利用微流控芯片連續高速分析單細胞內容物的裝置及方法

專利名稱：利用微流控芯片連續高速分析單細胞內容物的裝置及方法
技術領域：
本發明涉及一種利用微流控芯片連續高速分析單細胞內物質的裝置及方法，屬于 單細胞分析技術領域。
背景技術：
單細胞分析對癌癥等重大疾病早期診斷、治療、藥物篩選和細胞生理、病理過程的 研究有重要意義。由于細胞微小(直徑8μπι 200μπι，體積fL nL)，樣品量極少(zmol fmol)，細胞內組分十分復雜，分析難度很大。毛細管電泳技術是目前進行單細胞多組分分 析使用最多的方法。但毛細管電泳技術受毛細管一維結構的限制，單細胞進入毛細管電泳 時需使用玻璃毛細管拉制成的直徑為微米級的尖端吸住單個細胞，配合以精密的微動操作 器，才能完成單細胞進樣操作，因此復雜耗時，對操作人員要求很高。所以分析速度很慢。每 天只能分析幾十個細胞。由于微流控芯片的網絡結構和微米級的通道尺寸，以及芯片毛細管電泳高效分離 的特性，單細胞的進樣、溶膜以及胞內物質的分離分析可以在一塊微流控芯片上實現。在十 字和雙T微流控芯片上，通過電控、液壓結合電控或激光鑷子，操縱單細胞從微流控分析芯 片的進樣通道進入分離通道，使細胞精確停留在分離通道中進樣口管壁上，靜態溶膜后，通 過芯片毛細管電泳分離分析測定胞內物質的含量。但固定細胞在分離通道進口管壁上和靜 態溶膜的操作復雜，需要時間也較長，因此大大限制了單細胞分析的速率。這種方法分析單 細胞的速度在每小時25個細胞以下。至今為止，只有三篇文獻報道了在微流控芯片上進行連續高速分析單細胞內物質 含量的方法。但細胞連續進樣時細胞懸浮液中的生理鹽水和單細胞一起進入分離通道，導 致電泳時焦耳熱增加，分離性能變差。為了避免焦耳熱的增加，需使用昂貴的脈沖交流電 疊加直流電的特殊電源和微量注射泵等設備(Analytical Chemistry 2003，75，5646 5655)。由于這些原因，在微流控芯片上進行連續高速分析單細胞內物質的方法未得到廣泛 應用。

發明內容
本發明提供一種結構簡單能連續高速分析單細胞內物質的微流控芯片和操作方法。本發明采用的技術方案是—種利用微流控芯片連續高速分析單細胞內容物的裝置，主要包括微流控芯片、 高壓直流電源和激光誘導熒光檢測器，所述微流控芯片上設置有呈十字相交的進樣通道和 分離通道，在進樣通道兩側，各設置有一條鞘流通道，兩條鞘流通道與進樣通道沿進樣液流 向相交于十字交叉點上游，與十字交叉點距離為10 1000微米，進樣通道一端設置樣品 池、另一端設置樣品廢液池，分離通道一端設置緩沖液池、另一端設置緩沖液廢液池，在兩 條鞘流通道另一端均設置有鞘流液池。通常，進樣通道，鞘流通道寬度和深度需大于或等于和分離通道的寬度和深度。高壓直流電源電壓一般為500 10000V，正極與緩沖液池相連、 負極與緩沖液廢液池相連，在分離通道內形成直流電場。激光誘導熒光檢測器的檢測點一 般設置在緩沖液廢液池與十字交叉點之間的分離通道中，用于檢測待測物質在激光誘導下 發出熒光的光強度。本發明通過在十字型微流控芯片進樣通道的二側各加一條鞘流通道，鞘流液由溶 膜劑和電泳緩沖溶液混合配制，提供一種結構簡單能連續高速分析單細胞內物質的微流控 芯片和操作方法。通過調節樣品廢液池和其他儲液池之間的液面差，使置于樣品池中的細 胞懸液和鞘流同時從樣品池和鞘流液池流出。