專利名稱：一種從昆蟲觸角中分離鑒定OBPs基因的方法
技術領域：
本發明涉及利用昆蟲的嗅覺系統來進行害蟲生物防治的技術領域；進一步，本發明涉及利用SMART技術構建觸角cDNA文庫以及結合生物信息學方法分離鑒定昆蟲氣味結合蛋白OBI^s的方法。
背景技術：
盲蝽蟓隸屬于半翅目盲蝽科，是我國棉花生產上的一類重要害蟲。1997年，我國開始商業化種植Bt棉花，到2007年Bt棉花的種植面積達到了 380萬公頃，占全國棉花總種植面積的69%。種植Bt棉花有效的控制了棉鈴蟲等主要鱗翅目害蟲的危害，使化學農藥使用量因此大幅度減少，隨之，棉田害蟲地位發生了一系列演替，盲蝽蟓種群數量劇增，危害加強，并且呈嚴重災變趨勢發生(Lu YH,Qiu F, Feng HQ，et al. Species composition and seasonal abundance ofpestiferous plant bugs(Hemiptera :Miridae)on Bt Cotton in china. CropProtection,2008,27 :465-472)。據各地植保部門反映，近年來很多地方盲蝽蟓為害導致的棉花產量損失約為20% -30%，嚴重地區高達50%左右。棉田盲蝽蟓的嚴重發生還波及了棗、桃、蘋果、櫻桃、葡萄、茶樹等農作物，已經成為影響多種農作物生產的重大問題。由于Bt棉抗盲蝽蟓效果較差，因此現在防治盲蝽蟓主要靠化學農藥，這不僅容易導致棉鈴蟲等鱗翅目害蟲抗藥性的產生，而且對環境造成了巨大的破壞和污染，因此，有必要發展經濟有效的、環境友好的防治方法。嗅覺對于許多昆蟲的生存和繁衍至關重要。昆蟲在長期的進化過程中，發展演變了發達的觸角系統(Field LM, Pickett JA and WadhamsLJ. Molecular studies in insect olfaction. Insect Mol. Biol. ,2000,9(6) :545-551)。昆蟲的觸角系統是一個高度專一和靈敏的化學檢測器，可以特異性識別環境中的化學氣味分子，并依次覓食、尋偶、 選擇產卵的信息。而昆蟲氣味結合蛋白與脂溶性的氣味物質發生作用，是昆蟲專一性識別外界氣味物質的第一步生化反應(Vogt RG and RiddifordLM. Pheromone Binding and inactivation by moth antennae. Nature, 1981, 293 :161-163)。昆蟲氣味結合蛋白(Odorant binding proteins, OBPs)是一類低分子量 (16KDa左右)、等電點偏酸性(為4. 0-5.0)、球狀的水溶性蛋白，在昆蟲識別外界氣味物質中起著重要的作用，其主要存在于昆蟲嗅覺感器淋巴液中。其作用是結合并運輸脂溶性的氣味分子通過水溶性的淋巴液到達嗅覺神經樹突末梢(Pelosi P and Maida R. Odorant-bindingproteins in insects. Comp. Biochem.Physiol. ,1995,111 (3) 503-514)。因此，深入研究OBI^s不僅具有重要的理論意義，而且在實踐中可以為害蟲檢測防治和益蟲利用提供新途徑、新方法，為研制開發無污染、不殺傷天敵、與環境相容性較好的高效引誘劑提供理論依據。也有利于闡明昆蟲的嗅覺識別機制，同時對于研究脊椎動物的嗅覺識別機制也具有重要的啟示意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種昆蟲氣味結合蛋白基因的分離鑒定方法，利用此方法可以有效分離出OBI^s基因，所發現的OBI^s基因可以為害蟲檢測防治和益蟲利用提供新途徑、 新方法，為研制開發無污染、不殺傷天敵、與環境相容性較好的高效引誘劑提供理論依據。為達到上述目的，本發明的技術方案提供一種從昆蟲觸角中分離鑒定氣味結合蛋白基因的方法，包括步驟(1)利用SMART技術獲得觸角全長cNDA序列；(2) Sfi 酶雙酶切所述 ds cDNA ；(3)利用凝膠層析柱對酶切產物按片段大小進行分離，收集片段長度最長的ds cDNA ； (4)步驟(3)的ds cDNA和pDNR-LIB載體連接，得重組質粒；(5)所述重組質粒轉化ElectroMAX DH5 α -E感受態細胞，得到未擴增的初始化 cDNA文庫；(6)采用生物信息學的方法從cDNA文庫中鑒別氣味結合蛋白基因。根據本發明的一個優選實施方案，本發明的方法的具體技術方案包括以下步驟(1)觸角RNA的提取、反轉錄合成第一鏈cDNA及LD-PCR合成ds cDNA 取200對觸角在液氮中研磨，利用Trizol提取RNA，電泳檢測RNA的質量，分光光度計測定RNA的濃度。