專利名稱：一種布魯氏菌分子標記高免疫保護性弱毒活疫苗及構建方法
技術領域：
本發明提供一種布魯氏菌分子標記高免疫保護性弱毒活疫苗，尤其是對弱毒疫苗 加以分子標記，減弱其毒力，用外源基因提高其免疫保護性，用血清學方法能將該疫苗接種 的人和動物與野毒感染的區分開來。本發明還提供了該疫苗的構建方法，屬于分子生物學 技術與疫苗生產技術領域。
背景技術：
布魯氏菌病(Brucellosis)是由小球桿狀布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病， 該嚴重危害了公共衛生安全，每年因此病造成的損失達百億元。當前的布魯氏菌疫苗種類較多。重組蛋白疫苗與DNA疫苗保護性能有限，滅活疫 苗保護期短。目前人和動物多用弱毒疫苗來防治該病，弱毒疫苗較前幾種疫苗保護作用及 效果好，但它同樣存在著缺陷，致使人們不敢、不愿也不能對其廣泛應用。主要原因是其 一，接種后人們無法區別自然感染和人工接種免疫。其二，毒性大。其三，也是最關鍵的一 點是，它保護性能低。所以研制一株能用血清學方法區分人與動物是自然感染還是人工接 種免疫，毒力弱、安全性能好，保護性能高的布魯氏菌病弱毒疫苗具有重要的實踐意義。所以構建一株能區分是自然感染還是人工接種免疫，保護性能好，毒力弱的布魯 氏菌弱毒疫苗是本發明的任務。
發明內容
本發明公開一種布魯氏菌分子標記高免疫保護性弱毒活疫苗，用血清學方法可區 分自然感染或野毒感染的加上分子標記、高保護性能的布魯氏菌弱毒疫苗，解決了常規的 布魯氏菌疫苗不能區分人與動物是人工免疫接種還是野生菌感染、保護性能低的問題。本發明還提供了該疫苗的構建方法，建立起結核病快速診斷檢測方法。本發明的布魯氏菌分子標記高免疫保護性弱毒活疫苗，特征在于該疫苗是用外源基因30KD基因代替布魯氏菌弱毒疫苗株S19的VirB5基因，對 S19加以分子標記。本發明所述弱毒疫苗的構建方法，包括以下步驟以布魯氏菌的弱毒疫苗株S19為起始材料，用PCR的方法從S19的染色體中擴增 出要改造的目的基因VirB5的引導序列，并把它克隆到T載體上，進行基因改造；通過分 子克隆將結核桿菌外分泌蛋白30KD替換VirB5基因，再克隆到ρΒΚ-CMV上而成重組質粒 PBK-VIRB5,并在pBK-VirB5加上sacB基因，最終成為同源重組載體pBVs ；用電轉化法把同源重組載體pBVs轉入布魯氏菌S19中，使其線性化，而后插入受 菌體S19的基因組中，并與VirB5基因發生置換；篩選出單交換子后，再篩選同源重組雙交 換子，即得疫苗。本發明的積極效果在于提供布魯氏菌分子標記、高免疫性弱毒活疫苗，及提供基
3于所說的突變株疫苗的方法。這對布魯氏菌病監測、診斷、凈化和控制具有重要意義，具有 廣泛的應用實踐價值。
圖1、在基因打靶引誘臂上，用PCR方法分別從S19基因組中擴贈出30KD基因片段 電泳圖，證實了 30KD基因替換了 virB5基因。圖2、VIRB5蛋白純化電泳圖。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發明。本領域技術人員可以理解 到，在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明的任何平行改變和改動都將落入本 發明的待批權利要求范圍內。實施例1一、同源重組載體(自殺性質粒)的構建1材料與方法1. 1菌株、質粒、載體布魯氏菌S19株、DH5a、T_sacB、pBluescript SK+本研究室保 存；pBK-CMV購自 Stratagene 公司；pSP-Luc NF+購自 Promega公司；pMD18_T simplevector 購自TakaRa公司。