一種快速檢測dna甲基化的試劑盒及方法

專利名稱：一種快速檢測dna甲基化的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學檢測技術領域，具體是一種快速檢測DNA甲基化的試劑盒及 方法。
背景技術：
DNA甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分，是在DNA甲基化轉移酶 (DNMTs)的作用下使CpG 二核苷酸5’端的胞嘧啶轉變為5’甲基胞嘧啶。哺乳動物中，CpG 序列在基因組中出現的頻率僅有1 %，但在基因組的某些區域中，通常位于基因的啟動子區 或是第一個外顯子區，CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的 富集區，形成所謂的CpG島。DNA甲基化在人的正常發育、X染色體失活、衰老以及許多人類 疾病(如發育畸形、癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經心理失調等)發生過程中發揮重要作 用。甲基化的研究熱點之一是甲基化與腫瘤的關系。甲基化狀態的改變是引起腫瘤 的一個重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異 常升高，從而導致基因組的不穩定(如染色體的不穩定、可移動遺傳因子的激活、原癌基因 的表達)和抑癌基因的不表達。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因為人 們發現腫瘤的發生可能與抑癌基因啟動子區的CpG島甲基化造成抑癌基因關閉有關。由 于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發生 的早期預測。如Uhlmarm等發現不同病理類型及不同惡性程度的神經膠質瘤細胞的7種 腫瘤標志基因存在著不同程度的甲基化[Uhlmann K, Rohde K, Zeller C, etal. Distinct methylationprofiles of glioma subtypes. [J]Int Cancer,2003, Aug. 10,106 (1) 52-59]，因此，甲基化的研究，為腫瘤的早期預測、分類、分級及預后評估提供了新的依據。基因甲基化檢測主要分為基因組整體水平的甲基化檢測、基因特異位點甲基化 的檢測，兩種水平檢測方法有多種，絕大多數方法檢測原理都要通過重亞硫酸氫鹽對DNA 樣品的修飾，使未甲基化修飾的胞嘧啶發生脫氨基反應，變為磺化尿嘧啶，最后在氫氧化鈉 的作用下轉變為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不發生脫氨基反應，胞嘧啶保持不變。通過PCR或 其它方法就能對甲基化與非甲基化的CpG島進行檢測加以區別。重亞硫酸氫鹽的修飾效果和效率直接影響到甲基化檢測的準確性和效率，傳統的 重亞硫酸氫鹽對DNA樣品的修飾過程包括1. DNA提取按常規方法，酚氯仿法(詳見莎姆布魯克著，分子克隆實驗指南)需 要1 2天時間，或試劑盒法(見本公司產品，植物SK1203、SK1207、SK1209 ；動物:SK1205 ； 血液:SK1260 ；通用:SK1251)，需要2 5小時。2.重亞硫酸氫鹽修飾(1)將約2ug DNA于1. 5ml EP管中使用DDW稀釋至50ul ；(2)加 5. 5ul 新鮮配制的 3M NaOH, 42°C水浴 30min ；(3)加30ul IOmM對苯二酚(氫醌)至上述水浴后混合液中；
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(4)加520ul 3. 6M亞硫酸氫鈉PH 5. 0，至上述水浴后溶液中，EP管外裹以鋁箔紙， 避光，輕柔顛倒混勻溶液；(5)加200ul石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化。50°C避光水浴16 18h ；(6)將上述DNA修飾混合在4°C下用DDW透析過夜法純化或使用PromegaWizard Cleanup DNA純化回收系統(Promega，A7280)純化(約還需操作5步，用時1小時以上)；(7)加IOM的氫氧化鈉至透析純化產物，使其終濃度為0. 3M室溫放置20分鐘，再 加入等當量的IM的HCl和NaOH，使磺化尿嘧啶轉變為尿嘧啶。(8)加入1/4體積的IOM乙酸銨和2倍的無水乙醇_20°C沉淀過夜。