專利名稱：一種胡椒果皮脫膠菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種胡椒果皮脫膠菌及其在胡椒果實脫皮 中的應用。
背景技術：
胡椒(Piper nigrum L.)屬胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)多年生常綠藤 本植物，原產于印度，是世界重要的熱帶香辛料作物，是人們喜愛的調味品，在鎮痛、鎮靜、 抗炎、抗驚厥、保肝、殺蟲、抗癌等多方面存在活性，廣泛用于醫學工業和食品工業。胡椒的初產品主要為黑胡椒和白胡椒，黑胡椒是由胡椒鮮果直接曬干而成，而傳 統的白胡椒生產方法是由胡椒鮮果經浸泡脫皮后曬干而成，白胡椒較之黑胡椒具有香辣味 柔和，色澤淡雅等優勢，目前世界市場對于白胡椒的需求正日益增長。目前白胡椒的加工技 術仍以傳統的水慪脫皮法為主，造成產品大小不均勻，外觀差，不能滿足胡椒加工產業化的 發展要求，阻礙了我國胡椒的大規模出口，嚴重制約了國內胡椒種植業和加工業的可持續 發展。脫皮是胡椒初加工中的關鍵工序，通常采用水慪脫皮、機械脫皮，酶法脫皮和微生 物法脫皮4種。傳統的水慪法脫皮存在著加工周期長、占地面積大、耗水量大、勞動強度大 等缺陷，易造成黑白胡椒粒的混雜和微生物的污染；機械脫皮法存在大量消耗化工原料和 熱量、成本高、胡椒受損和脫膠廢液難以完全符合國家廢水排放標準等問題；酶法脫皮總成 本高，而微生物脫皮法具有“高產、優質、高效、節能、低污染”等特點是胡椒脫皮工藝的發展 方向。目前，專門針對胡椒脫皮進行的微生物篩選報道較少，參見Vaidyanatha LyerThankaman，Raghavan Nair Giridhar. Fermentative production of white pepper using indigenous bacterial isolates.Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2004,9:435-439;以及唐堅，劉四新，譚勇，等.胡椒果皮脫膠菌株的篩選[J].廣東農業科 學，2009，7 :194-195.，但其篩選的菌株用于胡椒脫皮需4_5d才能將胡椒果皮脫除干凈，還 沒有真正實現高效快捷。
發明內容
本發明目的在于針對目前胡椒脫皮周期長的缺陷，提供一種胡椒果皮脫膠菌，利 用本發明所述胡椒果皮脫膠菌培養液的上清浸泡胡椒果實，2天內可將胡椒果皮脫除干凈， 方便快捷。本發明所述胡椒果皮脫膠菌WCZC0110是經分離培養基初篩、發酵培養基復篩和 胡椒鮮果脫皮效果實驗篩選出的菌株，已于2010年7月20日保藏于中國典型培養物保藏 中心，菌種保藏號=CCTCC M2010184，鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。對菌株WCZC0110進行16S rRNA基因序列分析，結果表明，菌株WCZC0110的16S rRNA基因序列與芽孢桿菌屬(Bacillus)同源，其生物學特征為菌體直桿狀；大小約為0. 6X3. 6 μ m ；菌株為革蘭氏染色反應陽性菌，G+ ；好氧；V-P試驗陽性；接觸酶陽性；能分解 果膠。本發明所述胡椒果皮脫膠菌WCZC0110在4h后進入對數生長期，12h后進入生長 的穩定期；培養4-52h內產果膠酶量較高，在24h有一個產酶高峰值；在25-40°C下培養均 能產較高活性的果膠酶，最適溫度為30°C ；培養液初始pH為6. 0-9. 0時所產果膠酶活性較 高，其最適PH為7. 5。本發明所述胡椒果皮高效脫膠菌WCZC0110，其培養液可用于提高植物果實的 脫皮效率，特別適用于胡椒鮮果的脫皮。其優選的脫皮方法是將胡椒果皮高效脫膠菌 WCZCOl 10進行培養，其培養條件為溫度25-40°C，種齡6_12h，培養液初始pH6. 0-9. 0，發酵 4-52h，培養液離心取上清用于胡椒脫皮，2d內可將胡椒果皮脫除干凈，作為優選，所述離心 為 15000r/min 離心 5min。與現有技術相比，本發明所述胡椒果皮脫膠菌的培養液離心后的上清在25-40°C 下，浸泡胡椒鮮果，脫皮30-48h，可使胡椒鮮果的果皮腐化；脫皮后的胡椒經漂白、干燥處 理后，即得白胡椒粒。整個過程周期短，操作簡單，可在2天以內加工出品質高的白胡椒，解 決了我國在白胡椒加工中存在的周期長、勞動強度大，品質低等難題，為胡椒優質、高效、節 能、低污染型加工技術體系提供技術支撐。生物材料保藏信息保藏日期2010年7月20日；保藏機構保藏于中國典型培養物保藏中心；保藏地址武漢大學；菌種保藏號CCTCCM 2010184 ；分類命名芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。
圖1示本發明所述胡椒果皮脫膠菌WCZC0110生長曲線；圖2示本發明所述胡椒果皮脫膠菌WCZC0110產酶曲線。
