專利名稱：一種以宣木瓜細胞培養法制備化合物齊墩果酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞懸浮培養法制備生物藥物的方法，具體地說是一種利用宣木 瓜的外植體誘導愈傷組織，并進行細胞懸浮培養生產三萜類化合物一齊墩果酸的方法。
背景技術：
人類對植物次生代謝物質的利用有著悠久的歷史，次生代謝物是藥用植物重要有 效成分，但其受植物產量和次生物含量的限制，有些次生物質在自然界的含量甚微，從而局 限了植物次生代謝物質的廣泛應用；同時野生資源日益減少和栽培品種品質退化，給臨床 使用和質量控制帶來許多困擾。隨著生物技術方面的長足進步，人們把目光聚集在利用生 物技術獲取植物次生物質的研究上。為此，相關研究的科學家們經過近幾十年的探索發現， 通過植物細胞的規模培養，可以實現植物次生代謝物質“工廠化”高效生產。利用細胞培養 生產有效成分，能緩解藥用植物資源壓力，對于那些生長條件要求嚴格、生長緩慢、產量小、 采集困難、價值貴重的植物藥，用這種方法更具有重要意義。通過藥用植物的細胞培養生產次生代謝物質有以下優點(1)四季均可生產，不 受地區、季節及有害生物的影響。(2)占地面積少，可對細胞生長自動控制和代謝過程合理 調節，能夠完全在人工條件下進行，可以排除病蟲害與農藥殘留量的困擾，且能夠嚴格控制 藥材的質量，便于進行大規模工業化生產。(3)便于篩選高產細胞株。通過優化培養液、培養 條件和選擇優良細胞系的方法，可得到含量高于整株植物栽培的次生代謝產物。研究資料 顯示，有40余種化合物在培養的組織細胞中含量高于完整植物水平。如培養的人參細胞中 人參皂甙的含量是天然植物的5. 7倍；雷公藤培養細胞中雷公藤內酯的含量是原植物含量 的49倍。(4)利于生物轉化，尋找新的有效藥物成分。植物細胞內存在羥基化酶、氧化酶、 還原酶、甲基化酶、酯化酶、糖基轉移酶、糖苷酶等多種酶，植物培養物作為一種生物反應器 轉化外源化合物，能夠產生原植物所沒有的，甚至是至今自然界尚未發現的化合物。(5)個 體差異小，生產周期短，設備簡單，能節省人力、物力等。可以在人為提供的一定溫度、光照 時間、濕度、營養激素等條件下進行科學培養生產。根據需要，按不同藥用植物外植體建立 不同的培養條件，按幾何級數大量繁殖生長，從而可提供大量的優質無病毒種苗和高產細 胞株有利于自動化、規模化生產，提高生產效率。(6)利用組織培養過程中出現的芽變或人 工誘變，或進行脫毒，培育新品種，提高藥用植物品質。(7)保存種質資源。宣木瓜，又名皺皮木瓜，學名為貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai， 屬薔薇科木瓜屬，落葉闊葉灌木，為常用中藥材木瓜的基原，具有很高的藥用價值和食用價 值。中醫認為宣木瓜有舒筋、活絡、健脾開胃、舒肝止痛、祛風除濕之功效，在臨床上可用于 預防和治療風濕病、霍亂、痢疾、腸炎、腳氣病及維生素C缺乏癥等疾病。齊墩果酸是宣木瓜 的主要藥效成分之一。其是五環二萜類化合物，分子式為C3tlH48O3，是木瓜的主要藥效成分， 純品齊墩果酸為白色針狀結晶，熔點為308 310°C，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙 酮和氯仿。有關資料表明，木瓜中齊墩果酸以單體形式存在。齊墩果酸的主要生理功能有