(9) 12000rpm離心5分鐘，去上清，75%的乙醇洗滌2次，干燥20分鐘，加20ul DDff 或TE就得到需要的重亞硫酸氫鹽修飾過的DNA模板。這種傳統的DNA修飾方法主要存在幾個方面的不足(I)DNA需要量在1 2ug，在臨床診斷中需要較大量的待測人血液或組織，給待測 人帶來不必要的痛苦。(2)操作繁鎖，必須先提取DNA，再進行DNA修飾，特別是在亞硫酸氫鹽修飾過程需 要16 18h ；純化和脫磺基步驟也很長時間，嚴重影響了工作效率，并且，容易造成污染。(3) 50°C低溫修飾16 18h，并不能充分地進行修飾，因為此溫度下，DNA超螺旋結 構不可能打開，造成修飾不完成，實驗的重復性不高。(4)目前，市場上有各類的甲基化檢測試劑盒，如美國GENMED SCIENTIFICSINC 生產的試劑盒有14種溶液，操作步驟多達30多步，相當繁瑣；Zymo公司生產的EZ DNA Methylation-Gold Kit雖然操作簡便，但價格昂貴，并且每次處理的DNA量只夠做2 3次 PCR。

發明內容
本發明公開了一種快速檢測DNA甲基化的試劑盒及方法，具有靈敏度更高，處理 更快捷的特點。本發明實行DNA提取和DNA修飾同步完成，省略了 DNA提取和DNA修飾過程中的 多步分離、純化步驟，整個過程在2個小時內完成。本發明與傳統方法相比做了以下四個方面的改進1. DNA提取和DNA修飾同步完 成；2.修飾液中添加硫化促進劑MBT和異硫氰酸胍，快速完成DNA提取和修飾過程；3.修飾 反應采用短時間高溫處理方法，使DNA呈解鏈狀態，以充分暴露堿基，將未甲基化修飾的胞 嘧啶轉化為磺化尿嘧啶；4.對修飾后繁瑣的透析脫鹽步驟進行簡化處理將修飾處理后的 產物轉到核酸純化柱中，再用清理液(去磺化)處理后洗脫，得到檢測基因的甲基化PCR的 DNA模板。本發明首先提供了一種檢測DNA甲基化的試劑盒，包括修飾液、清理液和洗滌液。所述修飾液包括如下組分亞硫酸氫鈉4-6M，亞硫酸氫銨3-7M，氫醌3_7mM，硫化 促進劑l_5mM，異硫氰酸胍2. 5-5. 5M和緩沖液。較佳的，所述硫化促進劑為MBT(2_硫醇基苯駢噻唑)，所述緩沖液為pH5-6的 40-60mM Tris-HCl。所述清理液包括如下組分乙醇30-50 % (體積百分比濃度)、氫氧化鈉300-500mM 和氯化鈉 200_400mM。所述洗滌液包括如下組分pH 6. 8的5_15mM Tris,乙醇65-85% (體積百分比濃 度)。所述修飾液、清理液和洗滌液的溶劑均為水。本發明的檢測DNA甲基化的試劑盒可用于從樣本細胞中提取DNA，并將未甲基化 修飾的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化修飾的胞嘧啶保持不變。利用本發明檢測DNA甲基化的試劑盒同步完成DNA提取和亞硫酸氫鹽修飾，回收 產物可用作為測序法或甲基化特異性的PCR法的PCR模板。本發明還提供了一種檢測DNA甲基化的方法，包括下列步驟1.將適當數量的樣本細胞與前述修飾液混合完成細胞裂解后高溫處理；2.將修飾液處理的產物轉到核酸純化柱中；3.先用清理液去磺化處理，再用前述洗滌液洗滌核酸純化柱后洗脫，收集洗脫 液；4.以洗脫液中的DNA為模板，采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法(bisulfite-PCR， BSP)或甲基化特異性的PCR法(Methylation-Specific PCR, MSP)檢測DNA甲基化。所述核酸純化柱優選UNIQ-10核酸純化柱(SD5005)。所述洗脫液選自雙蒸水或TE。所述步驟1修飾反應過程采用短時間高溫處理方法，使DNA呈解鏈狀態，以充分暴 露堿基，將未甲基化修飾的胞嘧啶轉化為磺化尿嘧啶。步驟3將磺化尿嘧啶去磺化轉變為 尿嘧啶。所述步驟1中的高溫處理方法為98"C 20 秒一90°C 20 分鐘一70°C 5 分鐘一4°C保溫。所述步驟4可使用10次以上。所述的亞硫酸氫鹽修飾后測序法和甲基化特異性的PCR法是用于甲基化檢測最 為廣泛的方法。BSP法是以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板在待測CpG島兩端設計引物，通 過PCR擴出目的序列，直接測序或克隆測序，克隆測序可用于定量檢測；MSP法也是以亞硫 酸氫鹽修飾后的DNA為模板做PCR，但引物設計位置不一樣，在待測CpG島甲基化區域設計 兩對引物，分別是甲基化特異性的(primer I)和非甲基化的引物(primerll)。