其組織特異性。具有上述序列的啟動子或者截短的序列，具有皮膚毛囊特異性的啟動活性，而在皮膚細胞之外的細胞中沒有活性，可見該啟動子在皮膚毛囊中特異性的啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在皮膚毛囊特異性的表達要求，能應用于毛發彎曲、毛囊發育中基因表達調控機制的研究以及轉基因羊的培育。 與現有技術相比，本發明的有益效果為研究證實，含本發明的啟動子具有皮膚毛囊組織特異性表達的活性。實驗中，僅在人表皮角質化細胞中檢測到熒光素酶的活性，而在皮膚毛囊細胞之外的細胞中沒有檢測到顯著的熒光素酶的活性。說明克隆得到的K71基因5’啟動子調控區序列只能在皮膚毛囊中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在皮膚毛囊特異性的表達要求，能應用于轉基因羊的培育。
圖I是擴增綿羊K71基因5’調控區結果圖，(其中M為150bp marker，I為第一輪擴增產物，2為第2輪擴增產物，3為第三輪擴增產物);圖2是擴增綿羊K71基因5’調控區結果圖，(其中M為Ikb marker，1，2為K71的擴增產物)；圖3是K71皮膚毛囊組織特異性啟動子在不同類型細胞中活性評價結果圖
具體實施例方式下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細地說明。本發明涉及遺傳資源新疆細毛羊自行采集于中國新疆烏魯木齊市新疆畜牧科學院綿羊繁育基地。I.綿羊K71基因5’調控區的克隆(I)采集綿羊血液，使用肝素納抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA。(2)使用Genome Walking Kit試劑盒(大連寶生物)AP3結合設計的三條下游引物，擴增綿羊K71基因5’調控區，引物序列如表I所示，可參見序列表SEQ ID N0:2、SEQ IDNO 3, SEQ ID N0:4。按照試劑盒中提供反應體系和反應程序進行，結果見圖I、圖2。表I
引物名稱引物序列
K71SP1 CCAGGAGGCTCTCATTGACAGTG
K71SP2 CCATMCCTCCACTCTTCCCACTG
權利要求
1.一種綿羊K71皮膚毛囊特異性啟動子，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 1所示。
2.權利要求I所述啟動子K71在轉基因羊培育中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種綿羊K71皮膚毛囊特異性啟動子及其克隆，即角蛋白71(K71)的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。本發明提供了綿羊皮膚毛囊特異性表達K71基因5’調控區啟動子克隆，并通過報告基因分析驗證了該啟動子的特征。本發明克隆得到的K71基因5’啟動子調控區序列只在皮膚毛囊中特異性地啟動其下游目的基因的轉錄表達，能夠滿足目的基因在皮膚毛囊特異性表達的要求，并能應用于轉基因羊的培育。
文檔編號C12N15/113GK102643817SQ20121008897
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者劉明軍, 張寧, 張雪梅, 李文蓉, 瑪依拉, 賀三剛 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心