細胞懸液中的單細胞通過進樣通道與鞘流 通道的交叉點后，受到鞘流從二個側面的擠壓而自動排成一行，細胞在運行過程中與加在 鞘流液中的溶膜劑接觸并快速溶膜于分離通道入口處，在分離通道兩端電場力作用下，溶 膜后的細胞內容物從進樣通道進入分離通道，流經設置于分離通道上的激光誘導熒光檢測 器，通過檢測熒光強度對細胞內容物含量進行分析。在本發明中，進入微流控芯片分離通道 中的溶液是鞘流液和細胞懸液中生理鹽水的混合溶液。它既可以使單細胞在分離通道入口 處快速溶膜，還可以使進入分離通道中細胞懸液的比例大大縮小，使電泳緩沖液中生理鹽 水的濃度大大降低，顯著減少焦耳熱導致的譜帶增寬。所述兩條鞘流通道分別與進樣通道沿進樣液流向呈15 75°角相交。參見圖1和圖2本發明提供的連續高速分析單細胞內物質的微流控芯片上有緩沖 液池(B)、樣品池(S)、樣品廢液池(SW)、二個鞘流液池(SF1和SF2)和緩沖液廢液池(BW)以 及進樣通道、鞘流通道和分離通道。所述的樣品儲液池和樣品廢液池之間的通道為進樣通 道S-SW ；在進樣通道的二側各有一條與鞘流液池相通的鞘流通道，所述的分離通道B-BW和 進樣通道垂直相交，進樣通道與分離通道十字相交于0點，兩條鞘流通道與進樣通道相交 于0點上游。激光點置于0點下游的分離通道下方，用于檢測細胞內物質在激光誘導下發 出熒光的光強度。本發明還涉及一種利用所述裝置連續高速分析單細胞內容物的方法，所述方法包 括在緩沖液池和緩沖液廢液池中加入電泳緩沖液，鞘流液池加入溶有溶膜劑的電泳緩沖 液即鞘流液，樣品池中加入待測細胞懸液，使細胞懸液和鞘流液同時從樣品池和鞘流液池 流出，細胞懸液和鞘流液沿通道匯合后形成單細胞流，細胞在運行過程中與加在鞘流液中 的溶膜劑接觸并快速溶膜于分離通道入口處，在分離通道兩端電場力作用下，溶膜后的細 胞內容物全部從進樣通道進入分離通道，流經設置于分離通道上的激光誘導熒光檢測器， 通過檢測熒光強度對細胞內容物含量進行分析。通過改變溶膜劑的種類、濃度以及兩條鞘 流通道與進樣通道沿進樣液流向相交于十字交叉點上游的距離，可使細胞在與鞘流溶液接 觸50ms內快速溶膜于分離通道入口處，溶膜后的細胞內容物在分離通道二端分離電場所 產生的電場力的作用下，全部進入分離通道。本方法的關鍵在于利用含有溶膜劑的鞘流液對細胞懸液側面進行擠壓使之自動 排成一行，并使之快速溶膜，具體溶膜劑及電泳緩沖液可按本領域常規方法進行選擇，本領 域普通技術人員可根據常識，依據待測細胞的不同選擇不同的溶膜劑。通常，細胞濃度為 0. 5 IOX 105cells/mL，溶膜劑在緩沖液中濃度為0. 1 10% (w/w)。本發明中微流控芯片單細胞的分析步驟如下在微流控芯片上緩沖液池B和緩沖液廢液池BW中加入電泳緩沖液，鞘流液池SF1和SF2中加入含溶膜劑的電泳緩沖溶液，在樣品池S中加入細胞懸液，樣品廢液池SW空置。 在液面差導致的靜壓力的驅動下，樣品池中的細胞懸液和鞘流同時從樣品池和鞘流液池流 出，細胞液流與鞘流通道會流后，細胞懸液中的單細胞受到鞘流的擠壓排成一行繼續運行， 并在運行中與鞘流液中的溶膜劑接觸，在分離通道二端分離電場所產生的電場力的作用 下，每分鐘可控制150個細胞連續、單個地從進樣通道進入分離通道，并在分離通道入口處 于50ms內快速溶膜，溶膜后的細胞內容物全部進入分離通道被芯片毛細管電壓連續、高速 地地分離檢測。