具體實施例方式本發明公開了保藏編號為CCTCC M 201018的胡椒果皮脫膠菌WCZCOl 10及其在胡 椒果實脫皮中的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需 要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為 包括在本發明。本發明的產品及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在 不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合， 來實現和應用本發明技術。以下結合闡述實施例，進一步闡述本發明。實施例1 菌株的分離純化從海南文昌、瓊海、海口、萬寧等地的胡椒種植區采集土樣及胡椒慪液樣品，各稱 取20g或吸取20mL樣品，置于含IOOmL無菌水的500mL三角瓶中，于30°C搖床中100r/min 振蕩培養Id ；取上清或混合液ImL移入50mL富集培養基中富集培養ld，取ImL混合液加入盛有9ml無菌水的25mL試管中充分混勻，制成稀釋度10—1，10_2，10_3，10_4、10_5、10_6的懸液； 然后對10_4、10_5、ΙΟ"6三個梯度各取0. ImL涂牛肉膏蛋白胨平板，每個稀釋度各做3塊平板， 30°C下培養3d。挑取平板上形態不同的菌落，在牛肉膏蛋白胨平板上劃線純化；將純化后 的菌轉接至牛肉膏蛋白胨斜面上，30°C下培養3d，4°C下保存備用。所述富集培養基配制方法各組分含量(g/L) (NH4)2SCM 6. 0，KH2PO4 4. 5，K2HPO4 10. 5，酵母粉3. 0，果膠2. 0，用蒸餾水定容，調節pH值為7. 5，121°C滅菌20min。實施例2 菌株初篩將實施例1中分離的菌落，點種于分離培養基上，選擇在分離培養基上產生較大 黃色變色圈的菌株。由于分離培養基中加入了 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液作為pH指示劑，果 膠酶產生菌降解培養基中的果膠產生D-半乳糖醛酸，培養基即由原來的紫色變為黃色，產 生變色圈。經過初篩，共篩選出菌株20株。所述分離培養基配制方法各組分含量(g/L) (NH4)2SO4 6. 0，KH2PO4 4. 5，K2HPO4 10. 5，酵母粉1. 5，果膠2. 0，瓊脂20. 0，用蒸餾水定容至IOOOmL,調節pH值至7. 0，加1. 6% 溴甲酚紫乙醇溶液3mL，121°C滅菌20min。實施例3 菌株復篩將實施例2中篩選的菌株20株，接種于種子培養基中，30°C培養18h，然后以3% 的量接種于發酵培養基中，30°C、200r/min培養2_3d后，15000r/min離心5min，取上清，測 定果膠酶活力，結果見表1。表1菌株復篩酶活力測定結果 由表1可知，果膠酶活力較強的5株菌株分別是QHOO17，WCZCO110，HK0041，QH0002 和HK0036，其中菌株WCZCOl 10所產果膠酶活力最強，達466. 3U/mL。種子培養基為本領域中眾所周知的牛肉膏蛋白胨培養基；果膠酶活力的測定方法 是利用本領域的已知方法(參見王小敏，吳文龍，閭連飛，等.分光光度計法測定果膠酶活 力的方法研究[J].食品工業科技，2007，28 (5) :227-229.)。所述發酵培養基配制方法各 組分含量(g/L)硫酸銨10. 0、酵母粉5. 0、果膠2. O.NaCl 2. 0、MgS04 · 7H20 1. 0，用蒸餾水 定容至IOOOmL,調節pH值至7. 0，121°C滅菌20min。實施例4 胡椒鮮果脫皮效果實驗將實施例3 中篩選出的 5 株菌 QH0017，WCZCOl 10，HK0041，QH0002 和 HK0036，接入 種子培養基，30°C、200r/min培養ld，按3%的接種量接種于含IOOmL發酵培養基的500mL 三角瓶中，30°C、200r/min好氧培養24h ；培養液經1，5000r/min離心5min ；取上清各5mL， 加入到裝有25g胡椒的250mL三角瓶中，各瓶中加蒸餾水lOOmL，30°C下靜置脫皮，每隔6h 取出觀察脫皮效果，結果見表3。胡椒的選擇應符合《胡椒栽培技術規程》(NY-T 969-2006)的成熟果穗，即至少有 2-4粒果變紅或整穗果變黃的果穗。胡椒鮮果脫皮程度分5級0級不脫皮；1級少量脫皮；2級半脫皮；3級大部分脫 皮；4級完全脫皮。胡椒經脫膠菌所產酶液脫皮后，清洗、護色、晾曬后得白胡椒產品，對其 進行感官評價，評價標準見表2。表2.感官評價表 表3.胡椒鮮果脫皮實驗結果 由表2、3可知，采用對照組CK方法(傳統水慪法脫皮)脫皮，周期長，脫皮程度 低，為3級，感官評價為中，且白胡椒比例低；而菌株WCZC0110，HK0041和QH0002不僅脫皮 完全，均達4級，而且白胡椒比例高；從脫皮時間看，WCZC0110最短為2d，感官評價最好，達 到優等。綜合上述實驗結果，確定菌株WCZCOl 10為高效胡椒果皮脫膠菌。菌株WCZC0110已于2010年7月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏 號CCTCC M 201018，鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。