1.2試劑限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶I (Klenow大片段)，大腸 桿菌 DNA 聚合酶 I，LA-Taq DNA polymerase、Ikbp DNA Ladder Marker、質粒 DNA 提取試劑 盒、DNA凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產品。1.3PCR 擴增1. 3. 1含有VirB5基因同源重組指導序列的擴增根據VirB5基因的序列以及 pMD18-Tsimple vector和pBK_CMV噬菌粒載體特點分別設計引物。從布魯氏菌S19的基因 組中擴增。1. 3. 2結核桿菌30KD基因擴增 設計引物從結核桿菌基因組中擴增。1. 3. 3sacB基因的擴增 分別設計5'端含有限制性內切酶BamH I的上游引物 與含有Sal I酶切位點的下游引物。上游引物GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAG ACAT ；下游 弓丨物 GGATCCTGGGATTCAC CTTTATGTTGATAAG,以 95"C 預變性 5min，94"C變性 75s，60"C退火 75s, 72°C延伸90s反應條件，最后72°C延伸IOmin,以質粒pIP279為模板，擴增sacB基因。1.4自殺性質粒的構建把1. 3. 1中的擴增出的的基因片段(其中包含VirB5基因)，與pMD18_T相連得 到重組質粒P VirB5。把1. 3. 3擴增出的30KD與pMD18_T相連而成重組質粒p30KD。把 1. 3. 4擴增出sacB基因片段與pMD18_T相連而成重組質粒pSacB。最后按照設計方案組成 自殺質粒pBVs。2 結果2. IPCR擴增結果從布魯氏菌S19株基因組擴增出含有VirB5基因；可觀察到與 理論值大小相符條帶。2. 2質粒pBVs酶切電泳鑒定經Xho I單酶切，在7100bp左右有一電泳帶，與預
4期值相符；經XbaI單酶切，在5400bp左右有一電泳帶，與預期值相符；經EcoR I單酶切，在 12000bp左右有一條帶，與預期值相符。二、布魯氏菌分子標記、毒力缺失疫苗株Δ S19-30KD的構建1.1試劑 試劑同上。1. 2肝湯培養基 取新鮮的牛肝去脂肪、筋膜后絞碎，秤取500g，加自來水 IOOOmL與之混合，置鍋中煮沸lh，過濾，加水補足原量，加入NaCl 5g，蛋白胨10g。肝湯瓊 脂配制取上述肝湯培養基IOOOmL,加入瓊脂20g，高壓滅菌備用1. 3電轉化1. 3. 1感受態的制備 取240mL對數生長前中期(0D_ = 0. 15)布魯氏菌液體 培養物放入預冷的250mL離心管中，迅速將培養物置于冰水混和物中15 30min，不時的緩 慢搖勻保證內容物充分冷卻。然后4°C IOOOXg離心15min，回收細胞，倒去培養液，用冰冷 10%的丙三醇重懸沉淀，以IOOOXg離心15min洗滌細胞3次。最后用3mL 10%的丙三醇 重懸沉淀制成感受態。1. 3. 2電轉化操作步驟 取0. 5 μ g自殺質粒加入100 μ L上述制作的布魯氏菌 電轉感受態中混勻，加入電擊杯中，以E = 12. 5kv/cm電擊，然后立即加入37°C預熱的ImL 的肝湯培養基中。放入搖床以37°C 180r/min振蕩培養24h。取出200mL涂布于含有篩選 標記的肝湯瓊脂平板上，3d后篩選出重組子，挑選出單菌落，進一步培養鑒定。1. 4同源重組子的篩選1.4. 1單交換子的篩選 把電轉化受體菌涂布在含有篩選標記(Amp 100mg/L， Kan50mg/L)的肝湯瓊脂平板上，因同源重組載體上帶有篩選標記基因，所以很容易的篩選 出單交換子。1. 4. 2雙交換子的篩選 將獲得的同源重組單交換子液體培養3d，適當稀釋， 涂布于添加5%蔗糖的肝湯培養基平板上，37°C培養4d。