如果甲基化 引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化，若用針非甲基化DNA鏈的引物擴 增出片段，則說明被檢測的位點不存在甲基化，MSP法用于定性檢測，對于單個位點的甲基 化區域容易出現假陽性。具體的，所述檢測DNA甲基化的方法可包括下列步驟(1)收集的細胞IO3 IO5個直接加入修飾液按前述高溫處理方法處理；(2)將修飾液處理的產物轉到UNIQ-10核酸純化柱，離心，棄收集管廢液。(3)加清理液到UNIQ柱中，室溫靜置lOmin，離心，棄收集管廢液。(4)加入洗滌液UNIQ柱中，離心，棄收集管廢液。重復洗滌一次(5)加入雙蒸水或TE，離心收集洗脫液。本發明的基因甲基化檢測試劑盒及方法價廉、高效、快速、高重復性，相比傳統方 法的不足，做了多方面的改進
1、試劑盒組成更加簡單，只有3種配制的溶液2、試劑盒操作更加簡便，實行DNA提取和修飾同步進行，節省DNA提取的耗時耗 材，同時，減少操作步驟，可以極大程度地避免交叉污染。本試劑盒修飾液既是DNA修飾液， 也是細胞裂解和DNA提取液。修飾液中添加了 4M異硫氰酸胍，起到溶解蛋白、裂解細胞作 用，并促進修飾的DNA與UNIQ柱中硅膠膜結合。3、操作方案采用高溫物理變性來取代以傳統方案中使用氫氧化鈉的化學變性，在 高溫條件下，DNA呈解鏈狀態，以充分暴露堿基，并采用高濃度亞硫酸氫鹽取代低濃度的亞 硫酸氫鹽將未甲基化修飾的胞嘧啶充分轉化為磺化尿嘧啶。4、為使DNA修飾在短時間內更加充分，在修飾液中添加硫化促進劑MBT，化學名稱 2-硫醇基苯駢噻唑劑(2-Mercaptobenzothiazole)，分子式C7H5NS2,可促進DNA的快速修飾轉化。5、針對DNA修飾后繁瑣的純化和去磺化步驟，采用UNIQ-10柱，直接在UNIQ柱中 完成脫鹽和去磺化，節省大量時間，同時減少因操作步驟過多而導致修飾過的DNA回收的 損失，提高回收率。本發明方法成本低廉、大大節省DNA提取和脫鹽時間、重復性好，可直接用于檢測 血細胞、口腔上皮細胞及各種組織細胞基因的甲基化水平，在早臨床診斷等生物醫學檢測 技術方面具有重要的使用價值。


圖1 :PCR產物凝膠電泳圖條帶從左到右依次為Marker，H0XC9, CRABPl 和 IGFBP7圖2 實施例5PCR產物凝膠電泳圖條帶從左到右依次為Marker，IGFBP7圖3 實施例2測序比對4 實施例3測序比對5 實施例4、實施例5測序比對圖
具體實施例方式下面結合BSP法實例來充分說明本發明試劑盒修飾效果和詳細的操作過程。實施例1試劑盒的制備三種溶液按常規方法配制。配方1如下(1)修飾液5M亞硫酸氫鈉，5M亞硫酸氫銨，5mM氫醌，2mM MBT (2-硫醇基苯駢噻 唑)，4M 異硫氰酸胍，50mM Tris-HCl pH 5. 5 ；(2)清理液35%乙醇，400mM氫氧化鈉，200mM氯化鈉；(3)洗滌液10mM Tris pH 6. 8，80% 乙醇。三種溶液的溶劑均為水。將修飾液、清理液和洗滌液分裝后裝配試劑盒。配方2如下
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(1)修飾液4M亞硫酸氫鈉，3M亞硫酸氫銨，7mM氫醌，5mM MBT (2-硫醇基苯駢噻 唑)，2. 6M 異硫氰酸胍，40mM Tris-HCl pH 6. 0 ；(2)清理液30%乙醇，500mM氫氧化鈉，200mM氯化鈉；(3)洗滌液5mM Tris ρΗ 6·8，85% 乙醇。三種溶液的溶劑均為水。將修飾液、清理液和洗滌液分裝后裝配試劑盒。配方3如下(1)修飾液6Μ亞硫酸氫鈉，7Μ亞硫酸氫銨，3mM氫醌，ImM MBT (2-硫醇基苯駢噻 唑)，5. 5M 異硫氰酸胍，60mM Tris-HCl pH 5. 0 ；(2)清理液50%乙醇，300mM氫氧化鈉，400mM氯化鈉；(3)洗滌液15mM Tris ρΗ 6·8，65% 乙醇。三種溶液的溶劑均為水。將修飾液、清理液和洗滌液分裝后裝配試劑盒。實施例2 檢測口腔上皮細胞H0XC9基因啟動子區1、采樣采樣前，先用清水簌口，然后一手持消毒的醫用棉簽，伸進口腔，從口腔 內側頰粘膜處反復擦拭5分鐘左右，取出棉簽，把棉簽放入盛有Iml TE的EP管中清洗， 12000rpm離心3分鐘，去上清，收集口腔上皮細胞。2、細胞裂解取500ul的實施例1配方1的修飾液放入1. 5ml的EP管中，將少于 或等于20ul的收集的口腔上皮細胞加入盛有修飾液EP管中，顛倒混勻、輕微震蕩30秒，細 胞裂解變澄清。