實施例5 對菌株WCZCOl 10進行16S rRNA基因序列分析對菌株WCZCOl 10進行16S rRNA基因序列分析，結果表明，WCZCO110的16S rRNA 基因序列與芽孢桿菌屬(Bacillus)同源性達99%，結合生理生化特性實驗，將WCZC0110 鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，其主要生物學特征為菌體直桿狀；大小約為 0. 6X3. 6 μ m ；革蘭氏染色反應陽性；好氧；V-P試驗陽性；接觸酶陽性；能分解果膠。實施例6 菌株WCZC0110生長曲線的確定挑取單菌落接種于IOmL的種子培養基中，在30°C下，200r/min培養，每隔2h，用 723分光光度計測定600nm下的吸光度值。結果如圖1，菌株WCZCOl 10在4h后進入對數生 長期，在6-12h為其對數生長期末期，12h后進入生長的穩定期。在菌株WCZC0110處于對數 生長期的中后期接種，有利于縮短發酵周期和較高的接種量，因而確定其種齡為6-12h，可 為其在胡椒鮮果脫皮工藝中的應用提供依據。實施例7 菌株WCZC0110產酶曲線的確定 按照實施例6所確定的種齡，按照3%的接種量接種于IOOmL發酵培養基中，30°C、 200r/min培養，利用本領域的已知方法每隔4h測定果膠酶的活性，果膠酶活力的測定方法 參見(王小敏，吳文龍，閭連飛，等.分光光度計法測定果膠酶活力的方法研究[J].食品工 業科技，2007，28 (5) :227-229.)。結果如圖2所示，菌株WCZCOl 10的產酶曲線為先上升后 下降，在4-52h范圍內產酶量較高，在24h有一個產酶高峰值，可為其在胡椒鮮果脫皮工藝 中的應用提供依據。實施例8 溫度對菌株WCZCOl 10產酶活性的影響設定發酵溫度分別為4°C，15°C，200C，25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，按照實施例 6 所確定的種齡，種子液按照3%的接種量接種于IOOmL發酵培養基中，在200r/min培養，發 酵24h后，分別測定果膠酶的活性，研究溫度對菌株WCZC0110產酶活性的影響。結果顯示，
7菌株WCZC0110在25-40°C下均能產較高活性的果膠酶，最適溫度為30°C，可為其在胡椒鮮 果脫皮工藝中的應用提供依據。。實施例9 初始pH值對WCZCOl 10產酶活性的影響設定培養液初始pH 值分別為 4. 0，4. 5，5. 0，5. 5，6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0，8. 5，9. 0，
9. 5，按照實施例6所確定的種齡，種子液按照3%的接種量接種于IOOmL發酵培養基中， 在30°C，200r/min下培養，發酵40h后，分別測定果膠酶的活性，研究初始pH值對菌株 WCZCOl 10產酶活性的影響。結果顯示，菌株WCZCOl 10在培養液初始pH為6. 0-9. 0均能產 較高活性的果膠酶，產果膠酶的最適PH為7. 5，可為其在胡椒鮮果脫皮工藝中的應用提供 依據。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
權利要求
一種胡椒果皮脫膠菌，保藏編號為CCTCC M 2010184。
2.根據權利要求1所述胡椒果皮脫膠菌在胡椒果實脫皮中的應用。
3.一種胡椒果實脫皮的方法，其特征在于，取處于對數生長期的胡椒果皮脫膠菌CCTCC M 2010184在初始pH為6. 0-9. 0的發酵培養基中25_40°C培養4_52h，取培養液離心，取上 清液浸泡胡椒果實30-48h。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述培養溫度為30°C。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基初始pH值為7.5。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述培養時間為24h。
7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述離心為15000r/min離心5min。
全文摘要
本發明涉及微生物技術領域，公開了一種胡椒果皮脫膠菌，其保藏編號為CCTCC No.M2010184，分類命名為芽孢桿菌。本發明還提供所述胡椒果皮脫膠菌在胡椒果實脫皮中的應用。將所述胡椒果皮脫膠菌培養4-52h后，將其培養液離心后，取上清液浸泡胡椒果實，2天內可將胡椒果皮脫除干凈。利用本發明所述胡椒果皮脫膠菌進行胡椒果實脫皮高效、節能、低污染，具有廣泛的推廣價值。
文檔編號C12N1/20GK101892184SQ20101024177
公開日2010年11月24日 申請日期2010年8月2日 優先權日2010年8月2日
發明者萬祝寧, 何艾, 馮建成, 崔璐, 張容鵠, 竇志浩, 謝輝, 譚勇 申請人:海南省農業科學院農產品加工設計研究所