本發明方法操作方便，通過調節樣品廢液池和其他儲液池之間的液面差，可以使 細胞懸液中的單細胞在鞘流擠壓下自動排成一行，大大提高了單細胞的進樣速率，避免了 多個細胞同時從進樣通道進入分離通道；通過將溶膜劑加在電泳緩沖液中作為鞘流液，可 以使單細胞在分離通道入口處快速溶膜，并使溶膜后的細胞內容物全部進入分離通道予以 連續、高速地分離檢測。由于進入微流控芯片分離通道中的溶液是鞘流液和細胞懸液中生 理鹽水的混合溶液，還可以使細胞連續進樣時進入分離通道中生理鹽水的濃度大大降低， 顯著減少焦耳熱導致的譜帶增寬。


圖1為鞘流聚焦連續分析單細胞的微流控芯片示意圖；圖2為鞘流聚焦連續分析單細胞的裝置圖；圖3為微流控芯片鞘流聚焦連續分析單細胞示意圖；圖4為單細胞內容物電泳檢測結果圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 參見圖1，微流控芯片上有緩沖液池⑶、樣品池⑶、樣品廢液池(SW)、二個鞘流 儲液池(SF1和SF2)和緩沖液廢液池(BW)。進樣通道為S-SW，長度為12mm、通道寬95 μ m， 深35 μ m,通道S-O長度為6mm ；分離通道為B-BW，長度為46mm，通道寬65 μ m,深20 μ m，通 道B-O長度為6mm ；進樣通道與分離通道十字相交于0點。在進樣通道的二側各有一條鞘流 通道，與進樣通道相交于0點上方200nm處，鞘流通道寬95 μ m,深35 μ m,長度為6mm。在進 樣通道，分離通道和鞘流通道的端點處各打小孔，在小孔上用粘接劑粘合微量塑料儲液池。參見圖2，將電泳緩沖液(如硼酸緩沖液、N-甘氨酰胺緩沖液等)100yL、100 μ L 分別加入儲液池B和BW中，將100 μ L用熒光試劑孵育過的細胞懸液(1. 2X105cells/mL) 加入樣品池S。將含有溶膜劑(常規溶膜劑，如triton X-100，十二烷基磺酸鈉、毛地黃皂 苷等)的電泳緩沖液100 μ L，100 μ L分別加入鞘流儲液池SF1和SF2,儲液池SW中不加溶 液。在分離通道二端的B和BW儲液池中施加2000V直流電壓。參見圖3，由于液面高度不同，細胞懸液中的細胞從儲液池S流向SW。同時含有溶 膜劑電泳緩沖液從鞘流液池SF1和SF2流出。細胞液流與鞘流通道會流后，鞘流從二個側 面的擠壓細胞懸液中的細胞，使細胞排成一行。細胞在運行中與鞘流液中的溶膜劑接觸，當細胞運行到進樣通道與分離通道的交叉點0后，被施在分離通道二端分離電場所產生的電 場力的作用下，使單細胞依次從進樣通道拐彎進入分離通道并在在分離通道入口處快速溶 膜，溶膜后的細胞內容物全部進入分離通道。通過調節樣品廢液池和其他儲液池之間的液 面差和細胞懸液中細胞的濃度，每分鐘可控制150個細胞連續地單個地從進樣通道進入分 離通道，并在分離通道入口處于50ms內快速溶膜，溶膜后釋放出的細胞內容物質被芯片毛 細管電泳連續、高速地分離檢測。實施例2 單個血紅細胞內谷胱甘肽和活性氧的測定本實施例使用的微流控芯片與實施例1 一致，樣品為紅細胞懸液。用萘二甲 醛和雙氫羅丹明123分別標記細胞中谷胱甘肽和活性氧，用生理鹽水稀釋配置密度為 1. 2X IO5ceIlsAiL細胞懸液后，加入樣品池；將20mmol硼酸緩沖溶液(pH 9. 2)加入儲液 池B和Bff中，將含有溶膜劑(tritonX-100，濃度1%，w/w)電泳緩沖液(20mmol硼酸緩沖 溶液，pH 9. 