因自殺質粒上含有sacB基因，該 基因編碼的果糖蔗糖酶，能將蔗糖水解為果糖并生成大相對分子量質的果聚糖，在G-細菌 周質空間(極少數G+細菌的假周質空間結構)累積，導致細胞停止生長或死亡，挑取單菌 落即為陽性同源重組雙交換子(丟失sacB基因和抗性等載體序列)命名為AS19-30KD。1.5雙交換子的驗證1. 5. IPCR方法的驗證 在VirB5基因的同源臂上設計引物，同時在S19與雙交 換子Δ S19-30KD基因組中擴增目標基因片段，比較其大小。2 結果2. IPCR法法驗證同源載體pBVs插入S19染色體上與AS19-30KD雙交換子正確性 用PCR方法分別從S19、同源載體插入后的S19、A S19-30KD的基因組中分別擴增出不同片
段，與預期目標一樣。2. 2PCR方法驗證改造后的virB5基因在Δ S19-30KD雙交換子的正確性在基因打 靶引誘臂上，設計一對引物，用PCR方法分別從S19基因組中擴贈出30KD基因片段。證實 了 30KD基因替換了 virB5基因，電泳圖見附圖1。2. 4AS19-30KD遺傳穩定性分析 將Δ S19-30KD傳至20代，用PCR驗證，結果 同上述(2. 4PCR方法驗證)。證明Δ S19-30KD具有遺傳穩定性。試驗例1
布魯氏菌VIRB5蛋白基因的克隆、表達及純化布魯氏菌VIRB5蛋白是一種具有強免疫原性的外周漿蛋白。使用VIRB5蛋白作為 檢測抗原，應該有較高的準確性。本發明克隆了布魯氏菌的VIRB5蛋白基因，并進行了表達，表達產物通過親和層 析進行了純化。1材料與方法1. 1 材料1. 1. 1菌株與、質粒、載體布魯氏菌S19、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21和pET28a+本研究室保存； pMD18-Tsimple vector 購自 TakaRa 公司。1.1.2 儀器分光光度計Lambda 3B (UV/V/S)，Perkin-ELMER ；脫色搖床 TY-80B，南京大學。1. 1. 3限制性內切酶及其它試劑限制性內切酶 NdeI、EcoRI、SacI、Hind III、SalI 和 T4DNA 連接酶均購自 TaKaRa 公司。DNA回收試劑盒同第一章；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體購自鼎國生物公司； RNase購于華美生物工程公司；IPTG及TMB購自Sigma公司；PVDF膜為Millipore公司 產品；丙烯酸胺、雙甲基丙烯酞胺、低分子量蛋白Marker購自TaKaRa公司；布魯氏菌陽性 牛血清本室研制，辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG購自鼎國生物公司；金屬鰲合層析介質 Sepharose-4-B _ 自 Pharmacia ^W]。1. 2 方法1. 2. 1目的基因的擴增與克隆根據VirB5基因的序列以及pMD18-T simple vector和pET28a+表達載體的特點 分別設計引物用PCR的方法從S19基因組中擴增出VirB5基因片段。重組質粒pMDVirB5 送上海生工生物公司進行測序。1. 2. 2重組表達質粒pETVirB5的構建 用限制性內切酶同時消化pMDVirB5與pET28a+，分別凝膠回收純化VirB5與 pET28a+基因片段。取目的片段lyL、載體3ul混合后，加IOXLigation buffer 2μ1，Τ4 DNA連接酶。1. 2. 3表達質粒轉入BL21表達菌將質粒快速轉化受體菌將1 μ L質粒加入到冰浴的已融化的BL21感受態細菌中， 輕輕混勻。繼續冰浴30min，42°C熱休克90s后，立即冰浴3min。將處理過的全部感受態菌 鋪到預先在37°C預熱的含50ug/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均勻涂布菌液，至平板 表面的菌液被全部吸收。