3、修飾將上述修飾液體平均分成4份分裝到4個PCR管中，在PCR儀中高溫修飾 處理98°C 20秒一90 0C 20分鐘一70 °C 5分鐘一4°C保溫。4、上柱將修飾液處理的產物轉到UNIQ-10核酸純化柱，室溫靜置1分鐘，8000rpm 離心2分鐘，棄收集管廢液。5、脫磺化加入實施例1配方1的清理液500ul甩動數次，使清理完全浸入UNIQ 柱的硅膠膜中，室溫放置15 20分鐘，SOOOrpm離心2分鐘，棄收集管廢液。6、純化加入實施例1配方1的洗滌液500ul于UNIQ柱中，12000rpm離心2分鐘， 棄收集管廢液。重復洗滌一次。55°C烘箱放置10分鐘，加30ul DDW或TE，12000rpm離心 2分鐘，得到重亞硫酸氫鹽修飾過的DNA模板。7、PCR:(1)引物設計上游引物5，TGGAGGGGTATGAGGAGTTTAG3，(SEQ ID NO 1)下游引物5，CCTTTAACTATAAAACCCCCATAAC3，(SEQ ID NO 2)PCR 產物大小316bp(2) 50 μ 1體系的配制
權利要求
一種檢測DNA甲基化的試劑盒，包括修飾液、清理液和洗滌液。
2.如權利要求1所述檢測DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，所述修飾液包括如下 組分亞硫酸氫鈉4-6M，亞硫酸氫銨3-7M，氫醌3-7mM，硫化促進劑l_5mM，異硫氰酸胍 2. 5-5. 5M和緩沖液。
3.如權利要求2所述檢測DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，所述硫化促進劑為MBT， 所述緩沖液為PH 5-6的40-60mM Tris-HCl。
4.如權利要求1所述檢測DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，所述清理液包括如下組 分乙醇30-50%、氫氧化鈉300-500mM和氯化鈉200_400mM。
5.如權利要求1所述檢測DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液包括如下組 分pH 6. 8 的 5-15mM Tris,乙醇 65-85%。
6.如權利要求1-5任一權利要求所述檢測DNA甲基化的試劑盒用于從樣本細胞中提取 DNA,作為亞硫酸氫鹽修飾后測序法或甲基化特異性的PCR法的PCR模板的用途。
7.一種采用權利要求1-6任一權利要求所述試劑盒檢測DNA甲基化的方法，包括下列 步驟1)將適當數量的樣本細胞與修飾液混合完成細胞裂解后高溫處理；2)將修飾液處理的產物轉到核酸純化柱中；3)先用清理液去磺化處理，再用洗滌液洗滌核酸純化柱后洗脫，收集洗脫液；4)以洗脫液中的DNA為模板，采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法或甲基化特異性的PCR法 檢測DNA甲基化。
8.如權利要求7所述試劑盒檢測DNA甲基化的方法，其特征在于，所述核酸純化柱為 UNIQ-10核酸純化柱。
9.如權利要求7所述試劑盒檢測DNA甲基化的方法，其特征在于，所述洗脫液選自雙蒸 水或TE。
10.如權利要求7所述試劑盒檢測DNA甲基化的方法，其特征在于，所述步驟1)中的高 溫處理方法為98°C 20秒一900C 20分鐘一70°C 5分鐘一4°C保溫。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測DNA甲基化的試劑盒及方法。本發明與傳統方法相比做了以下四個方面的改進1.DNA提取和DNA修飾同步完成；2.修飾液中添加硫化促進劑MBT和異硫氰酸胍，快速完成DNA提取和修飾過程；3.修飾反應采用短時間高溫處理方法，使DNA呈解鏈狀態，以充分暴露堿基，將未甲基化修飾的胞嘧啶轉化為磺化尿嘧啶；4.對修飾后繁瑣的透析脫鹽步驟進行簡化處理將修飾處理后的產物轉到核酸純化柱中，再用清理液處理后洗脫，得到檢測基因的甲基化PCR的DNA模板。本發明方法成本低廉、省時、重復性好，可直接用于檢測各種組織細胞基因的甲基化水平，在早臨床診斷等生物醫學檢測技術方面具有重要的使用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101984069SQ20101028664
公開日2011年3月9日 申請日期2010年9月19日 優先權日2010年9月19日
發明者吳俊生, 張玉武, 李瑞峰 申請人:生工生物工程(上海)有限公司