利用SMART技術和LD-PCR方法反轉錄合成第一鏈cDNA和ds cDNA。 1.5%瓊脂糖電泳檢測LD-PCR產物條帶大小分布。同時為了抑制DNA聚合酶的活性，利用蛋白酶K消化LD-PCR產物。(2) Sfi I 酶切 ds cDNA 及 CHROMA SPIN-400 柱子分離 dsCDNA 上述蛋白酶K消化好的ds cDNA 5’端和3’端含有Sfi I內切酶的酶切位點，為了便于ds cDNA和pDNR-LIB載體的連接，用Sfi I內切酶對ds cDNA進行酶切。酶切完之后，再利用CHROMA SPIN-400柱子按ds⑶NA的大小進行分離，1. 5%電泳檢測分離產物，收集片段長度最長的ds cDNA。(3) ds cDNA和pDNR-LIB載體的連接及重組質粒電轉化DH5 α大腸桿菌細胞為了得到最佳的連接效果，需要對ds cDNA和pDNR-LIB的連接比例進行優化，ds cDNA和pDNR-LIB載體的連接比例分別為1 2，1 1和3 2，分別電轉化DH5a大腸桿菌細胞，轉化完成后，根據得到的單克隆數量確定最佳的連接比例是ds cDNA =PDNR-LIB載體=1 2，然后按照最佳的連接比例再進行重組質粒轉化DH5a大腸桿菌細胞，最終得到未擴增的初始化cDNA文庫。 (4)初始化cDNA文庫滴度的測定在將原始cDNA文庫冷凍或者擴增之前，應當檢測原始cDNA文庫的滴度。一個好的有代表性的文庫其滴度應當是獨立克隆子數目的10倍以上。通常情況下，為了便于長期保存，質粒文庫的滴度應該至少在Kfpfu/ml。本文庫測定滴度的方法如下分別取0. 5μ 1，0. 25μ 1，0. 05μ 1，0. 025μ 1，0. 005μ 1 原始文庫涂于 200μ 1 LB 平板中，混勻，37 °C共培養1 Oh左右，待出現單克隆，計數。(5)菌液PCR檢測插入片段的大小和重組率利用菌液PCR隨機檢測1000個單克隆插入片段的大小，并計算重組率。菌液PCR引物序列如下M13-Forward primer(5‘ _3，) TGTAAAACGACGGCCAGTM13-Reverse primer(5‘ _3， ) :AACAGCTATGACCATG從電泳圖譜可以看出，插入片段均> 500bp，平均大小在800bp以上，重組率> 98%，說明所構建的cDNA文庫質量較高，能夠進行下一步分析。(6)利用生物信息學方法從cDNA文庫中鑒別氣味結合蛋白OBI5s基因利用M13引物對從文庫中挑選的單克隆進行測序，為了得到基因的全長，測序方向為5’端測序。對通過測序得到的EST序列進行生物學分析如下 PHRED程序評估EST序列的質量，用Q20程序剔除EST序列兩端的低質量堿基。用 PHRAP軟件包中的Cross Match程序剔除EST序列中的載體序列和弓I物序列。然后得到的高質量的EST序列用CAP3軟件進行聚類分析，聚類分析結果得到Unigenes，僅含有一個EST 的Unigenes稱之為Singletons，含有兩個以上的Unigenes稱之為contigs。本發明中共得到四15個EST序列，共計產生了 1423個Unigenes，其中包含1208個Singletons,占所有Unigenes的84. 9%。根據OBI3s蛋白氨基酸序列中都含有6個保守的半胱氨酸的特征， 設計程序從1423個Unigenes中鑒定氣味結合蛋白基因，同時結合BLASTX和BLASTN比對結果對鑒定結果進行人工確認。氣味結合蛋白OBI^s基因的鑒別程序如下其中“Classical OBPs"的鑒別程序為Cl-X20_66-C2-X3-C3-X21_43-C4-X8_14-C5-X8-C6 ；Cl-X15_39-C2-X3-C3-X21_44-C4-X7_12-C5-X8-C6 ；"Plus-C OBI^s” 的鑒別程序為Cl-X20_41-C2-X3-C3-X41_46-C4-X19_29-C4a-X9-C5-X8-C6-P-X9_10-C6a-X9_10 ；α-Α-Μ-ΟΖ-Α-ΟΒ- ^-^-ΟΑ-Χ^^ΟΑΒ-Χ^Οδ-Χ τΟΘ-Ρ-Χρη-ΟθΒ。最終從苜蓿盲蝽觸角cDNA文庫中得到14個OBI3s基因，所有的OBI3s基因都為全長，包含有完整的開放閱讀框。其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 14其中一項所示。編碼的氣味結合蛋白的一級結構的氨基酸序列如SEQ ID N0. 15 SEQ ID N0.觀其中一項所示。本發明的方法利用SMART技術構建觸角cDNA文庫，同時結合生物信息學方法從觸角文庫中鑒定昆蟲氣味結合蛋白基因，與通過RACE設計兼并引物擴增得到基因全長的方法相比，本發明方法具有成本低、時間快、易操作的優點，更為重要的是，利用本發明方法可以同時鑒定多個氣味結合蛋白基因，大大提高了鑒定氣味結合蛋白的效率。同時也為從其他昆蟲種類中鑒定氣味結合蛋白基因提供了一條更為簡便有效的方法。通過對鑒別的氣味結合蛋白進行生化特征、蛋白結構、生物功能方面的研究，無疑會有助于闡明昆蟲嗅覺的識別機制，同時為利用昆蟲的嗅覺來進行害蟲的生物防治提供理論上的依據。
