專利名稱：一種結核分枝桿菌快速變色藥敏培養基的制備方法
技術領域：
本發明涉及結核病的防控技術領域，具體涉及一種桿菌快速變色藥敏培養基的制 備方法。
背景技術：
以Bactec TB 460為代表的第一代分枝桿菌快速培養、藥敏檢測系統，對結核病 的快速診斷起到了重要作用。Bactec TB 460可顯著縮短培養時間和藥敏試驗時間，同時 提高陽性檢出率，操作簡便、自動化強，還可進行快速菌型鑒定[3]。但存在液體培養基中 污染率高，儀器與試劑價格較貴、有放射性污染，難以全面推廣應用等問題[4]。以Bactec MGIT 960為代表的第二代分枝桿菌快速培養、藥敏檢測系統，解決了 Bactec TB 460存在 的放射性污染問題，并保留了其快速的優點，使結核病細菌學檢查方法又有了進一步發展 [5]。Bactec MGIT960的自動化程度雖然更高、操作更為簡便，但價格昂貴[6]。與Bactec MGIT 960相似的還有BBL MGIT分枝桿菌快速手工培養、鑒定、藥敏檢測系統。該法所用培 養基同Bactec MGIT 960，只是培養和檢測需手工操作，結果判斷采用小型紫外檢測儀或普 通紫外燈檢測熒光強度，但其操作繁瑣，紫外線使用存在對人體傷害的風險[7]。上述幾種 分枝桿菌快速培養、藥敏檢測系統均設有內置定標管，每小時自動進行校正，嚴格保證檢測 質量。但是樣品的前處理、接種等操作不當，仍將影響檢測結果。因此，必須加強質量控制。 對于儀器判斷為陽性的樣品，仍須進行涂片、抗酸染色、顯微鏡下找到抗酸桿菌后方能判定 陽性。Welson發明的噬菌體裂解法檢測結核分枝桿菌具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便、 安全等優點，并且檢測出的是活菌分枝桿菌[8]。但是噬菌體裂解法為間接判斷法，由于培 養環境的不同，噬菌斑的大小受培養環境的影響，結果判讀不易標準化。液體變色培養基最 先由德國Heipha/Biotest公司研制，稱為MB Redox系統[9]。其檢測原理是液體變色培 養基中含有氧化還原顯示器，為一種無色四唑鐺(tetrazolium)鹽，當分枝桿菌在液體變 色培養基中生長時，通過氧化還原系統，使培養基中的無色四唑鐺鹽還原成粉紅色、紅色或 紫色臢。由于甲臢不溶于水，以顆粒形式分泌至細胞表面，這樣分枝桿菌菌落就變成了用肉 眼可以觀察到的紅或紫色，此時取培養液涂片，染色鏡檢。目前國內已有學者在此基礎上研 發出此類培養基[10]。此類方法多以甲臢為顯色劑，由于其水不溶性，而滯留于菌體表面， 易造成負反饋，不利于再增殖；另外也無菌種選擇性，特別是與分枝桿菌生長周期接近的菌 類。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，研制出液體變色培養系統結合判讀卡， 有操作簡便、快速、可用肉眼判斷結果、穩定性好、無需特殊儀器、便于推廣等優勢的培養 基。為結核病的防控提供一種簡單、快速、廉價的診斷方法。本發明是通過以下技術方案實現的本發明包括以下步驟
①使用背景清晰的臨床分離到的結核分枝桿菌，以快速培養系統培養基為基礎，添加顯色劑，從生長速度、標記物檢測、細胞形態三個方面觀察顯色劑對結核分枝桿菌的影 響；②使用背景清晰的臨床分離到的病原細菌，病原真菌，以快速培養系統培養基為 基礎，觀察顯色劑對這些菌株的影響；③配制快速變色液體培養基，A液組分的百分數KH2P04 7.6%，七水MgS04 1.6%，檸檬酸鎂3.0%，天冬酰胺12. 1%，瓊脂粉75. 7%;B液:bovinealbumin牛血清白蛋 白 8. 6%, dextrose 葡萄糖 12. 3%,catalase 過氧化氫酶 3. 7%,oleic acid 油酸 73. 8%, ATP 0. 1%，輔酶Al.2%，細胞色素丙0. l%，alfa-萘乙酸0. 2%;A液中鹽類完全溶解后加 入瓊脂混勻后110°C高壓20分鐘，自然降溫至45-50°C ；B液完全溶解后0. 22nm過濾，溫育 至40°C后迅速加入A液中，完全混勻后盡快分裝，制成斜面，以不添加顯色劑的非變色液體 培養基和羅氏培養基、Bactec TB 460,Bactec TB 960為對照，在每種培養系統下繪制菌株 隨時間變化的生長曲線圖；④在快速變色液體培養基上接種背景清晰的臨床分離到的結核分枝桿菌，測定顯 色程度和菌體數目的關系，制備比色卡；⑤以羅氏培養基上的比例法為對照，確定變色快速液體培養基中抗結核藥物的濃度。