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1抗腫瘤作用近年來，人們對OA抗腫瘤的作用機制研究主要通過以下幾方面進 行(1)齊墩果酸能抗DNA突變、抑制癌變的啟動。(2)齊墩果酸具有腫瘤逆轉作用及抗侵 襲性。(3)誘導腫瘤細胞凋亡。(4)抑制腫瘤血管形成。總之，OA的抗癌作用幾乎貫穿了 腫瘤發展的各個階段。2保肝作用齊墩果酸化學結構有雙鍵、羥基、羧基等多個活潑官能團，易發生一 些化學反應，如與體內毒性物質結合，起到解肝毒作用。齊墩果酸預處理也可防止四氯化碳 誘導的肝谷胱甘肽的排空。動物實驗還證實經預處理可將肝中金屬硫蛋白(MT)增加了近 30倍。經臨床驗證，齊墩果酸可有效治療病毒性肝炎，是抗病毒性肝炎藥的主要活性成分。3降血脂、降血糖早期文獻報道，齊墩果酸可降低實驗性糖尿病大、小鼠血糖水 平，對實驗性高血脂癥大鼠和兔均有明顯的降脂作用。4對心血管作用齊墩果酸對心血管疾病作用是其藥理作用研究的新發現。有研 究指出，齊墩果酸對實驗性高血壓大鼠無直接降壓作用，但有直接的強心作用。當鑒于其同 時具有降壓、強心及抗心律失常作用，對于高血壓合并心絞痛及心力衰竭的患者將是一個 很好選擇。目前國內外對宣木瓜齊墩果酸的作用機理和作用效果研究成果較多。在醫藥上已 經廣泛應用，在功能食品開發方面越來越受到重視。木瓜藥食兼用，已有較大規模的利用宣 木瓜果實來加工罐頭、果脯、果醬、果酒、果汁等，將其制成保健食品的種類也越來越多。宣 木瓜性味甘平微寒、無毒，適合食用，且有益健康。所以目前市場對宣木瓜及其藥用成分需 求量增長迅速，而目前的生產方式并不能滿足市場的需求。
發明內容
本發明公開了一種以宣木瓜細胞培養法制備化合物齊墩果酸的方法，所要解決的 技術問題是利用宣木瓜的外植體對愈傷組織進行誘導、擴大培養、細胞大規模的懸浮培養 最后生產齊墩果酸。本發明的技術方案如下一種以宣木瓜細胞培養法制備化合物齊墩果酸的方法，以宣木瓜莖段為起始原 料，包括宣木瓜愈傷組織的誘導、愈傷組織繼代優化培養和細胞懸浮培養以及齊墩果酸的 分離和提取，包括以下步驟(1)培養基的配制配制MS固體培養基，每升蒸餾水加入6-8g瓊脂，30-32g蔗糖，lmg2，4_D，0. 5mg KT，調節培養基pH在5. 5-6.0之間。分裝于IOOml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后進行 高壓消毒，壓力為1. 0-1. 5Kg/cm2之間，時間為20分鐘。(2)以宣木瓜莖段為材料，用75%的酒精浸泡4_6s，隨后轉移至0. 升汞溶液中 進行表面消毒6-lOmin，將莖段切成0. 8-1. 2cm小段，接種于已配制的MS固體培養基上，培 養溫度為25士 1°C，經過15 20d左右的培養，在切口處獲得較多的愈傷組織；(3)將誘導出的愈傷組織從母體分離，對其進行繼代培養，溫度25 士 1°C，通過調 節不同糖濃度、不同PH值、不同培養條件等對愈傷組織的培養進行優化，每次調控的周期 為三周左右，5次以上繼代后，獲得顏色為淺黃色的疏松的愈傷組織，此時的愈傷組織可建 立懸浮細胞體系；