2)加入鞘流儲液池SF1和SF2中，各儲液池中的加液量與實施例1 一致。在分 離通道二端的B和BW儲液池中施加2000V直流電壓。由于液面高度不同，紅細胞懸液中的細胞從儲液池S流向SW。同時含有溶膜劑電 泳緩沖液從鞘流液池流出，通過進樣通道與鞘流通道的交叉點后，使紅細胞排成一行。細胞 與添加在鞘流液中的溶膜劑triton X-100在運動中相接觸。當細胞運行到進樣通道與分 離通道的交叉點0后，在分離通道二端分離電場所產生的電場力的作用下，單細胞依次從 進樣通道拐彎進入分離通道并在分離通道入口處快速溶膜，溶膜后的細胞內谷胱甘肽和活 性氧全部進入分離通道。被芯片毛細管電泳連續、高速地分離檢測。測定結果見圖4。通過 控制單細胞的進樣速度和分離通道的長度，可以使同一個單細胞內谷胱甘肽和活性氧達到 基線分離，且不同單細胞間的測定結果也不互相干擾。從圖4可見，在19秒內測定了 12個 細胞中的谷胱甘肽和活性氧含量。
權利要求
一種利用微流控芯片連續高速分析單細胞內容物的裝置，主要包括微流控芯片、直流電源和激光誘導熒光檢測器，所述微流控芯片上設置有呈十字相交的進樣通道和分離通道，在進樣通道兩側，各設置有一條鞘流通道，兩條鞘流通道與進樣通道沿進樣液流向相交于十字交叉點上游，與十字交叉點距離為10～1000微米，進樣通道一端設置樣品池、另一端設置樣品廢液池，分離通道一端設置緩沖液池、另一端設置緩沖液廢液池，兩條鞘流通道另一端均設置有鞘流液池。
2.如權利要求1所述的裝置，其特征在于所述兩條鞘流通道分別與進樣通道沿進樣液 流向呈15 75°角相交。
3.一種利用權利要求1所述裝置連續高速分析單細胞內容物的方法，所述方法包括 在緩沖液池和緩沖液廢液池中加入電泳緩沖液，鞘流液池加入溶有溶膜劑的電泳緩沖液即 鞘流液，樣品池中加入待測細胞懸液，通過調節樣品廢液池和其他儲液池之間的靜壓力差， 使細胞懸液和鞘流液同時從樣品池和鞘流液池流出，細胞懸液和鞘流液沿通道匯合后自動 排成一行，形成單細胞流，細胞在運行過程中與加在鞘流液中的溶膜劑接觸并快速溶膜于 分離通道入口處，在分離通道二端分離電場所產生的電場力的作用下，溶膜后的細胞內容 物全部進入分離通道被連續、高速地分離，分離后細胞內容物中各組份流經設置于分離通 道上的激光誘導熒光檢測器，通過檢測熒光強度對細胞內容物中各組份的含量進行分析。
全文摘要
本發明提供了一種結構簡單的連續高速分析單細胞內物質的微流控芯片和操作方法。本發明在十字型微流控芯片進樣通道的二側各加一條鞘流通道，通過調節儲液池之間的靜壓力差，使細胞懸液和鞘流液同時從樣品池和鞘流液池中流出，在鞘流的作用下，細胞懸液中的單細胞排成一行，依次從進樣通道進入分離通道，并在運行過程中與溶膜劑接觸、在分離通道入口處于快速溶膜，在分離通道二端所產生的電場力的作用下，溶膜后的細胞內容物全部進入分離通道被連續、高速地分離，激光誘導熒光檢測。由于進入分離通道中的溶液是鞘流液和細胞懸液中生理鹽水的混合溶液，本發明還可以大大降低進入分離通道中生理鹽水的濃度，顯著減少電泳時由焦耳熱導致的譜帶增寬。
文檔編號C12Q1/02GK101923053SQ20101023027
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月19日 優先權日2010年7月19日
發明者劉金華, 徐春秀, 殷學鋒 申請人:杭州師范大學