圖1為苜蓿盲蝽觸角RNA電泳圖；
圖2為SMART技術的原理； 圖3為LD-PCR產物電泳圖，其中1代表LD-PCR的產物；2代表DNA Marker 2000， 自下向上依次為 100bp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp ；
圖4為CHROMA SPIN-400柱子對ds cDNA按大小進行片段的分離電泳圖，其中M代表 Wide Range DNA Marker，自下向上依次為 IOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 1500bp, 2000bp，2500bp，3000bp，4000bp，6000bp，泳道 1-16 為按片段大小分離的 ds cDNA ；圖5為原始文庫滴度的測定；圖6為菌液PCR鑒定文庫重組率和插入片段的大小，其中M代表DNA Marker 2000，自下向上依次為 100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，泳道 1_12 代表隨機挑選的單克隆；圖7為鑒定的12個“Classical OBI^s”序列比對圖，陰影標記的為6個保守的半
胱氨酸；圖8為鑒定的兩個“Plus-C OBI^s”和其他昆蟲的“Plus-C OBI^s”序列比對圖，陰
影標記的為6個保守的半胱氨酸和脯氨酸。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。需特別指出的是，盡管在實施例中詳盡描述了在苜蓿盲蝽中鑒定氣味結合蛋白的方法，然而這并不意味本發明的方法只限于苜蓿盲蝽這一種昆蟲，因此，使用本發明所描述的方法來鑒定其他昆蟲種類中的氣味結合蛋白基因，均包括在本發明所要求的權利范圍之內。實施例1 觸角RNA的提取、反轉錄合成第一鏈cDNA及LD-PCR合成ds cDNA取剛羽化的苜蓿盲蝽觸角200對，利用Trizol法進行RNA的提取，電泳檢測RNA質量(見圖1)，同時分光光度計測定RNA的濃度為618. 8ng/ μ 1。利用SMART技術和LD-PCR 方法合成第一鏈cDNA和ds cDNA。最后1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測LD-PCR產物的分布。 SMART的原理如圖2。LD-PCR產物的電泳圖如圖3。分析結果表明LD-PCR產物的大小從 200bp-2000bp，分布范圍比較廣泛，說明產物包括了不同基因的mRNA，其中有幾條比較亮的條帶，代表了在觸角中表達量比較高的基因。實施例2 :Sfi I 酶切 ds cDNA 及 CHROMA SPIN-400 柱子分離 ds CDNA為了將LD-PCR擴增得到的ds cDNA和pDNR-LIB載體(商購)連接，用Sf i I內切酶對ds cDNA進行酶切，同時用CHR0MASPIN-400柱子對ds cDNA按大小進行片段的分離， 分別裝在16個無菌離心管中，每管一滴。最后1.5%瓊脂糖電泳檢測得到的ds cDNA片段的大小分布，如圖4，最后根據電泳結果取其中的7，8，9，10四管中的ds cDNA和pDNR-LIB 載體進行連接。實施例3 重組質粒電轉化DH5 α大腸桿菌細胞為了得到較高的轉化效率，采用電轉化。電轉化儀為Bio-Rad公司產品，電擊參數設置為2000ν，200Ω。電擊時間為2-3秒。實施例4 初始化cDNA文庫滴度的測定為了評估所建cDNA文庫的質量，需要對文庫進行滴度測定。方法如下分別取 0. 5μ 1,0. 25 μ 1,0. 05 μ 1,0. 025 μ 1,0. 005 μ 1 原始文庫涂于 200 μ 1 LB 平板中，混勻， 37°C共培養IOh左右，待出現單克隆，如圖5，計數。