37°C孵箱過夜培養。1. 2. 4融合蛋白VIRB5_His的表達。取單個轉化菌落接種到3ml含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培養液中。于搖床 中37°C，轉震蕩培養4h至OD6tltl值達0.38。取出ImL未誘導的培養物，轉移到另一管中， 12000轉離心lmin，棄上清，保留菌體作為未誘導的對照。剩余培養物中加入IPTG至終濃 度lmmol/L進行誘導，37°C繼續震蕩培養。4h后，收集菌體。1.2.重組蛋白的親和層析
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每克菌(濕重)加入3ml 裂解緩沖液(pH7. 920mmol/L Tris-HCl，5mmol/L imidazole，0. 5mmol/L NaCl)，重懸細菌沉淀。按每毫升裂解緩沖液加入10 μ 1 MgSO4 (Imo 1/ L)，10 μ IDnase (2mg/mL)，2 μ 1 PMSF(50mmol/L)的比例，加入上述三種試劑，冰上孵育 30min 5000轉離心15min收集沉淀，按每克菌濕重加入5ml結合緩沖液的比例，將沉淀用結 合緩沖液重懸，-70°C放置過夜。將-70°C放置的菌液冰上融化后，超聲破碎菌體。5000rpm, 4°C離心15min，收集上清。-70°C保存或立即用于純化。將待純化的樣品加到金屬鰲合的柱中，并以最佳流速讓其流過柱床。加入洗脫緩 沖液，待紫外監測儀數值上升時開始接樣，隨數值上升可分段接樣。直到數值回落后一段時 間停止接樣。2 結果2. lVirB5基因的擴增與克隆用PCR方法從布魯氏菌基因組中擴增與VirB5理論大小值相符把目標基因克隆到 T載體上，提取質粒，與環形pMDVirB5理論大小值相符。2. 2VirB5蛋白在大腸桿菌BL21中表達及SDS-PAGE分析把重組質粒pETVirB5轉化到大腸桿菌BL21中，挑選陽性克隆，培養到OD6tltl = 0. 38時，加入IPTG到最終濃度lmmol/L，分別誘導2、3、4小時，觀察VirB5蛋白在大腸桿菌 BL21中表達情況，分析認為誘導4個小時的表達量最高。2. 4融合蛋白親合層析純化SDS-PAGE分析純化的VIRB5蛋白可見只有一條帶，如附圖2所示，凝膠薄層掃描分 析純度為89%。實驗例2Δ S19-30KD分子標記功能的驗證用純化的VIRB5蛋白可以區別開野毒株感染與Δ S19-30KD接種動物。為了進一 步驗證這一理論，用S19與Δ S19-30KD接種小鼠實驗，而后驗證。1材料與方法1. 1 材料1. 1. 1 菌株布魯氏菌S19本研究室保存；Δ S19-30KD見前述。1. 1. 2ELISA 試劑配制:(1)包被液碳酸鹽緩沖液Na2CO3 (無水碳酸鈉)1. 6g，NaHCO3 (碳酸氫鈉)2. 9g，加去離子水至1000mL。(2)洗滌液pH9· 2磷酸鹽緩沖液(Tween-2O)Na2HPO4 12H20 2. 9g, KCl 0. 2g, KH2PO4 0. 2g, NaCl 18g，吐溫-20 0. 5mL 加去離子 水至IOOOmL(3)甲液 0. lmol/L 檸檬酸 4. 2g/200mL,乙液 0. 2mol/L Na2HPO4 · 12H20 14. 3g/200mL，取甲液24. 3mL與乙液25. 7mL混合，臨用前加20mg鄰苯胺(OPD)，加過氧化氫 (H2O2) 0. 02mL。(4)終止液2mol/L H2SO4溶液取分析純濃硫酸IlOmL,加去離子水至100mL。1. 1. 3實驗動物