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(4)細胞懸浮培養以多次繼代后所得的宣木瓜疏松愈傷組織為試驗材料，接種于MS液體培養基進 行懸浮培養，液體培養基未加瓊脂，其余和固體培養基組成相同。分裝于250ml三角瓶中， 每瓶裝液量為95-100ml，接種量為3-5g，接入培養瓶后放入恒溫的懸浮振蕩器，培養條件 為溫度25 士 1°C，搖床轉速110-120轉/分鐘，培養20-22天；通過調節不同的碳源，不同 起始PH，不同激素等對懸浮培養條件篩選優化。(5)分離提取齊墩果酸懸浮后獲得的細胞懸浮液，對其進行抽濾，收集濾紙上面的新鮮愈傷組織，置于 60°C烘箱烘干至恒定質量進行研磨。稱取愈傷粉Ig置于三角瓶中，加入95%乙醇25ml，混 合，在超聲條件下提取30min，蒸餾回收溶劑，得到的浸膏狀的物質用水和氯仿洗滌幾次，合 并洗滌液，棄水層，蒸餾氯仿，獲得齊墩果酸用無水乙醇溶解并定容至25ml。然后對其用紫 外分光光度計進行分析測定。本發明以宣木瓜莖段為原始材料，對外植體進行誘導培養，建立并篩選出適合通 過細胞培養法生產齊墩果酸的懸浮培養體系。設計了相應的生長、生產培養基配方。該方 法有培養周期短、效率高、對環境無污染等特點。本發明較已有技術相比具有如下優點(1)生產過程完全可控，不受自然環境的影響；(2)無農藥及重金屬殘留；(3)提取工藝簡單；(4)低成本，節約大量耕地，提高資源利用率和石榴經濟林的綜合經濟價值；(5)生產效率高宣木瓜細胞懸浮培養的齊墩果酸最高含量達到6. 88%，遠高于 宣木瓜成熟果實中齊墩果酸的含量。
具體實施例方式現以實驗室培養為例，非限定實施例敘述如下下面以實施例形式詳細敘述本發明的宣木瓜細胞培養生產齊墩果酸化合物的工 藝流程(不限于本實施例)1、培養基的配制配制MS固體培養基，每升加入6-8g瓊脂，30-32g蔗糖，Img2，4-D，0. 5mgKT，調節培 養基PH在5. 5-6.0之間。分裝于IOOml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后進行高壓消毒， 壓力為1. 0-1. 5Kg/cm2之間，時間為20分鐘。2、愈傷組織的誘導以宣木瓜莖段為材料，用75%的酒精浸泡4_6s，隨后轉移至0. 升汞溶液中 進行表面消毒6-lOmin，將莖段切成0. 8-1. 2cm小段，接種于MS固體培養基，培養溫度為 25 士 1°C，經過15 20d左右的培養，在切口處獲得較多的愈傷組織；3、愈傷組織繼代優化配置不同成分的培養基，將已經誘導的愈傷組織繼代于不同的培養基上，主要是 不同培養基組分，及其不同的培養條件對愈傷組織生長的影響，為得到疏松旺盛的懸浮細 胞材料對繼代的細胞不斷優化。每次優化條件溫度25士 1°C、弱光照培養20d左右。挑選
5出顏色嫩黃色，生長疏松旺盛的愈傷進行繼代培養，優化出最佳狀態的愈傷組織進行下一 步的細胞懸浮培養。4、細胞懸浮培養以多次繼代后的宣木瓜疏松愈傷組織為試驗材料，接種于MS液體培養基進行懸 浮培養，培養基的組成(1)相同，分裝于250ml三角瓶中，每瓶裝液量為95-100ml，接種量為 3_5g，接入培養瓶后放入恒溫的懸浮振蕩器，培養條件為溫度25 士 1°C，搖床轉速110-120 轉/分鐘，培養20-22天；以多次繼代后的宣木瓜疏松愈傷組織為試驗材料，接種于MS液體培養基中進行 懸浮培養，液體培養基未加瓊脂，其余和固體培養基組成相同，分裝于250ml三角瓶中，每 瓶裝液量為95-100ml，接種量為3-5g，接入培養瓶后放入恒溫的懸浮振蕩器.培養條件為 溫度25 士 1°C，搖床轉速110-120轉/分鐘，培養20天后每瓶細胞鮮重增長較大，最多的可 達19. 49g，培養物齊墩果酸含量最高的達6. 88%，高于宣木瓜總的齊墩果酸含量。優化培 養細胞，使細胞生長旺盛的同時能夠得到最大產量的齊墩果酸。4、分離提取齊墩果酸懸浮后獲得的細胞懸浮液，對其進行抽濾，收集濾紙上面的新鮮愈傷組織，置于 60°C烘箱烘干至恒定質量進行研磨。稱取愈傷粉Ig置于三角瓶中，加入95%乙醇25ml，混 合，在超聲條件下提取30min，蒸餾回收溶劑，得到的浸膏狀的物質用水和氯仿洗滌幾次，合 并洗滌液，棄水層，蒸餾氯仿，獲得齊墩果酸用無水乙醇溶解并定容至25ml，然后對其用紫 外分光光度計進行分析測定。