結果為0. 5 μ 1 οο0. 25μ 1 1707 4. 8 X 106plaques/Library0. 05μ 1 2954. 1X 106plaques/Library0. 025 μ 1 1825. O X 106plaques/Library0. 005 μ 1 476. 6 X 106plaques/Library> 2. OOX 106plaques/Library 平均為5. 1 X 106plaques/Library以上結果表明所建文庫質量較高，比較有代表性。原始cDNA文庫不穩定，并且低豐度cDNA的數量極少，因此對初建成的原始cDNA文庫要立即進行擴增，以便長久保存。實施例5 菌液PCR檢測插入片段的大小和重組率為了檢測文庫中單克隆插入片段的大小和文庫重組率，利用菌液PCR隨機檢測 1000個單克隆插入片段的大小。菌液PCR引物序列如下M13-Forward primer (5‘ -3，) TGTAAAACGACGGCCAGT (如 SEQ ID NO. 29 所示)；M13-Reverse primer (5‘ -3，) :AACAGCTATGACCATG (如 SEQ IDN0. 30 所示)；1. 5%瓊脂糖電泳檢測PCR產物，如圖6。結果表明，插入片段都在500bp以上，重組率為98%，表明所建文庫質量較高，可以進行下一步分析。實施例6 利用生物信息學方法從cDNA文庫中鑒別氣味結合蛋白OBI5s基因利用M13引物對從文庫中挑選的單克隆進行測序，為了得到基因的全長，測序方向為5’端測序。共計得到EST序列四15個，通過對這些EST序列進行載體序列的剔除，聚類分析，最終得到1423個Unigenes。根據OBI^s蛋白氨基酸序列中都含有6個保守的半胱氨酸的特征，設計程序從1423個Unigenes中鑒定氣味結合蛋白基因，同時結合BLASTX和 BLASTN比對結果對鑒定結果進行人工確認。氣味結合蛋白OBI^s基因的鑒別程序如下其中“Classical OBPs"的鑒別程序為Cl-X20_66-C2-X3-C3-X21_43-C4-X8_14-C5-X8-C6 ；Cl-X15_39-C2-X3-C3-X21_44-C4-X7_12-C5-X8-C6."Plus-C OBI^s” 的鑒別程序為Cl-X20_41-C2-X3-C3-X41_46-C4-X19_29-C4a-X9-C5-X8-C6-P-X9_10-C6a-X9_10 ；α-Α-Μ-ΟΖ-Α-ΟΒ- ^-^-ΟΑ-Χ^^ΟΑΒ-Χ^Οδ-Χ τΟΘ-Ρ-Χρη-ΟθΒ。最終從苜蓿盲蝽觸角cDNA文庫中得到14個OBI3s基因，所有的OBI3s基因都為全長，包含有完整的開放閱讀框。所有的這14個OBI^s基因的氨基酸的同源性比較見表1。表1 14個OBf3S的氨基酸同源性比較
權利要求
1.一種從昆蟲觸角中分離鑒定氣味結合蛋白基因的方法，其特征在于，包括步驟(1)利用SMART技術獲得觸角全長CNDA序列；(2)Sfi酶雙酶切所述ds cDNA ；(3)利用凝膠層析柱對酶切產物按片段大小進行分離，收集片段長度最長的dscDNA ；(4)步驟(3)的dscDNA和pDNR-LIB載體連接，得重組質粒；(5)所述重組質粒轉化ElectroMAXDH5 α -E感受態細胞，得到未擴增的初始化cDNA文庫；(6)采用生物信息學的方法從cDNA文庫中鑒別氣味結合蛋白基因。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中采用生物信息學的方法鑒別氣味結合蛋白基因時，其中“Classical OBI^s”的鑒別程序為Cl-Ao-66_C2-X3-C3_X21—43-C4_X8—14-C5_X8-C6 ；Cl_Xi5-39_C2_X3_C3_X2i-44_C4_X7-i2_C5_Xg_C6 ；"Plus-c OBPs"的鑒別程序為Cl-X2o-4i—C2—X3-C3—X41-46—C4—Χ19_29_ -C4a-X9-C5-X8-C6-P-X9_10-C6a-X9_10 ； Cl-X8-4i—C2—X3-C3—X3g_47—C4—X17_2g"—n-C6a。
全文摘要
本發明公開了一種利用SMART技術構建觸角cDNA文庫和生物信息學方法從苜蓿盲蝽觸角中有效分離鑒定氣味結合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)基因的方法，利用此方法篩選出了14條苜蓿盲蝽氣味結合蛋白基因的核苷酸序列。鑒于氣味結合蛋白在昆蟲嗅覺識別中的重要作用，本發明所涉及的這些基因可以在昆蟲的生物防治中發揮重要的作用。
文檔編號C12Q1/68GK102399773SQ20101028547
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月16日 優先權日2010年9月16日
發明者吳孔明, 張永軍, 張雪瑩, 谷少華, 郭予元 申請人:中國農業科學院植物保護研究所