昆明鼠購自長春市生物制品所1. 2 方法1. 2. 1布魯氏菌接種小鼠前的處理用PBS洗兩次，然后用生理鹽水稀釋到1萬/mL。1.2. 2實驗小鼠的接種把布魯菌S19與Δ S19-30KD培養到對數生長期，用生理鹽水洗滌三次；用生理鹽 水稀釋到目的濃度；對小鼠采用腹腔注射。1. 2. 3被檢動物血清的制備對用S19與Δ S19-30KD免疫14天的小鼠斷尾采血，血樣在4°C冰箱放置3個小時 后，5000rpm離心5min，取上清即為制備血清。1. 2. 4檢測方法(I)ELISA檢測按常規方法進行，將純化的目的蛋白稀釋到lOng/mL后包被酶標 板，用被檢動物血清1 300稀釋作為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 1 3000 稀釋作為二抗。同時用標準陰性和標準陽性血清作對照。(2)操作過程用微量移液器向每個孔內加100 μ L包被液稀釋的蛋白樣品，置濕 盒內于37°C恒溫培養箱中lh，然后于4°C冰箱中包被過夜。次日，用洗滌液洗滌二次，甩去 洗滌液，倒置在紗布上輕輕拍扣使孔內的液體充分流出，每次間隔3min。向孔內分別加入 用稀釋液稀釋好的1 100陽性血清、陰性血清0. lmL，置濕盒內于37°C恒溫箱中反應Ih 后，甩去血清，用上面的方法洗滌3次，再加入稀釋好的1 200酶標記兔抗牛IgG 0. ImL, 置于濕盒內于37°C恒溫箱靜置，甩去殘留的酶標記物溶液，以同法洗滌三次。加入底物溶液 ΙΟΟμ L/mL，置濕盒內于37°C恒溫箱中靜置30min，取出后立即向孔內加入0. 02mL終止液， 終止反應。(3)結果判定將培養板放入分光光度計讀取450吸收波的OD值。2 結果用VIRB5蛋白區分接種10萬S19與Δ S19-30KD菌體，7d后的小鼠將純化的VIRB5蛋白作抗原，用ELISA法檢測S19與Δ S19-30KD接種的小鼠血清 中是否含有VIRB5蛋白的抗體，很易容區分S19和Δ S19-30KD接種的小鼠。具體ELISA讀 數如下表。從表中數據可以明顯分辨出S19與AS19-30KD接種的差異。證實了 AS19-30KD 具有分子標記功能。S19與Δ S19-30KD接種小鼠7d后ELISA檢測血清結果抗原稀釋的 4只接種S19的小鼠血清 PBS 4只接種AS19-30KD的小鼠血
權利要求
一種布魯氏菌分子標記高免疫保護性弱毒活疫苗，特征在于該疫苗是用外源基因30KD基因代替布魯氏菌弱毒疫苗株S19的VirB5基因，對S19加以分子標記。
2.根據權利要求1所述弱毒疫苗的構建方法，包括以下步驟以布魯氏菌的弱毒疫苗株S19為起始材料，用PCR的方法從S19的染色體中擴增出 要改造的目的基因VirB5的引導序列，并把它克隆到T載體上，進行基因改造；通過分子 克隆將結核桿菌外分泌蛋白30KD替換VirB5基因，再克隆到ρΒΚ-CMV上而成重組質粒 PBK-VIRB5,并在pBK-VirB5加上sacB基因，最終成為同源重組載體pBVs ；用電轉化法把同源重組載體PBVs轉入布魯氏菌S19中，使其線性化，而后插入受菌體 S19的基因組中，并與VirB5基因發生置換；篩選出單交換子后，再篩選同源重組雙交換子， 即得。
全文摘要
本發明提供了一種布魯氏菌分子標記高免疫保護性弱毒活疫苗及構建方法，是對弱毒疫苗加以分子標記，減弱其毒力，用外源基因提高其免疫保護性，用血清學方法能將該疫苗接種的人和動物與野毒感染的區分開來，對布魯氏菌病監測、診斷、凈化和控制具有重要意義，具有廣泛的應用實踐價值。
文檔編號C12N1/21GK101912607SQ201010242130
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月2日 優先權日2010年8月2日
發明者宮鵬濤, 張楠, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉, 閆廣謀 申請人:吉林大學