所述的病原細菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。所述的病原真菌為白色念珠菌、毛霉菌。所述的抗結核藥物為一線、二線抗結核藥物、菌型鑒定藥物。本發明與現有技術相比，具有操作簡單、易控制等特點，選用無細胞毒性但對結核 分枝桿菌有選擇性的顯色劑，培養基的顏色和菌體數量成量化關系，使用目視，可量化的比 色卡，可快速得出藥敏結果。這一培養基體系安全、無感染風險、可目視判讀藥敏結果。
圖1為本發明的流程示意圖；圖2為本發明的變色劑對結核分枝桿菌生長影響圖；圖3為本發明的變色劑對結核分枝桿菌生長影響圖；圖4為本發明的菌株在不同培養系統下隨時間生長變化5為本發明的變色快速液體培養基中抗結核藥物的濃度圖表指定圖1為摘要附 具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。本發明包括以下步驟使用背景清晰的臨床分離到的結核分枝桿菌，以快速培養系統培養基為基礎，添 加顯色劑，從生長速度、標記物檢測、細胞形態三個方面觀察顯色劑對結核分枝桿菌的影 響；(參見圖2)使用背景清晰的臨床分離到的病原細菌，病原真菌，以快速培養系統培養基為基礎，觀察顯色劑對這些菌株的影響；(參見圖3)配制快速變色液體培養基配方A液KH2P04，MgSO4,檸檬酸鎂，檸檬酸鐵銨，天冬酰胺，瓊脂粉B :bovine albumin ^ilif S S S dextrose ^^H, catalase ilfl^SBI, oleic acid油酸，ATP,輔酶A，細胞色素丙，alfa-萘乙酸
制作方法A液中鹽類完全溶解后加入瓊脂混勻后110°C高壓20分鐘，自然降溫至 45-500C ；B液完全溶解后0. 22nm過濾，溫育至40°C后迅速加入A液中，完全混勻后盡快分 裝，制成斜面。以不添加顯色劑的非變色液體培養基和羅氏培養基、Bactec TB 460, Bactec TB 960為對照，在每種培養系統下繪制菌株隨時間變化的生長曲線圖；(參見圖4)在快速變色液體培養基上接種背景清晰的臨床分離到的結核分枝桿菌，測定顯色 程度和菌體數目的關系，制備比色卡；以羅氏培養基上的比例法為對照，確定變色快速液體培養基中抗結核藥物的濃 度。(參見圖5)
權利要求
一種結核分枝桿菌快速變色藥敏培養基的制備方法，其特征在于步驟如下a.配制快速變色液體培養基，A液組分的百分數KH2PO4 7.6％，七水MgSO4 1.6％，檸檬酸鎂3.0％，天冬酰胺12.1％，瓊脂粉75.7％；B液bovinealbumin牛血清白蛋白8.6％，dextrose葡萄糖12.3％，catalase過氧化氫酶3.7％，oleic acid油酸73.8％，ATP 0.1％，輔酶A1.2％，細胞色素丙0.1％，alfa 萘乙酸0.2％；b.A液中鹽類完全溶解后加入瓊脂混勻后110℃高壓20分鐘，自然降溫至45 50℃；B液完全溶解后0.22nm過濾，溫育至40℃后迅速加入A液中，完全混勻后盡快分裝，制成斜面；c.以不添加顯色劑的非變色液體培養基和羅氏培養基、Bactec TB 460、Bactec TB 960為對照，在每種培養系統下繪制菌株隨時間變化的生長曲線圖；d.在快速變色液體培養基上接種背景清晰的臨床分離到的結核分枝桿菌，測定顯色程度和菌體數目的關系，制備比色卡；e.以羅氏培養基上的比例法為對照，確定變色快速液體培養基中抗結核藥物的濃度。
全文摘要
本發明涉及結核病的防控技術領域，具體涉及一種結核分枝桿菌快速變色藥敏培養基的制備方法，其特征在于在快速培養基體系下，進行變色快速藥敏培養基的研發，選用無細胞毒性但對結核分枝桿菌有選擇性的顯色劑，培養基的顏色和菌體數量成量化關系，使用目視，可量化的比色卡，可快速得出藥敏結果。這一培養基體系安全、無感染風險、可目視判讀藥敏結果。
文檔編號C12Q1/04GK101935685SQ20101028716
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月20日 優先權日2010年9月20日
發明者劉軍, 孫慶文, 孫戰強, 張舒林, 王洪海 申請人:上海成海生物科技有限公司