權利要求
1. 一種以宣木瓜細胞培養法制備化合物齊墩果酸的方法，以宣木瓜莖段為起始原料， 包括宣木瓜愈傷組織的誘導、愈傷組織繼代優化培養和細胞懸浮培養以及齊墩果酸的分離 和提取，包括以下步驟(1)培養基的配制配制MS固體培養基，每升蒸餾水加入6-8g瓊脂，30-32g蔗糖，lmg2，4-D，0. 5mg KT,調 節培養基PH在5. 5-6. 0之間，分裝于IOOml的三角瓶中，每瓶25ml左右，然后進行高壓消 毒，壓力為1.0-1.5Kg/cm2之間，時間為18-22分鐘；(2)以宣木瓜莖段為材料，用75%的酒精浸泡4-6s，隨后轉移至0.1-0. 12%升汞溶液 中進行表面消毒6-lOmin，將莖段切成0. 8-1. 2cm小段，接種于已配制的MS固體培養基上， 培養溫度為24-26°C，經過15 20d左右的培養，在切口處獲得較多的愈傷組織；(3)將誘導出的愈傷組織從母體分離，對其進行繼代培養，溫度24-26°C，通過調節不 同糖濃度、不同PH值、不同培養條件等對愈傷組織的培養進行優化，每次調控的周期為三 周左右，5-8次繼代后，獲得顏色為淺黃色的疏松的愈傷組織，此時的愈傷組織可建立懸浮 細胞體系；(4)細胞懸浮培養以多次繼代后所得的宣木瓜疏松愈傷組織為試驗材料，接種于MS液體培養基進行懸 浮培養，分裝于250ml三角瓶中，每瓶裝液量為95-100ml，接種量為3_5g，接入培養瓶后放 入恒溫的懸浮振蕩器，培養條件為溫度24-26°C，搖床轉速110-120轉/分鐘，培養20-22 天；通過調節不同的碳源，不同起始PH值，不同激素等對懸浮培養條件篩選優化；其中，所述的MS液體培養基的配制和步驟(1)所述的配制MS固體固體培養基相同，只 是不加瓊脂；(5)分離提取齊墩果酸懸浮后獲得的細胞懸浮液，對其進行抽濾，收集濾紙上面的新鮮愈傷組織，置于60°C烘 箱烘干至恒定質量進行研磨；稱取愈傷粉Ig置于三角瓶中，加入95 %乙醇25ml，混合，在超 聲條件下提取30min，蒸餾回收溶劑，得到的浸膏狀的物質用水和氯仿洗滌幾次，合并洗滌 液，棄水層，蒸餾氯仿，獲得齊墩果酸用無水乙醇溶解并定容至25ml，然后對其用紫外分光 光度計進行分析測定。
全文摘要
本發明公開了一種以宣木瓜細胞培養法制備化合物齊墩果酸的方法，首先以宣木瓜莖段為外植體接種MS固體培養基，于25±1℃條件下誘導愈傷組織，然后通過誘導出的愈傷組織的繼代，優化培養，使愈傷組織達到疏松旺盛的狀態，適合懸浮培養。再將優化后的愈傷組織接種在MS液體培養基中進行懸浮培養，再次通過優化，得到生長旺盛，次生代謝物質較高的培養條件，經分離提純得到齊墩果酸。培養物中齊墩果酸含量達6.88％，高于宣木瓜成熟果實中的含量。本發明方法具有培養周期短、效率高、對環境無污染等特點。
文檔編號C12N5/04GK102002086SQ20101028514
公開日2011年4月6日 申請日期2010年9月15日 優先權日2010年9月15日
發明者丁之恩, 丁昱, 付廣俊, 楊松, 王敏麗, 程江華 申請人:安徽農業大學